3D打印氧化石墨烯复合生物支架的制备及性能

doi:10.12307/2026.965

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (30): 7854-7860.doi: 10.12307/2026.965

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3D打印氧化石墨烯复合生物支架的制备及性能

徐海龙1，丁越1，张悦2，王佳宁1，张辉1

1辽宁省人民医院口腔科，辽宁省沈阳市 110000；2山东第一医科大学第二附属医院口腔科，山东省泰安市 271000

收稿日期:2026-06-23 修回日期:2026-07-07 出版日期:2026-10-28 发布日期:2026-09-11
通讯作者: 张辉，硕士，主任医师，辽宁省人民医院口腔科，辽宁省沈阳市 110000
作者简介:徐海龙，男，1980年生，辽宁省大连市人，汉族，主任医师，主要从事颌面部组织缺损及颌面部组织缺损修复治疗的研究。
基金资助:
辽宁省自然科学基金项目(2023JH2/101300115)，项目名称：3D打印氧化石墨烯复合生物支架修复颌骨缺损，项目负责人：张辉

Preparation and performance of 3D-printed graphene oxide composite bioscaffolds

Xu Hailong1, Ding Yue1, Zhang Yue2, Wang Jianing1, Zhang Hui1

1Department of Stomatology, The People’s Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110000, Liaoning Province, China; 2Department of Stomatology, The Second Affiliated Hospital of Shandong First Medical University, Taian 271000, Shandong Province, China

Received:2026-06-23 Revised:2026-07-07 Online:2026-10-28 Published:2026-09-11
Contact: Zhang Hui, MS, Chief Physician, Department of Stomatology, The People’s Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110000, Liaoning Province, China
About author:Xu Hailong, Chief Physician, Department of Stomatology, The People’s Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110000, Liaoning Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Liaoning Province, No. 2023JH2/101300115 (to ZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架：是一种以氧化石墨烯、壳聚糖、β-磷酸三钙为主要原料制成的新型3D生物打印再生支架，具有良好的机械性能、细胞相容性，可用于修复骨缺损。
挤出式3D打印技术：由活塞、螺旋或气动压力结构系统驱动，通过微喷头挤压高黏度生物墨水，并通过物理或化学交联方法沉积在建筑平台上，打印具有高精度的三维结构。挤出式3D打印技术不需要高温及光固化的参与，能够更好地保留聚合物的活性，但该技术是一种基于材料挤压的成型方法，因此，需要在每种材料的特定黏度范围内选择溶剂或前驱体溶液比例来控制墨水的可打印性。在打印过程中，可以通过调整材料的种类、复合材料的比例或打印参数来制造理想的支架。

背景：在颌面骨缺损修复中，3D生物打印技术可通过重建缺损部位的解剖结构，应用生物材料精确堆积出个性化植入物，使组织形态和功能得以恢复。
目的：构建3D打印氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架，分析该支架的理化、生物性能。
方法：分别配置壳聚糖/β-磷酸三钙生物墨水与氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙生物墨水，采用挤出式3D打印技术分别制备壳聚糖/β-磷酸三钙支架与氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架，检测两种支架的微观形貌、压缩性能与吸水率。采用Transwell小室将两种支架分别与小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1以非接触方式共培养，CCK-8法检测细胞增殖，活/死染色检测细胞活性。
结果与结论：扫描电镜下两组支架呈现规则的三维网格状结构，表面粗糙，表面与截面挤出的墨水直径相对均匀(200-500 μm)，支架内各孔径大小相似，孔径均在100-400 μm之间，符合人工骨支架对于孔径尺寸的要求。两组支架均有一定的抗压性，稳定塑性应变均超过8%，壳聚糖/β-磷酸三钙支架的极限抗压强度为54.76 MPa，氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的极限抗压强度为17.95 MPa，均可满足组织工程中对于骨组织缺损支架的要求。两组支架均可在6 h内达到溶胀平衡且没有产生形变，其中氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的吸水率明显高于壳聚糖/β-磷酸三钙支架。CCK-8检测显示氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的促MC3T3-E1细胞增殖作用强于壳聚糖/β-磷酸三钙支架，活/死染色显示两种支架上的MC3T3-E1细胞均展现良好的细胞活性。
https://orcid.org/0000-0001-5344-7090 (徐海龙)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 3D生物打印, 氧化石墨烯, 生物支架, 壳聚糖/β-磷酸三钙支架, 氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架, 生物性能

