柚皮甙诱导骨髓间充质干细胞修复兔股骨头坏死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：自体骨髓间充质干细胞体外诱导培养后的多方向分化潜能，体内植入能否修复股骨头坏死成为临床骨科的一个研究热点。
目的：柚皮甙诱导的骨髓间充质干细胞修复兔股骨头坏死头的作用。
方法：柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，用自制同种异体松质骨载体负载，制备兔股骨头坏死模型，造模后第3周将12只成年新西兰大白兔随机数字表法分为2组，实验组左侧置入空白载体，对照组左侧不植入任何物品；两组右侧均置入复合有诱导后骨髓间充质干细胞的载体。
结果与结论：植入后8周植入物表面有大量骨痂形成，与骨端连接紧密，少部形成连续性骨桥。12周部分充填区广布相对较成熟的骨小梁，但较正常骨小梁粗、排列不够规则，可见缺损区完全被新骨代替，提示柚皮甙诱导的骨髓间充质干细胞可修复兔股骨头坏死。

关键词: 柚皮甙, 骨髓间充质干细胞, 股骨头, 坏死, 植入, 组织构建, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Autologous bone marrow mesenchymal stem cells exhibit multipotential differentiation after in vitro culture. There is increasing concern that whether transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells can be used for repair of femoral head necrosis.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism by which naringin induces bone marrow mesenchymal stem cells to repair femoral head necrosis in rabbits.
METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were induced with naringin to differentiate into osteoblasts and then loaded onto cancellous bone allograft. Femoral head necrosis rabbit models were prepared. At 3 weeks after femoral head necrosis induction, 12 adult New Zealand rabbits were randomly divided into two groups. In the experimental group, blank cancellous bone allograft was implanted into the left femoral head necrosis region. Identically, nothing was implanted into the left femoral head necrosis region in the control group. The right femoral head necrosis region in each group was implanted with cancellous bone allograft loaded by naringin induced bone marrow mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUTION: At 8 weeks after implantation, a large amount of callus formed on the surface of the allograft and connected tightly with bone ends, and continuous “bone bridge” formed in some parts. At 12 weeks, relatively mature bone trabeculae were observed in the filling area, which were thicker, and arranged more irregularly compared with normal bone trabeculae. Bone defect region was completely covered by the newly formed bone. These findings suggest that naringin-induced bone marrow mesenchymal stem cells can be used for repair of femoral head necrosis in rabbits.

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 动物基本状况动物麻醉苏醒后，即可自由活动，饮食正常。所有动物全部成活，皮毛光滑。3只对照侧术后髋关节脱位，为病灶区较广，刮除坏死组织后发生应力性骨折而导致。

2.2 股骨头大体形态观察正常股骨头见图1a；植入后4周实验侧股骨头软骨有纤维组织隆起，关节软骨面毛糙，不透亮。植入后8周实验侧股骨头软骨较光滑，红白相间，但不透亮，见图1b。植入后12周实验侧股骨头软骨较光滑，红白相间，透亮，形态正常，但较正常股骨头灰暗，见图1c。

a: Normal femoral head; b: At 8 wk after implantation, articular cartilage is smooth, but nontransparent, and no cartilage falls off; c: At 12 wk after implantation, articular cartilage is smooth and transparent, in white and red colors, but was still a little gloomy than normal femoral head Figure 1 Gross morphology of the femoral head in each group

图1 各组兔股骨头大体形态观察

2.3 X射线影像学观察植入后第4周实验组(右侧)病灶区内模糊，与周围组织界限清楚，对照侧见明显的骨缺损，见图2a。植入后第8周X射线观察实验组(右侧)病灶区内出现散在的密度增高影，较周围组织稍低，对照侧骨缺损区内模糊，与周围组织界限清楚，依然可见缺损轮廓，见图2b。植入后第12周X射线观察实验组(右侧)病灶区内密度增高影，较周围组织稍高，对照侧骨缺损区内有点状骨密度增高影，缺损轮廓依然可见，见图2c。

Figure 2 Femoral head necrosis in the experimental group (right side) and control side at different time points after allograft implantation as observed by X-ray examination

