脊髓损伤后运动功能恢复中粒细胞集落刺激因子的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：近期有文献报道了粒细胞集落刺激因子在脑梗死模型及急性脊髓损伤模型中的神经保护作用，但应用的动物模型均非击打模型，与人体脊髓损伤的病理生理过程存在一定差距。
目的：观察粒细胞集落刺激因子对Allen’s脊髓损伤大鼠模型运动功能恢复的影响。
方法：使用改良Allen’s法制作T10节段Wistar大鼠脊髓损伤撞击模型，随机分为2组，粒细胞集落刺激因子组应用粒细胞集落刺激因子治疗，vehicle组注射等剂量PBS。于造模后第1，7，14，21，28，35天分别应用BBB运动功能评分法和Rivlin斜板实验评估大鼠运动功能，造模后第7，14，21，28，35天使用网格步行实验评估大鼠四肢肌力。
结果与结论：所有大鼠造模后均出现后肢瘫痪症状。造模后第7，14，21，28，35天粒细胞集落刺激因子组BBB运动功能评分及Rivlin斜板实验评分高于vehicle组(P < 0.05-0.01)，造模后第14，21，28，35天粒细胞集落刺激因子组网格行走实验错误数低于vehicle组(P < 0.05-0.01)，结果显示，粒细胞集落刺激因子治疗后大鼠运动功能及四肢肌力恢复情况均优于vehicle组。提示粒细胞集落刺激因子疗法对脊髓损伤起到了积极的治疗效果。

关键词: 干细胞, 干细胞因子及调控因子, 骨髓干细胞, 粒细胞集落刺激因子, 脊髓损伤, Allen’s法, 运动功能, 四肢肌力, BBB评分, Rivlin斜板实验, 网格步行实验, 动物模型　

Abstract:

BACKGROUND: Recently, a neuroprotective effect of granulocyte colony-stimulating factor was reported in a model of cerebral infarction and a model of acute spinal cord injury. However, the applied animal model was not established by impact method, different from pathophysiological process of human.
OBJECTIVE: To observe effects of granulocyte colony-stimulating factor on motor function in a rat model of spinal cord injury induced by Allen’s method.
METHODS: Wistar rats were used to establish spinal cord injury at T10 level using modified Allen’s method. They were randomly assigned to two groups, granulocyte colony-stimulating factor group, treated with granulocyte colony-stimulating factor, and vehicle group, treated with equal volume of PBS. The motor function was evaluated with Basso-Beattie-Bresnahan score and modified Rivlin loxotic plate test monitored at 1, 7, 14, 21, 28 and 35 days, and four-limb muscle strength was assessed using Grid walk test at 7, 14, 21, 28 and 35 days post-operatively.
RESULTS AND CONCLUSION: Hind limbs paralysis occurred in all animals postoperatively. Scores of Basso-Beattie-Bresnahan and modified Rivlin loxotic plate test were greater in granulocyte colony-stimulating factor group compared with vehicle group at 7, 14, 21, 28 and 35 days (P < 0.05-0.01); mean Grid walk test errors were less in granulocyte colony-stimulating factor group compared with vehicle group at 14, 21, 28 and 35 days (P < 0.05-0.01). Results indicate that motor function and four-limb muscle strength were improved following granulocyte colony-stimulating factor therapy compared with vehicle group, indicating that granulocyte
colony-stimulating factor has a positive effect on spinal cord injury.