Abstract: BACKGROUND: In the repair of maxillofacial bone defects, 3D bioprinting technology enables the reconstruction of the anatomical structure of the defect site. By precisely depositing biomaterials, it facilitates the fabrication of personalized implants, thereby restoring tissue morphology and function.
OBJECTIVE: A 3D-printed graphene oxide/chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold was constructed, and its physicochemical and biological properties were analyzed.
METHODS: Chitosan/β-tricalcium phosphate and graphene oxide/chitosan/β-tricalcium phosphate bioinks were respectively formulated. Using extrusion-based 3D printing technology, chitosan/β-tricalcium phosphate and graphene oxide/chitosan/β-tricalcium phosphate scaffolds were fabricated. The microstructure, compressive properties, and water absorption rate of the two types of scaffolds were characterized. The scaffolds were then co-cultured with mouse embryonic osteoblast precursor cells (MC3T3-E1) in a noncontact manner using Transwell chambers. Cell proliferation was evaluated using the CCK-8 assay, and cell viability was assessed via live/dead staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Scanning electron microscopy revealed that both scaffolds exhibited a regular three-dimensional grid-like structure with rough surfaces. The diameters of the extruded filaments on the surface and in cross-section were relatively uniform, ranging from 200 to 500 μm. The pore sizes within the scaffolds were similar, all being within the range of 100–400 μm, meeting the requirements for artificial bone scaffolds in terms of pore dimensions. Both scaffolds demonstrated certain compressive resistance, with stable plastic strain exceeding 8%. The ultimate compressive strength of the chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold was 54.76 MPa, while that of the graphene oxide/chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold was 17.95 MPa. Both values meet the mechanical requirements for bone tissue engineering scaffolds. Both scaffolds reached swelling equilibrium within 6 hours without undergoing deformation. Notably, the water absorption rate of the graphene oxide/chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold was significantly higher than that of the chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold. The CCK-8 assay showed that the graphene oxide/chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold promoted MC3T3-E1 cell proliferation to a greater extent than the chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold. Live/dead staining demonstrated that MC3T3-E1 cells cultured on both scaffolds exhibited good cell viability.

Key words: 3D Bioprinting, graphene oxide, biological scaffold, chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold, graphene oxide/chitosan/β-tricalcium phosphate scaffold, biological properties

中图分类号:

徐海龙, 丁越, 张悦, 王佳宁, 张辉. 3D打印氧化石墨烯复合生物支架的制备及性能[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(30): 7854-7860.

Xu Hailong, Ding Yue, Zhang Yue, Wang Jianing, Zhang Hui. Preparation and performance of 3D-printed graphene oxide composite bioscaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(30): 7854-7860.

