胶原蛋白与纤维蛋白粘合剂修复兔关节软骨损伤的有效性

doi:10.12307/2026.417

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
关节软骨损伤修复：根据组织工程理论和方法，在损伤关节软骨部位植入活性生物支架材料，结合自体骨髓间充质干细胞实现损伤软骨组织的再生，完成对受损关节软骨的修复。
生物支架材料：取自于天然材料(如蛋白质类、多糖类)的组织工程支架，它们的重要特征是具有三维结构，为细胞的生长、代谢和基质产生提供结构支撑，促进细胞的黏附和生长，同时必须满足生物相容性、生物降解性、机械稳定性和孔隙结构等要求。

背景：关节软骨的主要成分为胶原蛋白，使用胶原蛋白作为支架材料，结合自体骨髓间充质干细胞原位修复成为治疗关节软骨损伤新的手段。
目的：评估胶原蛋白联合纤维蛋白粘合剂修复兔关节软骨损伤的有效性。
方法：取48只新西兰兔，在左后肢股骨内髁滑车面制作直径4.5 mm、深3 mm的全层软骨缺损，随机分4组干预：微骨折组(n=12)进行微骨折术，胶原蛋白组(n=12)进行微骨折术后将国产胶原蛋白注射至软骨缺损处，CartiRegen组(n=12)进行微骨折术后将进口胶原蛋白与纤维蛋白粘合剂混合物注射至软骨缺损处，实验组(n=12)进行微骨折术后将国产胶原蛋白与纤维蛋白粘合剂混合物注射至软骨缺损处。术后12，24周，进行膝关节MRI检查以及膝关节软骨修复组织苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O-固绿染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色与ICRS评分、Mankin评分，术后24周进行膝关节软骨修复组织压缩模量和硬度检测。
结果与结论：①MRI检查显示，术后24周，微骨折组软骨缺损基本填充完全，软骨修复组织与周围正常软骨组织的整合性较差；胶原蛋白组软骨缺损基本填充完全，与周围正常软骨组织基本完全整合，略有差异；CartiRegen组和实验组软骨缺损填充完全，与周围健康软骨组织的整合、平面等未见明显差异。②组织学染色显示，微骨折组软骨组织染色较浅且不均匀，软骨形态欠佳；胶原蛋白组软骨组织染色较均匀，软骨修复面平整，与周围正常软骨组织基本整合，但存在裂隙；CartiRegen组和实验组软骨组织染色均匀，表面光滑，组织致密，与周围组织整合良好，填充程度好。③CartiRegen组和实验组术后24周的软骨修复ICRS评分、Mankin评分低于微骨折组、胶原蛋白组(P < 0.05)，胶原蛋白组、CartiRegen组和实验组术后24周的软骨硬度大于微骨折组(P < 0.05)。④结果表明，胶原蛋白、纤维蛋白粘合剂联合微骨折术治疗软骨损伤具有良好的修复效果。
https://orcid.org/0009-0001-8362-7452 (严炎刘星)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 关节软骨修复, Ⅰ型胶原蛋白, 微骨折, 纤维蛋白粘合剂, 生物支架材料, 软骨损伤