Key words: stem cells, spinal cord injuries, granulocyte colony-stimulating factor, muscle strength, models, animal

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 2组大鼠中共有7只在观察结束前死亡，粒细胞集落刺激因子组3只(存活率87%)，vehicle组4只(存活率83%)。动物死亡原因：术后不进食致死3只，手术切口处感染致死3只，另有1只死于自噬后肢所致的全身性感染。

其余39只大鼠造模后均出现后肢瘫痪症状，且存活至实验结束，且粒细胞集落刺激因子组和vehicle组的所有数据均可使用。

对所有动物的数据进行预先指定结果分析(粒细胞集落刺激因子组：n=23；vehicle组：n=23)，并使用末次观察值结转对缺失数据进行替换。实验结束之前死亡的动物数据被排除，且移除所有估算值后进行二次数据分析，分析结果并没有改变。

2.2 BBB运动功能评分见表1。

该BBB评分法对后肢运动能力的评分最小值为0分(没有运动)，最大值为21分(正常运动)^[21^，^27]。9分及以上表明后肢力量达到可以支撑体质量阶段。

造模后第1天粒细胞集落刺激因子组与vehicle组BBB运动功能评分比较差异无显著性意义(P > 0.05)，造模后第7，14，21，28，35天2组评分差异均有显著性意义(7 d：P < 0.05；14 d后：P < 0.01)，且粒细胞集落刺激因子治疗后对动物运动功能的恢复呈现积极的影响，见图1。

2.3 网格步行实验结果见表2。

网格步行实验要求动物具有较好的运动能力，如大鼠的错误数小于16个则证明损伤已经得到了很好的恢复。整个实验中发现粒细胞集落刺激因子治疗法对动物运动能力的积极影响在2组动物中差异有显著性意义(14 d：P < 0.05；21，28，35 d：P < 0.01)，见图2。

2.4 Rivlin斜板实验结果 在Rivlin斜板实验中，粒细胞集落刺激因子组也显示出了较明显的对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的作用，除第1天2组数据差异无显著性意义外(P > 0.05)，其余各时间点2组数据对比差异均有非常显著性意义(P < 0.01)，见表3及图3。

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引言

脊髓损伤是指由于外界直接或间接因素导致脊髓损伤，在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍，肌张力异常及病理反射等的相应改变。急性脊髓损伤分原发性和继发性损伤2个病理阶段^[1-2] 。原发性损伤是由直接的机械损伤造成的病灶组织损伤，主要由交通事故、体育运动、高空坠落等直接或间接暴力因素造成。这种物理损伤引起了脊髓的病理生理反应从而触发了脊髓损伤的第2阶段即继发性损伤。最初的机械损伤使得神经细胞和神经胶质细胞在继发性损伤阶段开始凋亡。此外，离损伤部位较远的少突胶质细胞也开始凋亡。细胞死亡出现在损伤后1周并且直接导致髓鞘脱失^[3] 。一些活体内研究已经证明残存的运动功能与剩余的白质数量有关^[4-5] 。因此，在细胞凋亡过程中阻止少突胶质细胞的死亡可以减少髓鞘脱失并改善运动功能的恢复。血管改变、自由基和游离脂肪酸浓度增加、轴索离子结构损伤、兴奋性毒性以及免疫炎性反应等因素都可以使继发性损伤过程加剧^[6-7] 。
目前，用于治疗脊髓损伤的方法除了外科手术减压、固定及手术后的康复训练外，可供选择的药物治疗手段非常有限。鉴于脊髓损伤后手术治疗效果不佳，患者损伤平面以下出现的各种运动、感觉障碍而给患者在日常活动中带来的极大障碍，故在临床治疗中急待寻找一种可以部分恢复运动功能的治疗手段，从而提高患者的日常生活质量。临床上用于治疗脊髓损伤继发性损伤过程公认的做法是大剂量甲基强的松龙冲击疗法^[8] 。但是，近年来因大剂量使用甲基强的松龙对神经损伤的治疗收效甚微且会产生的严重的不良反应，这种疗法广受争议^[9] 。因此，新的治疗药物治疗方法替代大剂量激素冲击疗法的研究已经成为目前研究的热点。
粒细胞集落刺激因子为相对分子质量19 600的糖蛋白，在诱导分化的小鼠单核粒细胞白血病细胞系中被证实为一种血清因子^[10] 。这种血清因子是众所周知的造血细胞因子，促进嗜中性粒细胞的存活、增殖和分化^[10-11] 。粒细胞集落刺激因子用于临床中治疗白细胞减少的患者，并应用于细胞移植中分离并收集造血祖细胞^[11] 。在中枢神经系统中，粒细胞集落刺激因子具有多效性。近年来，已经在啮齿动物脑卒中模型中证明粒细胞集落刺激因子的有效性^[12-15] 。此外，脑卒中的临床试验中报告了其安全性和可行性^[16] 。在脊髓损伤中，有研究表明粒细胞集落刺激因子在小鼠和大鼠脊髓损伤模型中可改善运动功能的恢复^[17-18] 。
实验拟通过建立大鼠脊髓损伤模型，应用粒细胞集落刺激因子治疗后观察不同时间点大鼠后肢运动功能恢复情况，从而探讨粒细胞集落刺激因子改善脊髓损伤后损伤部位以下运动功能，以及将其应用于临床中治疗脊髓损伤的可能性。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年8至10月在兰州大学第一医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：清洁级健康Wistar大鼠50只，雌雄不限，体质量300-320 g，由甘肃中医学院动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(甘)2011-0001。使用随机抽签法选取4只大鼠，仅做椎板切除术，目的是在制备脊髓损伤模型过程中与制作模型相比较，来确保脊髓损伤模型中出现的后肢瘫痪现象不是由于椎板切除术本身所造成的；其余46只大鼠做椎板切除后制作脊髓损伤模型，并用随机抽签法分为vehicle组和粒细胞集落刺激因子组(n=23)。