图/表（结果） 6

2.1 生物墨水流变性测定结果从黏度与剪切速率曲线中也可以观察到明显剪切变稀行为，特征是随着剪切速率的增加，生物墨水的黏度降低，如图3所示。因此，所有生物墨水都满足剪切变稀的条件，在打印过程中可以通过调整挤出压力和速度调整生物墨水的黏度和挤出后打印丝的形状保持度，证实两种生物墨水具有可打印性。
2.2 3D支架打印参数确定此次研究采用的是挤出式3D打印机通过层层堆叠的方式打印支架，选用喷嘴直径为610 μm，通过偏移量校正达到490 μm，通过流变参数校正确定打印头的温度及平台温度均为20 ℃，挤出压力为150 kPa，挤出速度为
10 mm/s。挤出式3D打印过程见图4。支架置于烘箱干燥后放于4 ℃冰箱备用。
2.3 支架微观形貌表征及外观形貌结构两种支架在扫描电镜下的表面及截面观察结果如图5所示。两组支架呈现规则的三维网格状结构，表面粗糙，表面与截面挤出的墨水直径相对均匀(200-500 μm)，支架内各孔径大小相似，孔径均在100-400 μm之间，符合人工骨支架对于孔径尺寸的要求。在高倍扫描电镜下可见β-磷酸三钙晶体。
使用体视显微镜一倍物镜6.3倍放大倍率观察支架，筛选出打印成功的支架用于后续生物学实验，观察及评估结果如图6所示。镜下可见合格的实验用氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架无凹陷、塌陷、变形等结构缺陷，氧化石墨烯颗粒均匀分布于支架结构中，支架表面无裂痕、毛刺等打印缺陷，设计结构符合预期建模的打印参数及设计，微观形貌良好，适用于体外实验测试组织工程支架性能。
2.4 支架压缩性能检测结果图7显示了两种支架压缩实验的应力-应变曲线。两组支架均有一定的抗压性，稳定塑性应变均超过8%，壳聚糖/β-磷酸三钙支架的极限抗压强度为54.76 MPa，氧化石墨烯的加入对支架强度有一定的影响，可能是由于界面结合力减弱，导致氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的极限抗压强度降低为17.95 MPa，但仍满足组织工程中对于骨组织缺损支架的要求。
2.5 支架吸水率检测结果两种支架吸水率检测结果见表1、图8所示。两组支架前6 h的吸水率明显增加，6 h后吸水率基本没有变化，提示该两组支架均可在6 h内达到溶胀平衡且没有产生形变。相同时间点下，氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的吸水率均明显高于壳聚糖/β-磷酸三钙支架(P < 0.05)，提示氧化石墨烯的加入可提高壳聚糖/β-磷酸三钙的吸水性。

2.6 支架细胞相容性检测结果
CCK-8实验：两种支架与MC3T3-E1细胞非接触共培养1，4，7 d的细胞增殖检测结果如图9A所示，两种支架均可促进

MC3T3-E1细胞增殖，并且培养第7天氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的促细胞增殖作用强于壳聚糖/β-磷酸三钙支架，表明两种支架对MC3T3-E1细胞的增殖无不良影响，具有良好的

细胞相容性。两种支架与MC3T3-E1细胞非接触共培养1，4，7 d的细胞存活率均> 100% (图9B)，根据ISO10993-5标准，两种支架均未表现出明显的细胞毒性，符合作为骨组织工程骨支架的基本要求。
活/死染色：两种支架与MC3T3-E1细胞非接触共培养1，4，7 d的细胞活性如图10所示。培养1，4，7 d，3组活细胞(绿色荧光)数量逐渐增多，表明MC3T3-E1细胞在两组支架上均增殖活跃；培养第1天，活细胞占据整个视野，但未见明显红色荧光死细胞，并且细胞清洗液中也未发现明显的死细胞，不存在过度细胞清洗，同时共培养细胞形态未发生改变，提示各组细胞具有良好的细胞活性；培养第4，7天，两支架组活细胞数量明显

多于对照组，并且氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架组培养第7天的活细胞数量明显多于壳聚糖/β-磷酸三钙支架组。