Abstract: BACKGROUND: Articular cartilage is primarily composed of collagen. Using collagen as a scaffold material, combined with autologous bone marrow mesenchymal stem cells for in situ repair, has become a new method for treating articular cartilage damage.
OBJECTIVE: To evaluate the effectiveness of collagen combined with fibrin sealant in repairing articular cartilage defects in rabbits.
METHODS: Forty-eight New Zealand rabbits were used. Full-thickness cartilage defects of 4.5 mm in diameter and 3 mm in depth were created on the trochlear surface of the medial femoral condyle of the left hind limbs. The rabbits were randomly divided into four groups: microfracture group (n=12) underwent microfracture surgery. Collagen group (n=12) underwent microfracture surgery followed by injection of domestically produced collagen into the cartilage defect. CartiRegen group (n=12) underwent microfracture surgery followed by injection of a mixture of imported collagen and fibrin sealant into the cartilage defect. Experimental group (n=12) underwent microfracture surgery followed by injection of a mixture of domestically produced collagen and fibrin sealant into the cartilage defect. At 12 and 24 weeks post-surgery, knee joint MRI examinations were performed, and the knee joint cartilage repair tissue was subjected to hematoxylin-eosin, toluidine blue, safranin O-fast green staining, type II collagen immunohistochemical staining, ICRS scoring, and Mankin scoring. The compression modulus and hardness of the knee joint cartilage repair tissue were measured at 24 weeks post-surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) MRI examinations showed that at 24 weeks post-surgery, the cartilage defect in the microfracture group was almost completely filled, but the integration of the cartilage repair tissue with the surrounding normal cartilage tissue was poor. The cartilage defect in the collagen group was almost completely filled, and the integration with the surrounding normal cartilage tissue was almost complete, with slight differences. The cartilage defects in the CartiRegen group and the experimental group were completely filled, and there were no significant differences in integration and surface level compared with the surrounding healthy cartilage tissue. (2) Histological staining showed that the cartilage tissue in the microfracture group was lightly and unevenly stained, with poor cartilage morphology. The cartilage tissue in the collagen group was more evenly stained, with a smooth cartilage repair surface and good integration with the surrounding normal cartilage tissue, but with some fissures. The cartilage tissue in the CartiRegen group and the experimental group showed uniform staining, a smooth surface, dense tissue, good integration with the surrounding tissue, and good filling. (3) The ICRS score and Mankin score of cartilage repair at 24 weeks post-operation in the CartiRegen group and the experimental group were lower than those in the microfracture group and the collagen group (P < 0.05), and the cartilage hardness at 24 weeks post-operation in the collagen group, CartiRegen group, and experimental group was greater than that in the microfracture group (P < 0.05). (4) The results exhibit that the combination of collagen and fibrin sealant with microfracture surgery has a good repair effect on cartilage damage.

Key words: articular cartilage repair, type I collagen, microfracture, fibrin sealant, biomaterial scaffold, cartilage injury

中图分类号:

严炎刘星, 邓欣欣, 邹杰, 李鉴墨. 胶原蛋白与纤维蛋白粘合剂修复兔关节软骨损伤的有效性[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(32): 8335-8344.

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图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 48只新西兰白兔全部进入结果分析。
2.2 各组兔膝关节软骨大体外观评价结果术后12，24周，4组兔膝关节均未见明显感染迹象，无红肿、发炎等现象。术后12周，微骨折组软骨缺损区修复组织较多，亮白色组织与纤维样组织夹杂，表面有明显裂痕，修复组织表面低于周围正常软骨面；胶原蛋白组软骨缺损区修复组织与周围软骨面一致，修复组织表面粗糙，与周围组织整合欠佳；实验组软骨缺损修复平面与正常软骨面基本一致，表面欠平整，与周围组织整合基本一致；CartiRegen组软骨缺损区填充完全，修复平面与正常软骨面基本一致，修复组织表面略粗糙，与周围组织基本整合，见图2。
术后24周，微骨折组软骨缺损区已基本填充完全，与周围组织相比仍存在一定凹陷，与周围组织有部分整合，整体修复组织的颜色与周围正常组织存在一定差异；胶原蛋白组软骨缺损区修复组织与周围正常软骨面基本一致，修复组织表面较平整，与周围组织整合基本一致，修复组织与正常软骨组织颜色略有差异；实验组软骨缺损填充完全，修复效果明显，修复软骨平面、整合、颜色与周围正常软骨未见明显差异；CartiRegen组与实验组结果类似，软骨缺损区填充完全，修复软骨与周围正常软骨颜色、界面、整合几乎无差异，见图2。