方法：

制作Allen’s法脊髓损伤模型：实验开始1周前，将动物饲养于正常明暗周期环境下，进行环境适应。实验期间采取恰当的饲养以使动物获得足够的食物和水。取粒细胞集落刺激因子组和vehicle组大鼠，用10%水合氯醛(350 mg/kg)以腹腔注射方式进行麻醉，麻醉后俯卧位固定大鼠，备皮、消毒后，以T₉_-₁₀节段为中心切开皮肤暴露椎板，做椎板切除术，暴露T₉_-₁₀节段脊髓，采用改良的Allen’s打击法制作T₁₀节段脊髓损伤模型^[19]。制作脊髓损伤模型成功标准^[20]：Allen’s装置钢球撞击脊髓后，被击打硬脊膜局部迅速淤血，大鼠躯体立即开始颤抖，双后肢回缩样运动，尾巴痉挛性来回摆动，并伴有双后肢迟缓性瘫痪。术后应用青霉素肌肉注射(4×10⁴ U/次、2次/d)，连续应用3 d，防止术后感染。在术后的实验过程中，将盐酸曲马多[15 mg/(kg•d)]添加于大鼠饮用水中，以缓解疼痛。术后初期，大鼠暂时出现尿潴留，给予人工辅助排尿(2次/d)，直至大鼠开始自主排尿。

治疗方法：脊髓损伤模型制作完成后，立即通过颈静脉对粒细胞集落刺激因子组大鼠一次性快速推注60 μg粒细胞集落刺激因子，并对vehicle组推注相同剂量的PBS。之后每天对粒细胞集落刺激因子组及vehicle组大鼠皮下注射粒细胞集落刺激因子及赋形剂，30 μg/kg，连续应用14 d。

主要观察指标：脊髓损伤模型制作完成后，连续5周以下列3种方式监测、评估2组大鼠的运动行为恢复情况。

BBB运动功能评分：大鼠总体的运动功能表现采用改良BBB运动评分标准进行评估^[21-22]。即制作一长1.2 m、宽10 cm的跑道，将2组大鼠分别置于跑道上，让其由一侧向另一侧穿过跑道，在此期间观察大鼠的后肢运动能力，对后肢运动从0分(没有观察到后肢运动)到21分(正常运动)进行评分。每次观察期间，每只大鼠必须穿越跑道3次。在实验开始之前，对大鼠都先进行1次后肢运动功能评分，所有大鼠BBB运动功能评分均大于20分。在脊髓损伤造模后次日及之后的每周均进行1次BBB评分。