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引言

颌骨组织缺损修复一直是口腔颌面部领域一项极具挑战性的难题[1]，骨组织工程作为组织工程技术的分支，近年来正不断被应用于骨缺损领域的相关研究中[2]。支架材料作为骨组织工程中的3个重要因素之一，应该具有适合用于细胞附着的表面、可用于血管化的多孔结构和合适的机械支撑[3]，为细胞的增殖和分化提供空间和引导[4]，支架的理化性质、组成成分和微观形貌决定了植入物的最终结构、初期稳定性和最终效果[5-6]。
目前用于骨组织工程支架的材料大多为金属、聚合物和陶瓷等生物材料，其中聚合物支架由于具有良好的生物相容性、生物可降解性和机械稳定性被广泛应用。目前3D生物打印技术可精准定制复杂的支架几何形态和孔隙率，负载多种生物因子和营养成分后可以模拟出有利于细胞分化增殖的微环境[7-8]。
氧化石墨烯为石墨烯衍生物，是一种能够在水中分散的新型纳米材料，含有大量羟基、羧基和环氧官能团，能够通过范德华力、静电作用、氢键和π-π堆积等方式与生物活性分子或其他聚合物结合应用于生物医学[9]。含氧基团不但赋予了氧化石墨烯较好的亲水性，还能为成骨细胞提供黏附位点，吸附成骨相关因子以促进成骨细胞增殖和分化[10]。一些理论认为碳的排列方式模拟了骨细胞外基质微环境，可以引导细胞附着、更新和分化[11]。SARAVANAN等[12]与DIMESCU等[13]的研究证实，将低浓度氧化石墨烯添加至复合支架材料中可有效提高支架的机械性能并促进成骨相关蛋白表达。
由于单一支架材料存在各种不同的性能优点及缺陷，此次研究依靠β-磷酸三钙的良好机械性能与骨诱导能力，配合壳聚糖良好生物降解性与形状记忆性[14]，通过挤出式3D打印获得具有弹性的壳聚糖/β-磷酸三钙支架；在此基础上，利用氧化石墨烯的高比表面积和良好的生物学性能，构建了氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架，以提高支架的亲水性、细胞相容性与抗菌性[15]，构建用于颌骨缺损修复的新型骨组织工程复合支架。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备与理化性能表征，体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2023年3月至2026年2月在瑞士联邦材料科学与技术研究院及中国医科大学口腔实验室完成。
1.3 材料氧化石墨烯购自苏州碳丰石墨烯科技有限公司；壳聚糖购自美国Aladdin公司；β-磷酸三钙购自上海麦克林生化科技股份有限公司；小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1、无菌PBS购自武汉普诺赛生命科技有限公司；α-MEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；0.25%胰蛋白酶购自苏州新赛美生物科技有限公司；青霉素、链霉素购自美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自中国UELandy公司；细胞活性与细胞毒性检测试剂盒购自中国碧云天公司；3D打印机购自德国EnvisionTec公司；高速混合机购自德国speedmixer公司；高速离心机购自中国凯达公司；扫描电子显微镜购自德国Zeiss公司；XS105DualRange分析天平购自瑞士平梅特勒-托利多公司；MILLIPIRE Direct-Q 超纯水机购自法国Millipore公司；Instron 5982万能试验机购自美国Instron公司；Infinite M200自动酶标仪购自德国Tecan公司；荧光显微镜购自Nikon公司。
1.4 方法
1.4.1 配置生物墨水称取10 g的β-磷酸三钙粉末加入至10 mL壳聚糖乙酸溶液(5 mg/mL)中，使用高速混合机搅拌后得到墨水A，置于4 ℃密封保存。称取50 mg氧化石墨烯、10 g β-磷酸三钙粉末加入至10 mL壳聚糖乙酸溶液(5 mg/mL)中，使用高速混合机搅拌后得到墨水B，置于4 ℃密封保存。称取3.1 g的纤维素纳米晶体加入15 mL去离子水中，使用高速混合机搅拌后得到墨水C，置于4 ℃密封保存。称取3.1 g的纤维素纳米晶体加入10 mL去离子水中，使用高速混合机搅拌后得到墨水D，置于4 ℃密封保存。
将墨水A与墨水C混合，使用高速混合机搅拌混合后以3 500 r/min高速离心机消泡1 min，得到可用于打印的壳聚糖/β-磷酸三钙生物墨水。将墨水B与墨水D混合，使用高速混合机搅拌混合后以3 500 r/min高速离心机消泡1 min，得到可用于打印的氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙生物墨水。
1.4.2 生物墨水流变性测定使用MCR301流变仪对两组墨水进行流变性能评估。室温下将两种生物墨水分别放置于直径50 mm的平板上，在0-1 000 s-1范围内改变剪切速率，选取50个点，测定不同剪切速率线下的黏度变化，并绘制相应图线。
1.4.3 3D打印支架使用AutoteskFusion 360软件分别设计了直径10 mm与高2 mm的圆柱体、直径10 mm与高10 mm的圆柱体以及长10 mm与高2 mm的立方体3种三维支架模型，导入EnvisionTec 3D打印机中，根据不同的墨水设定打印头尺寸、偏移量、挤出压力和挤出速度等参数，直到使墨水能够均匀、连续、顺畅挤出，以控制打印层厚、填充间距和打印层数，制备出壳聚糖/β-磷酸三钙支架与氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架。图1为挤出式3D打印原理示意图。