2.3 各组兔膝关节软骨组织影像学检查结果图3显示术后12，24周各组兔膝关节软骨修复组织的MRI影像学结果。术后12周，微骨折组软骨缺损区内新生组织较多，但填充不完全，内部有高亮信号，与周围正常软骨整合欠佳，提示修复组织与正常软骨组织差异较大；胶原蛋白组软骨缺损区基本填充完全，但修复组织不完全均匀，呈现混杂的高亮信号，与周围正常软骨组织有部分整合；实验组软骨缺损区填充完全，基底部也变为灰白信号，关节面侧仍有混杂的高亮信号，与周围组织已经基本整合；CartiRegen组软骨缺损区域已经形成一层类软骨信号，基底部变为灰白色信号，缺损区靠近关节面部分仍有高亮信号，与周围正常软骨组织已经大部分整合。
术后24周，微骨折组软骨缺损区基本填充完全，与周边正常组织边界处的信号不一致，内部混杂有高信号，提示内部结构不均匀，与周围组织整合差；胶原蛋白组软骨缺损区填充完全，有少量灰白色信号，与周围正常软骨组织基本完全整合；实验组软骨缺损区填充完全，整个缺损区未见明显高亮信号，与周围软骨组织界限不明显；CartiRegen组软骨缺损区填充完全，信号均匀，未见明显高亮信号，与周围软骨组织整合边界信号均匀，提示内部结构均一、整合良好。

2.4 各组兔膝关节软骨组织形态观察结果图4显示各组兔膝关节软骨修复组织苏木精-伊红、甲苯胺蓝和番红O-固绿染色与Ⅱ型胶原免疫组化染色结果。
苏木精-伊红染色：术后12周，微骨折组软骨缺损区内修复组织较多，但距完全填充缺损深度仍有一定差距，修复组织呈现纤维样修复，排列杂乱，细胞量少，与周边正常软骨整合较差；胶原蛋白组软骨缺损区基本完全填充，细胞数量较多，但修复组织与周边正常软骨整合性依然欠佳，交界处仍有裂隙和不平整；实验组软骨缺损区修复组织填充明显，细胞数量多，修复组织和正常软骨交界区少见裂隙，融合性好，软骨面略微不平整；CartiRegen组软骨缺损区填充明显，细胞数量较多，交界处极少有裂隙，修复软骨面稍微不平整。术后24周，微骨折组软骨缺损区基本填充完全，填充组织表现为明显的纤维样修复组织，边缘毛糙且与周围组织整合不佳；胶原蛋白组软骨缺损区域填充完全，与周围组织整合存在一些裂隙，软骨修复面平整；实验组软骨缺损区填充完全，与周围组织连接区域未见裂隙，新生软骨层较正常软骨略薄，表面光滑平整；CartiRegen组软骨缺损部位填充完全，与周围组织整合良好，表面较光滑。
Ⅱ型胶原免疫组化染色：术后12周，微骨折组软骨缺损基底部有部分区域Ⅱ型胶原染色呈阳性，但染色较浅且不均匀，其他区域染色仍呈阴性；胶原蛋白组软骨缺损大部分区域与正常软骨相比染色接近，但表层染色较浅且软骨表面不太平整；实验组软骨缺损染色情况与正常软骨区域基本一致，但与周围组织连接处欠佳，软骨修复面略微不平整；CartiRegen组软骨缺损区染色情况与正常软骨染色趋于一致，部分表层区域染色不够深。术后24周，各组在软骨缺损部位均形成了明显Ⅱ型胶原蛋白层，其中微骨折组缺损修复区域基本填充纤维样组织，新生Ⅱ型胶原蛋白层型结构相比其他3组更松散，整体染色不均匀，与正常软骨分界明显；胶原蛋白组软骨缺损区域Ⅱ型胶原染色基本接近正常软骨，但表面不平整且连接处仍可见裂隙；实验组软骨缺损修复区域填充完整，Ⅱ型胶原染色接近正常软骨，表面平整，与周围组织连接完整；CartiRegen组填充程度好，组织致密，Ⅱ型胶原染色着色深，接近正常软骨。
甲苯胺蓝染色：术后12周，胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨缺损修复部位均显示大量蛋白多糖，而微骨折组中蛋白多糖较少。术后24周，微骨折组软骨缺损基底区染色，但表层区域染色较浅；胶原蛋白组软骨缺损区均有染色，但染色深度略有不均；实验组和CartiRegen组软骨缺损区染色均匀且表面光滑。
番红O-固绿染色：术后12周，胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨缺损修复部位有软骨组织生成，而微骨折组没有显示出软骨染色，整个修复部位呈现出骨组织的染色特征。术后24周，4组软骨缺损区均有不同程度修复，其中，微骨折组基底区染色，但表层区域染色较浅，只有少量红色，说明形成了少量软骨组织；胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组形成了明显的软骨组织层，与软骨下骨有明显的染色区别。