网格步行实验(Grid walk test)：采用测试大鼠穿过1.2 m长、且每隔0.5-2.0 cm不规则安置金属横杆的跑道的能力来评估运动能力的损伤^[23-24]。选取一个10根横杆跨度的区域进行分析。为防止动物适应固定的横杆间隔，每次测试需改变横杆间距。采用计算每20步(每个后肢10步)中错误的后肢位置数目(后肢未置于横杆上的数目)来对动物表现评分。若动物不能使用后肢来支撑体质量，则每个横杆处的错误数为2，总计错误数20。后爪不能精确地放于圆柱上也算作错误数。任何后爪的位置错误及横杆上的滑动都算作错误数。后肢的痉挛运动不计入正确数。

动物必须表现出良好的运动感官能力及支撑能力才能在此项测试中更少地出错。正常大鼠通常不犯或只犯很少的错误。脊髓损伤造模之后连续5周，每周进行1次网格步行实验。

Rivlin斜板实验：Rivlin斜板实验总体评估四肢肌力^[25-26]。斜板表面垫以6 mm厚的橡胶垫，按大鼠躯体轴线与斜板纵轴垂直的方向放置大鼠，逐渐增加斜板与水平面间的角度，直至大鼠刚好可在板上停留5 s，记录这一角度。每只大鼠测3次，取平均值。脊髓损伤造模之后连续5周，每周进行1次Rivlin斜板实验。

统计学分析：所有实验均在完全随机的方式下进行，且实验数据分析相互独立。使用JMP V7.0(SAS公司)统计学软件进行统计学分析，数据分析尽可能采取临床试验标准，并依照全分析集(FAS)定义，记录所有接受治疗动物的数据，且保证至少有1个行为数据点可进行分析。若动物在观察阶段死亡，则将最后1次观察分数进行末次观察值结转，并在排除遗漏值后进行二次分析。