1.4.4 支架微观形貌表征及外观形貌结构观察 3D打印边长10 mm、高2 mm的立方状两种支架测试样品(图2)，烘箱干燥后切割3 mm暴露截面，固定于载物台上，表面及截面喷金处理后，采用扫描电镜观察支架断层形貌。

用镊子将两种支架分别放置于体视显微镜下，旋转一周观察支架外观形貌及结构，评估支架制备是否成功并筛选可用支架，可接受标准为：支架无凹陷、塌陷等变形，氧化石墨烯颗粒分布均匀，支架表面无裂痕、毛刺等打印缺陷，结构符合预期打印参数及模型设计。
1.4.5 支架压缩性能检测使用打印规格为直径10 mm、高10 mm的圆柱状支架样品测量压缩性能。两种支架在PBS中平衡24 h后，使用万能材料试验机进行压缩测试(量程为100 N，压缩速度为1 mm/min)，绘制应力-应变曲线，检测支架抗压强度。
1.4.6 支架吸水率检测将两种支架干燥并称质量，得到干质量(记为m0)。将支架浸入2 mL无菌PBS中，置于37 ℃孵箱中浸泡，分别于1，3，6，24 h后去除支架表面水分，测量支架湿质量(m1)，计算支架吸水率。
吸水率(%)=(m1-m0)/ m0 × 100%
1.4.7 支架细胞相容性检测
(1) MC3T3-E1细胞培养：于-80 ℃冰箱中取出MC3T3-E1细胞，即刻放入37 ℃水浴锅中，摇晃冻存管融化其中液体，迅速于无菌超净台内转移细胞悬液至无菌离心管内，按体积比1∶1混合专用培养基(含体积分数15%胎牛血清和1%抗青霉素链霉素的α-MEM培养基)，室温下1 200 r/min离心3 min后弃上清，加入5 mL专用培养基重悬后转移至T25培养瓶中，摇匀，标记细胞名称代数及日期，在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。隔日吸弃旧培养基后使用无菌PBS润洗细胞1次，更换新鲜专用培养基。
倒置光学显微镜下观察细胞生长状态及密度，设置80%细胞密度为传代标准，无菌超净台内吸弃旧培养基后加入无菌PBS润洗1次，吸弃PBS后加入1 mL胰酶溶液消化细胞，倒置光学显微镜下观察细胞消化状态并拍打T25培养瓶四周，使细胞于显微镜下呈流沙样脱落，加入2 mL专用培养基终止消化，吹打收集细胞后转移细胞至无菌离心管内，室温下1 200 r/min离心3 min后弃上清液，加入专用培养基后吹打混匀，按1∶2比例传至新T25培养瓶中，每瓶补充专用培养基至5 mL，摇匀，标记细胞名称代数及日期，在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。取P3-P5代MC3T3-E1细胞用于后续实验。
(2)支架预处理：将两种干燥支架(直径10 mm、高2 mm的圆柱状)于无菌超净台内紫外光照消毒2 h，每隔1 h更换照射侧；然后将支架转移至24孔板内，使用无菌超纯水洗涤支架6 h，每隔1 h更换洗涤用无菌超纯水；吸弃孔内液体后加入体积分数75%乙醇溶液，于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内浸泡过夜消毒；次日取出预处理后的支架，吸弃孔内液体后于无菌超净台内紫外照射消毒1 h，每隔30 min更换照射侧，随后使用无菌PBS洗涤支架3次，每次15 min，放置于专用培养基中1 h后用于细胞共培养。
(3)支架/细胞共培养模型建立：在6孔板内，使用Transwell聚碳酸酯薄膜嵌套细胞小室(膜直径24 mm，膜孔径8 μm)构建支架/细胞非接触共培养模型。将MC3T3-E1细胞按照5×104/孔的密度接种于Transwell下室内，置于恒温细胞培养箱内过夜培养使细胞贴壁；次日吸弃下室内旧培养基后摆放Transwell上室，将两种支架分别放入上室，向上室与下室各加入2 mL新鲜专用培养基，转移至37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱内进行支架/细胞非接触共培养。
(4)支架细胞相容性检测
CCK-8法检测支架对MC3T3-E1细胞增殖能力的影响：采用非接触方式将两种支架与MC3T3-E1细胞共培养，同时设置对照组(单独培养细胞，无支架)与空白对照(无细胞、无支架，仅加入培养基)，每组设置3个复孔。培养第1，4，7天，移除Transwell上室后吸弃板内现有培养基，避光条件下加入1 mL CCK-8工作液(CCK-8原液与专用培养基体积比为1∶9)，在 37 ℃恒温细胞培养箱内避光孵育30 min，避光转移孔内液体至96孔板中，使用酶标仪在450 nm波长处测定每孔吸光度(A)值，计算细胞存活率。
细胞存活率=(A实验组-A空白对照)/(A对照组-A空白对照)×100%活/死染色检测支架对MC3T3-E1细胞活性的影响：采用非接触方式将两种支架与MC3T3-E1细胞共培养，同时设置对照组(单独培养细胞，无支架)，每组设置3个复孔。培养第1，4，7天，使用PBS温和洗涤细胞2次，确保除去培养基中含有的活性酯酶，按照细胞活性与细胞毒性检测试剂盒说明书进行染色，置于37 ℃孵育30 min，荧光显微镜下观察细胞活性。
1.5 主要观察指标两种支架的微观结构、压缩强度、吸水率与细胞相容性。
1.6 统计学分析采用 GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据处理分析，所有数据以x±s表示，采用单因素方差分析进行多组数据分析，当 P < 0.05时认为差异有显著性意义。该文统计学方法已经中国医科大学统计学专家审核。