2.5 各组兔膝关节软骨修复组织评分结果图5显示术后12，24周各组兔膝关节软骨修复ICRS 评分结果。术后12周，微骨折组、胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨缺损修复区ICRS 评分分别为2.67±0.58，2.33±0.58，1.67±0.58，1.33±0.58，4组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。术后24周，微骨折组、胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨缺损修复区ICRS 评分分别为3.67±0.58，2.67±0.58，0.67±0.58，0.67±0.58，实验组与CartiRegen组软骨缺损修复区ICRS 评分低于微骨折组、胶原蛋白组(P < 0.001，P < 0.05)。结果表明，无论是国产胶原还是进口胶原，与纤维蛋白粘合剂混合后联合微骨折术治疗软骨损伤的效果都比单纯使用胶原蛋白材料结合微骨折术或者单纯使用微骨折术更好。
图6显示术后12，24周各组兔膝关节软骨修复Mankin评分结果。术后12周，微骨折组、胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨缺损修复区Mankin评分分别为10.33±1.53，7.67±1.15，5.33±1.53，4.67±1.15，实验组与CartiRegen组软骨缺损修复区Mankin评分低于微骨折组(P < 0.01)。术后24周，微骨折组、胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨缺损修复区Mankin评分分别为11.67±0.58，8.00±1.00，3.33±1.41，3.00±1.00，胶原蛋白组软骨缺损修复区Mankin评分低于微骨折组(P < 0.01)，实验组与CartiRegen组软骨缺损修复区Mankin评分低于微骨折组、胶原蛋白组(P < 0.001)。结果表明，无论是国产胶原还是进口胶原，与纤维蛋白粘合剂混合后联合微骨折术治疗软骨损伤的效果显著优于单纯使用胶原蛋白材料结合微骨折术和单纯微骨折术治疗。
从软骨修复进程看，随着时间的推移，实验组和CartiRegen组ICRS评分和Mankin评分都下降，提示软骨修复组织正逐渐趋向正常软骨转化；但微骨折组和胶原蛋白组略有反常，软骨组织评分随着时间的推移略微有所上升，这可能主要是因为每个时间点每组样本量太少(n=3)导致受个体差异影响较大。

2.6 各组兔膝关节软骨组织生物力学评价结果术后24周各组兔膝关节软骨组织压缩模量检测结果，如图7所示。微骨折组、胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨组织压缩模量分别为(20.10±1.36)，(24.89±2.93)，(34.35±3.96)，(37.53±6.19) MPa，
实验组与CartiRegen 组软骨组织压缩模量高于微骨折组、胶原蛋白组(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.001，P < 0.01)，实验组与CartiRegen组软骨组织压缩模量低于正常软骨组织[(51.30±4.53) MPa](P < 0.001，P < 0.01)。结果表明，无论使用国产胶原蛋白还是进口胶原蛋白，与纤维蛋白粘合剂混合后联合微骨折术治疗软骨缺损表现出最接近健康正常软骨的黏弹性行为。
术后24周各组兔膝关节软骨组织硬度检测结果，见图8。微骨折组、胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨组织硬度分别为(207.14±22.26)，(341.59±22.45)，(368.02±29.02)，(389.65±30.29) kPa，胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨组织硬度大于微骨折组(P < 0.001)，胶原蛋白组、实验组与CartiRegen组软骨组织硬度低于正常软骨组织[(488.77±21.31) kPa]
(P < 0.001)。结果表明，使用胶原蛋白进行软骨修复，人纤维蛋白粘合剂的添加与否对生成软骨组织的硬度无明显影响。考虑到该结果仅为术后24周的结果，而软骨修复及组织力学性能的恢复和重建可能需要更久的时间，随着修复时间的推移，修复软骨的硬度可能会进一步增加，更加接近原生软骨的力学性能。