图2 载体植入不同时间X射线观察实验组(右侧)及对照侧股骨头坏死情况

2.4 病理学观察实验侧(骨髓间充质干细胞复合松质骨载体)4周，充填区周围有肉芽组织形成，间充质细胞大量增生，新生组织开始呈网状长入填充物，周边有明显的成骨反应，有较多的新骨形成，纤维肉芽样组织向载体内长入，植入物表面有纤维骨痂形成，与骨端形成纤维性连接，界限不明显，见图3a；8周，周边新骨带明显增宽，成骨反应向中心部推进，植入物表面有大量骨痂形成，与骨端连接紧密，少部分标本形成连续性骨桥，见图3b。12周，部分充填区为幼稚的骨小梁所占据，表面有较多的成骨细胞，部分充填区广布相对较成熟的骨小梁，但较正常骨小梁粗、排列不够规则，骨痂形成，可见植入物完全骨化，缺损区完全被新骨代替，见图3c。对照组(单纯载体植入)：4周，植入物体积无变化，纤维组织包裹植入物，其表面有骨样组织形成；8周，植入物两端有少量新骨形成，材料中部有纤维骨样组织；12周，植入物两端有新骨包绕，与骨端连接紧密，植入物部分被新骨代替，骨痂未包绕。对照组左侧，12周时缺损区仍无骨组织形成，仅为软组织充填。

Figure 3 Pathological changes of femoral head on the right side in the experimental group at different time points after allograft implantation (hematoxylin-eosin staining, ×200)

图3 载体植入不同时间实验组(右侧)股骨头病理变化(苏木精-伊红染色，×200)

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2009年6月至2010年12月在广西医科大学医学实验中心及104馆完成。

材料：6-8月龄健康新西兰大白兔12只，体质量2.3-2.5 kg；出生2 d的新生新西兰大白兔，体质量40-50 g，均由广西医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(桂)2009-0004。

培养液组成：①L-DMEM细胞培养液：含L-DMEM 87 mL，胎牛血清10 mL，100 U/mL青霉素1 mL，0.1 g/L链霉素1 mL，2 mmol/L L-谷氨酰胺1 mL，配成中浓度为含体积分数为10%胎牛血清，pH=7.5的细胞培养液。②柚皮甙成骨诱导液：含L-DMEM 87 mL，胎牛血清10 mL，100 U/mL青霉素1 mL，0.1 g/L链霉素1 mL，2 mmol/L L-谷氨酰胺1 mL，5 μg柚皮甙。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的体外培养与诱导：将新生兔脱颈处死后，无菌条件下取出骨髓制成单细胞悬液。以105/cm2的密度种入培养瓶内，置入37 ℃、体积分数为5%CO2，pH=7.5，20%饱和湿度的培养箱内培养。待原代培养有75%融合时可传代，按1∶2比例传代。将第3代生长稳定的细胞消化成单细胞悬液，以4.0×104/cm2浓度接种于预先置有盖玻片的6孔培养板内，制备爬片，每孔加入1.5 mL左右的培养液，48 h全量换液后加入柚皮甙成骨诱导液诱导分化。

坏死模型的制备：6-8月龄新西兰大白兔用3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)静脉注射麻醉后侧卧位固定于手术台上，碘伏消毒双下肢皮肤，沿髂前下棘下1 cm做1.5 cm的纵行切口，逐层切开皮肤、筋膜、肌肉组织，显露髋关节，切开关节囊，暴露股骨头。在股骨头下外侧用 1.5 mm钻头呈45°钻入0.5 cm。置入6.5 mg氯化锌颗粒，骨蜡封闭骨道。
载体复合物的构建：同种异体髂骨，经CO2超临界设备脱脂、20%过氧化氢脱蛋白后，修成2 mm× 2 mm×2 mm的骨颗粒，超声波清洗机反复冲洗，-80 ℃冷冻备用。应用时将载体放入消毒好的96孔板内，用紫外线照射30 min。然后加入0.5 mL血清，置入37 ℃，5%CO2，20%饱和湿度，pH=7.5的培养箱内，浸泡载体12 h后将生长良好第3代柚皮甙诱导后的骨髓间充质干细胞进行消化、离心。以1×108 L-1的浓度种入载体，将其置入37 ℃，5%CO2，20%饱和湿度，pH=7.5的培养箱内培养。