讨论

口腔颌面骨组织缺损需要重建治疗的疾患正逐年增加，目前临床治疗方案中骨材料移植物及器官移植所引起的相关感染、骨吸收、炎症刺激等并发症仍亟待解决。骨组织的再生与重塑由成骨细胞引起的骨生成与破骨细胞的骨吸收以及细胞间的信息传递相互协调共同完成的[16]，因此具有良好应用前景的骨组织工程成为当前探究的热点。生物支架作为骨组织工程的重要因素之一应当具有以下特点[17]：①良好的组织相容性和表面活性；②可控降解性；③支架及降解产物的无毒性；④稳定的力学性能；⑤三维结构和高孔隙率。为了同时实现以上几种特性，需要合适的支架材料及相应的支架制备技术。
传统的复合支架制作技术如气体发泡法、静电纺丝法等无法精确控制孔隙率及孔径大小，更不能按照个体缺损的形状和大小以及术区组织的需求精确定制。不同于喷墨式和激光辅助打印，此次研究中选用的挤出式3D生物打印可以实现复杂结构打印、多材料打印和细胞负载。
为使打印支架具有精确的三维结构，必须保证墨水的打印流变要求。在墨水配方中，此次研究选用具有良好骨诱导性的β-磷酸三钙作为填充相，达到剪切变稀行为，添加壳聚糖作为黏结相提高墨水的黏度和形状保持度，使该复合材料具有可打印性，同时实现有机-无机的结合，这与其他采用此方法的研究在设计理念上相吻合[18-19]。氧化石墨烯可以与壳聚糖通过范德华相互作用和π-π堆积形成生物相容性化合物，并且氧化石墨烯能与磷酸钙相结合、吸附骨形态发生蛋白2等不同生长因子，保证β-磷酸三钙提供长期骨诱导作用[20]。在壳聚糖/β-磷酸三钙的基础上，通过添加氧化石墨烯制成氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架，以提高支架的理化及生物学功能。
在用于3D打印的复合生物墨水配置过程中，随着壳聚糖含量的增加，溶液中聚合物链的纠缠量增加，导致生物墨水的黏度增加。氧化石墨烯的浓度增加也会提高生物墨水的黏度，生物墨水黏度过高则无法顺利挤出，黏度过低则不能形成连续的丝状结构。随着β-磷酸三钙比例的增加，复合支架表现出更高的抗压强度、更低的溶胀率以及更好的骨诱导性，但同时会增加支架的脆性，这与其他学者的研究结果相一致[21]。低浓度的氧化石墨烯具有良好的生物相容性，而过高浓度的氧化石墨烯具有细胞毒性[22]。综合所有因素后，该研究最终确定了壳聚糖/β-磷酸三钙支架和氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的材料配比。
为检测生物墨水的可打印性并为后续设计打印机参数提供参考，此次研究进行了流变性能测试。在0.01-1 000 s-1剪切速率下两种生物墨水的黏度均随剪切速率的增大均匀降低，显示出非常利于打印的剪切变稀行为，这与其他学者构建的壳聚糖/磷酸钙墨水结果一致[23]，证实了该生物墨水具有可打印性。用于挤出式3D打印的生物墨水黏度可达到30 mPa/s-6×107 mPa/s[24-25]。打印平台的温度是打印过程中层层堆积是否能紧密黏结的关键，温度过高致支架形态难以维持，很快坍塌，温度过低致支架迅速固化，层与层之间难以黏结。选用打印喷嘴直径为610 μm，通过偏移量校正达到490 μm，此时材料可顺利通过尖端挤出，在玻璃床上形成3D结构。
为进一步探索研究支架的微观结构，通过扫描电镜观察两种支架微观形貌，可见两种支架表面粗糙，内部成规则的网状三维结构，挤出的墨水直径相对均匀(200-500 μm)，具有可控性，与设计一致，证实了此次研究生物墨水的优异性，也展现了3D打印的高度重复性和精确性。高倍扫描电镜下可见两种支架各孔径大小均匀，在100-400 μm之间，符合人工骨支架对于孔径尺寸的要求，这为细胞的黏附分化提供更大的表面积。两种支架相互连通的孔隙结构为细胞代谢提供营养与氧气支持，同时有利于细胞迁移和微血管形成，从而促进骨修复。支架粗糙的表面利于细胞定植，在扫描电镜(50 000×)下可见支架表面β-磷酸三钙晶体，证明了通过挤出式3D打印并没有破坏β-磷酸三钙的生物结构，仍保存较高的生物活性。