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105-116.

引言

骨关节炎又被称为退行性关节炎或增生性关节炎[1]，是一种严重影响中老年人健康和活动能力的常见慢性致残性疾病[2-3]。骨关节炎最主要的原因之一为关节软骨损伤，由于关节软骨无血管、无神经的特殊生理结构[4]，一旦软骨损伤几乎无法自我修复，因而关节软骨损伤的修复与再生一直是科研和临床难题[5-6]。
针对关节软骨损伤，临床上现有的治疗手段有微骨折术、软骨移植(自体骨软骨移植和异体骨软骨移植)、软骨细胞移植术等[7-8]。微骨折术是在患者软骨损伤的骨表面钻孔使骨髓流出，在受损骨表面形成类似于结痂组织，促进软骨修复，新生成的软骨大部分为纤维状软骨[9-10]，该方法只适用于软骨缺损小于2 cm2的患者[11-12]，修复效果与患者自身年龄和体质量等因素相关性较大[13]。微骨折术短期(2年)具有较好的修复效果，但长期疗效不佳，因为此方法修复生成的软骨多为纤维软骨，力学性能较差，容易二次磨损[13]。软骨移植是通过手术方式从患者自体或异体人的关节非负重区取健康关节软骨，然后植入到患者受损的关节软骨部位[14]，从而达到修复效果，但该方法存在软骨来源有限、可能产生排异反应以及异体软骨移植有潜在的病毒传染风险等缺点[15-16]。软骨细胞移植是从患者自身关节非负重区的自体软骨组织提取软骨细胞[17]，将软骨细胞进行体外培养，扩增10-20倍后通过手术注入软骨缺损区进行局部软骨修复，该方法能取得较好的修复效果，但手术复杂需要二次手术且成本较高；此外，体外培养软骨细胞存在去分化现象[18-19]，长时间的体外培养会导致细胞表型发生变化，在基因、蛋白表达和表型上与正常软骨存在明显差异[20]，植入体内后会形成纤维软骨[21-22]。
当前缺乏能同时实现操作便捷性与持久性软骨再生的单一手术技术，而组织工程技术的突破为功能性软骨修复提供了新路径，比如基质诱导自体软骨细胞移植、自体基质诱导软骨再生技术等[23]。用于软骨修复的生物材料包括天然材料和合成材料[24]。天然材料包括胶原、明胶、丝素蛋白、壳聚糖、透明质酸等，合成材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚对二氧环己酮等[25]。丝素蛋白是在蚕丝或者蛛丝中分离的天然高分子纤维蛋白，可以促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，目前关于丝素蛋白用于关节炎中软骨修复的治疗大多是基础研究，临床应用较少[26]。
中国人民解放军总医院郭全义教授团队[27]和华南理工曹晓东教授团队[28]通过改性技术使丝素蛋白支架具备更合适的孔径、机械支撑力及降解速率，使其在软骨组织修复方面具有更好的应用潜力。王武等[29]利用3D打印技术构建羟基磷灰石-聚乙烯醇/胶原-壳聚糖-明胶复合水凝胶并植入兔骨软骨缺损部位，证明该材料具有良好的细胞长入和组织整合修复能力。胶原蛋白作为软骨细胞外基质中的主要成分，其降解产物可被细胞利用合成新基质，在软骨组织工程中广受关注。其中，Ⅰ型胶原蛋白作为来源最丰富、体内含量最多的胶原类型，被大量用作组织工程支架材料。研究发现，在基质诱导自体软骨移植术中使用猪源性胶原蛋白膜接种自体软骨细胞，然后植入软骨缺损处的修复效果优于微骨折术[30]。