载体复合物的植入：造模后第3周将12只大白兔随机数字表法分为2组，术区常规消毒，按原切口进入，找到骨隧道用自制刮匙刮除坏死组织，用生理盐水冲洗骨隧道，两组右侧均置入复合有诱导后骨髓间充质干细胞的载体。实验组左侧置入空白载体，对照组左侧不植入任何物品。依次缝合切口，正常饲养。术后注射青霉素40×104 U，连续注射3 d，1次/d。

指标检测：①植入后第4，8，12周摄X射线平片，观察股骨头密度改变，了解股骨头坏死情况。②摄X射线平片后处死，取出股骨头用体积分数10%甲醛溶液固定标本48-72 h，硝酸溶液脱钙，修整标本，将股骨头沿冠状面切开(即与钻孔方向平行)逐级乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚约5 μm，苏木精-伊红染色，显微镜下行组织学观察。

讨论

在坏死的股骨头内，死骨难以承受作用在股骨头上的应力，最终发生骨折，导致股骨头塌陷。股骨头坏死的治疗就是要在股骨头内再生能够支撑关节软骨及软骨下骨，有力学功能的骨小梁。希望能够通过植骨实现股骨头的自身修复，松质骨的骨传导性能差，但骨诱导性能强，易于实现爬行替代。

在骨髓间充质干细胞的体内成骨修复骨缺损过程中，骨髓间充质干细胞能否保持成骨分化潜能并在体内形成骨组织显得很重要，最近研究表明自体脱蛋白、脱钙松质骨表面粗糙、亲水性强，有利于细胞黏附、铺展和生长，复合成骨诱导的骨髓间充质干细胞可加快骨修复后的血管化进程^[10]。骨髓间充质干细胞的体外培养和成骨诱导时间过长，在一定程度上会损伤细胞在体内的分化和增殖能力^[11]。

组织工程化成骨过程与生理状态下的骨形成机制大致相同，它是成骨细胞一系列功能的成功表达。成骨细胞接种到多孔支架材料内，早期是通过孔隙与外界进行营养交换，后期宿主骨和周围组织的血管侵入组织工程骨的哈佛氏管内，为成骨细胞的活动提供营养，成骨细胞在支架材料的孔隙内增殖并表达成骨功能，分泌胶原和基质包埋细胞，形成软骨样组织充填支架材料的孔隙，在软骨的基础上再钙化形成骨组织。与此同时，破骨细胞活动，在其周围形成吸收腔隙，为进一步成骨提供空间，如此交替进行，逐渐由新生骨替代移植骨，植入材料修复骨缺损主要通过骨传导和骨诱导的方式来实现，组织工程骨在材料周围和内部均有新骨形成^[9^，^12]。而降解过程主要与破骨细胞、多核巨细胞的作用有关。局部新骨形成的同时，新骨周边的破骨细胞释放出溶酶体酶等成分，使植入的支架材料分解、崩裂，从外周血游移至局部的巨细胞协助吞噬清除残存碎片，从而使植入的支架材料被渐降解、吸收^[13]。

骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死是目前骨科研究的热点，有很好的应用前景，但是也存在很多问题，虽然没有人报道骨髓间充质干细胞移植治疗的负面影响，但体外长期培养的骨髓间充质干细胞移植到体内后是否会发生突变和导致肿瘤的可能是临床治疗中最令人担忧的问题；骨髓间充质干细胞治疗是一种有别于常规药物和手术治疗的新技术，其治疗的安全性、有效性、载体的选择等问题还需要深入研究和探索，需要有相应的技术规范和管理机制，保证这项治疗技术健康发展。尽管目前骨髓间充质干细胞在治疗股骨头缺血性坏死方面应用较少，但相信随着研究的深入，骨髓间充质干细胞的应用必将为广大股骨头坏死患者带来福音。

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