用于骨缺损修复的支架需要有一定机械强度，为缺损部位提供力学支撑。此次研究中压缩性能测试显示两组支架均有较好的抗压能力，支架内部孔隙相互连通，受力时能做到良好的分散作用，不会产生应力集中。氧化石墨烯较大的表面积将增加复合材料中的界面键合，增加从基体到纳米填料的应力传递。此次实验中氧化石墨烯的加入使支架的抗压强度下降，极限抗压强度下降至17.95 MPa，但仍能满足人松质骨的抗压强度要求(4-20 MPa)[26]，抗压强度的下降可能与氧化石墨烯的加入有关。有氧化石墨烯和壳聚糖联合制备的复合支架中，氧化石墨烯表面丰富的官能团与壳聚糖之间形氧化石墨烯/壳聚糖复合体，可改善单纯壳聚糖的拉伸强度和抗压强度，但机械性能的改善能力依赖于氧化石墨烯的浓度[27]，当添加至0.5%时可显著提高氧化石墨烯/壳聚糖支架的抗压能力[24]。此次研究中氧化石墨烯加入的浓度约为0.17%，可能是由于氧化石墨烯浓度过低导致分子界面结合力减弱，从而降低了复合支架的抗压强度[28]，后续还需要通过对氧化石墨烯还原性的控制改善强度。另一方面，加入的氧化石墨烯会降低复合支架的密度，因而使得相同体积支架的抗压强度下降；抑或是由于碳纳米颗粒数量增多，氧化石墨烯分散中产生的缺陷降低了支架强度[28]。在后续研究中可以适当提高氧化石墨烯浓度，探索不同浓度梯度氧化石墨烯在氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架中的力学性能的影响，以选出适用于骨组织修复的最佳配比。
支架植入初期需要依赖吸收周围组织液为细胞直接提供营养物质，因而支架吸水性可直接影响支架上细胞的存活。支架的吸水性测试可直观反映支架的吸水性与蛋白质吸附性，此次研究显示两组支架的吸水性均较好，这可能得益于壳聚糖分子链中具有亲水性的氨基[14]。加入氧化石墨烯后，氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架1-24 h各时间段的吸水性较壳聚糖/β-磷酸三钙支架明显增强(P ≤ 0.05)，氧化石墨烯表面丰富的含氧官能团可赋予支架良好的吸水性，同时氧化石墨烯与壳聚糖之间形成的氢键也能增强吸水性，6 h后两组支架均可达到溶胀平衡且形态未发生改变，可避免未来在临床应用中支架植于体内的初期因为吸收体液而出现坍塌和变形，影响骨修复进程。
骨组织支架除了在结构和力学表征上与人的骨组织相匹配外，还应具有较低的细胞毒性与良好的生物相容性，这是临床应用的前提。氧化石墨烯、壳聚糖、β-磷酸三钙本身均具有良好的生物相容性且已广泛应用于骨组织工程[29-31]。然而，氧化石墨烯具有浓度依赖性的细胞毒性，较高浓度的氧化石墨烯会降低细胞黏附，诱导细胞凋亡，并影响线粒体活性和细胞膜完整性[32]，同时氧化石墨烯的细胞毒性对细胞种类也具有依赖性，因此，对两组支架进行生物学检测是很有必要的。小鼠胚胎成骨细胞(MC3T3-E1细胞)可在体外不断增殖和分化成骨细胞，并表现出与骨组织相关的表型和分化特征，是研究骨分化与骨组织代谢的重要模型细胞之一。为测试氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架经3D打印制备工艺后是否仍保留原料中良好的生物相容性，该研究选用 MC3T3-E1细胞与支架共培养，通过CCK-8 测试支架对细胞增殖的影响，使用细胞活性与细胞毒性检测试剂盒对细胞活性检测，培养1，4，7 d显示两组支架均具有良好的细胞相容性，活/死染色后镜下见发散绿色荧光活细胞占据整个视野，但未见明显红色荧光死细胞，并且细胞清洗液中也未发现红色荧光死细胞，因此不存在细胞过度清洗，证实了共培养细胞良好的活性状态。