数据比较采用单因素方差分析及t 检验。数据均以 x(_)表示，P < 0.05认为差异有显著性意义。±s

讨论

目前认为粒细胞集落刺激因子的神经修复作用机制有以下几点：①引起少突胶质细胞前体增殖^[28-29] 。②通过激活保护途径(Akt, ERK, stat3-Bcl-2-Bcl-Xl)进而阻止凋亡细胞的死亡^[30-32] 。③抑制兴奋性毒性^[33] 。④对干细胞起支持作用[34-35]。⑤影响神经元的可塑性和脊髓束的连接性^[30] 。⑥促进神经细胞恢复^[36-37] 。⑦促进神经细胞轴突再生^[38-39] 。粒细胞集落刺激因子的多种功能为本研究提供了理论依据。
本文使用了目前最主要的脊髓损伤行为学评估实验。在大鼠的脊髓击打模型中清楚地显示了粒细胞集落刺激因子疗法对BBB评分、网格步行测试和Rivlin斜板测试均有积极的影响。
作者这次实验首次证明了粒细胞集落刺激因子对使用Allen’s打击法制作的大鼠脊髓挫伤模型治疗后对重要的网格步行及Rivlin斜板两项脊髓损伤功能学评估实验有积极的影响。使用Allen’s打击法制作的脊髓损伤模型目前被认为是一种较好的损伤模型，并在系统对比中与人类脊髓损伤的病理生理学特点极为相似^[40] ，此模型中引起的运动功能损伤也比部分横断脊髓引起的损伤更为严重，且神经恢复数量也更少^[30] 。
由于缺乏粒细胞集落刺激因子治疗人体脊髓损伤的成功病例，判断动物模型中此疗法效果的价值始终较难。尽管网格步行实验具有高连续性线性比例，但由于该法的评分标准存在较低的天花板效应(所有动物在脊髓损伤之后均以20个错误开始)，而且为了达到少于16个错误值，实验动物必须完全恢复，这样就限制了此实验的实际范围，所以网格步行实验的真实范围远比0-20的实际线性范围要小。但是，在粒细胞集落刺激因子组中，BBB运动功能评分相对提高了26.2%，Rivlin斜板实验评分相对提高了25.8%，这就表明将此疗法用于人体具有切实的可能性。
许多研究都进行过对脊髓损伤合并缺血模型单独使用粒细胞集落刺激因子或联合应用一些细胞移植疗法的实验^[28，30-35] 。所有研究都以小鼠或大鼠为研究对象，其中有2组使用脊髓压迫模型^{[32, 35]} ，2组使用脊髓横断模型^[30，34] ，1组使用静力挫伤模型^[28] ，2组使用局部缺血模型^[31，33] 。治疗的持续时间从1-24 d不等，给药途径有皮下、髓鞘内及静脉注射，药物使用剂量从30-300 μg/kg不等，其中1组使用不根据体质量调节均使用10 μg髓鞘内注射的给药方式。所有研究均报道了功能性恢复的结果，并且有5篇文章报道了BBB运动功能评分结果，2组研究采用干细胞移植联合治疗(神经干细胞或骨髓间充质干细胞[^34-35] )，1组加用了血清干细胞因子^[28]，其他4组仅单独使用粒细胞集落刺激因子治疗^[30-33] 。Urdzikova等^[35]除了对对照组应用粒细胞集落刺激因子外还加用了骨髓间充质干细胞。
以上所有有关粒细胞集落刺激因子治疗脊髓损伤的研究均报道了粒细胞集落刺激因子对脊髓损伤的治疗作用及对损伤后运动功能恢复有积极效果。但以上所有动物模型均非击打模型，与人体脊髓损伤的病理生理过程存在一定差距，本实验使用了脊髓击打模型，同样证明了粒细胞集落刺激因子对脊髓损伤后运动功能恢复有积极作用，这说明在不同物种、不同脊髓损伤模型中粒细胞集落刺激因子疗法对脊髓损伤均起到了积极的治疗效果。
以上所有脊髓损伤研究均报告了通过粒细胞集落刺激因子治疗后可改进功能性恢复。本文也通过实验证明了在用Allen’s法制作的大鼠脊髓损伤模型中应用粒细胞集落刺激因子后，动物的功能性恢复得到了改进，而这种模型通常被认为是与创伤性脊髓损伤最为相似的模型。有文献报道此疗法在各种脊髓损伤模型中对功能性恢复的改进情况。这次实验的数据也形成了可靠的证据，证明粒细胞集落刺激因子法在大鼠击打损伤脊髓损伤模型中具有较好的疗效。
在临床应用中，粒细胞集落刺激因子的安全性和有效性得到了很好的证实。在脑卒中病例中，粒细胞集落刺激因子达到了STAIR(Stroke Therapy Academic Industry Roundtable)提出的临床药物开发标准。这些标准包括以下内容：①血脑屏障渗透力。②在不同脑卒中模型(包括被独立讨论团队证实的永久缺血模型)中的神经保护功能。③在不同物种中的神经保护功能。④已知的药代动力学。⑤有效的实验数据。就此而言，粒细胞集落刺激因子可以成为治疗急性脊髓损伤的临床候选药物。而且更重要的是其用药的时间窗。在大鼠血栓形成致脑卒中模型中，在诱导缺血10 d后应用粒细胞集落刺激因子72 h，动物运动功能恢复仍可得到改善^[41] 。粒细胞集落刺激因子可能对延迟时间更长的脊髓损伤也有效。但明确粒细胞集落刺激因子治疗脊髓损伤的最佳剂量、治疗时间窗以及明确的作用机制都须要做更多的研究。
在此得出结论，粒细胞集落刺激因子是能够在临床中应用于急性脊髓损伤患者的候选药物。虽然粒细胞集落刺激因子治疗脊髓损伤已经有充足的动物实验证据，但目前尚缺乏成功的人体治疗报道，今后或可将该药物进行治疗脊髓损伤的临床应用研究。