培养 4，7 d后，两组支架对MC3T3-E1细胞均具有促增殖作用，表明壳聚糖/β-磷酸三钙支架和氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架在细胞水平上体现了良好的生物安全性，符合作为骨组织工程骨支架的基本要求。培养第7天，氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架促MC3T3-E1细胞明显强于壳聚糖/β-磷酸三钙支架，该结果与氧化石墨烯本身能在细胞-材料和细胞-细胞界面处介导并促进细胞在支架上的黏附、生长和分化有关[33]。
此次研究成功构建出具有可打印性的壳聚糖/β-磷酸三钙和氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙生物墨水，并可根据个性化的形状进行精确、快速打印，为实现精确订制颌骨缺损结构奠定基础。壳聚糖/β-磷酸三钙支架和氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架在微观结构、亲水性、力学表征及生物相容性方面展示了骨组织工程复合支架的良好性能，可以广泛应用于骨组织工程，特别是氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架在生物学方面表现更优异的性能。此次研究基于新材料和对应打印技术的开发，对壳聚糖/β-磷酸三钙和氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙生物墨水的打印性、微观结构和基本性能进行了探究。
研究不足之处：目前支架材料尚需优化完善相应的力学性能和孔结构，以达到实际作为骨组织工程支架的理化要求；在生物性能方面，只探索了氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架的基本细胞相容性，还需完善后续的体外和体内实验，确保临床使用的生物安全性及成骨性要求。此次研究提出的相应材料设计、结构设计和打印手段，只是针对初步探索的壳聚糖/β-磷酸三钙墨水和氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙墨水，结合挤出式3D生物打印技术能保存生物材料及细胞活性的特点，可探索将生物材料负载细胞后直接打印，获得具有均匀细胞分布的的生物复合支架，达到支架生物应用的目标。此次实验中氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙墨水浓度设定单一、无梯度变化，根据众学者提出的不同浓度氧化石墨烯对支架的抗压能力及生物毒性不同[22，27]，可进一步完善相关研究，选择出适合骨修复与骨再生的最佳浓度并进行成骨能力与机制研究，为在骨组织工程中应用3D生物打印技术提供更强的理论依据。
此次研究制作了氧化石墨烯/壳聚糖/β-磷酸三钙支架用于颌骨缺损修复，结果显示该支架具有适宜的力学性能、良好的吸水性与良好的细胞相容性，适合作为骨缺损修复植入物，为后期新型打印支架的优化做出基础性贡献。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

3D打印氧化石墨烯复合生物支架的制备及性能

Preparation and performance of 3D-printed graphene oxide composite bioscaffolds

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