胶原蛋白也可与其他材料复合，在大面积软骨缺损中展现出更优的修复效果。SALONIUS团队[31]开发了一种人源Ⅲ型胶原-聚乳酸复合支架材料，应用于猪大面积软骨缺损的自体基质诱导软骨再生手术中，术后4个月缺损区域填充效果良好。INTINI等[32]开发了一种Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白与透明质酸交联的复合支架，将其植入山羊内侧股骨髁软骨缺损部位后6个月成功生成了表面光滑、结构透明的关节软骨组织，并且未引发炎症反应或退行性病变，实现了对大尺寸软骨缺损的有效修复。王征等[33]通过紫外线交联技术制备了壳聚糖/胶原蛋白复合支架(配比1∶3)，并负载兔脂肪干细胞与生长分化因子5用于修复兔膝关节软骨缺损，术后12周观察到缺损区域透明软骨生成，修复效果良好。
微骨折术后形成的骨髓凝血块虽然富含纤维蛋白等修复性成分，但力学稳定性不足，理论上引入外源性支架可以改善其结构缺陷。纤维蛋白粘合剂在临床中常用于创伤止血(联合缝合或单独使用)，将其与软骨修复材料或同种异体软骨结合可拓展应用于软骨修复领域，但仍存在不足之处。此次研究创新性地使用去端肽的猪源Ⅰ型胶原蛋白材料，并与人纤维蛋白粘合剂进行混合，在微骨折术的基础上植入该混合物修复兔关节损伤软骨，通过MRI、组织修复评分、组织切片、生物力学评价等方法评估损伤软骨修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2022年1月至2024年4月在北京大学第三医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康新西兰大白兔48只，三四月龄，雌雄不拘，体质量2.5-4.0 kg，购自北京大学医学部实验动物中心，许可证号：SYXK(京)2021-0064。动物实验通过北京大学生物医学伦理委员会批准，批准号：PUIRB-LA2024020。
1.3.2 主要材料、试剂和仪器国产胶原蛋白[康膝生物医疗(深圳)有限公司]，进口胶原蛋白(Ubiosis Co.，Ltd)，辅助用品为人纤维蛋白粘合剂(上海莱士血液制品股份有限公司)。使用的国产胶原蛋白为自主研发的医疗器械成品胶原蛋白软骨再生载体，材料取自于猪皮；进口胶原蛋白为境内获批上市的进口医疗器械胶原蛋白软骨修复支架COLTRIX® CartiRegen，主要成分为去端肽Ⅰ型胶原蛋白，材料也取自于猪皮。两款材料的信息见表1。

盐酸噻拉嗪注射液(吉林省华牧动物保健品有限公司)；托芬那酸注射液(法国威隆)；注射用青霉素钠(三明三兽药有限公司)；40 g/L多聚甲醛(生工)；苏木精-伊红染液、甲苯胺蓝染液、番红O-固绿染液(翌圣生物)；免疫组化(IHC)试剂盒(Bioss)；TritonX-100(碧云天)；甲酸脱钙液(博奥森)；抗兔Ⅱ型胶原蛋白抗体(MyBIoSourse MBS8577343)；牛血清白蛋白封闭液、包埋石蜡(索莱宝)；PBS(Adamas life)；组织切片机(Leica Biosystems)；Hysitron TI-Premier 纳米压痕仪(布鲁克，Hysitron Inc)；核磁1.5-T magnet (Vision，Siemens)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组与造模采用随机数字表法将新西兰兔分为微骨折组、胶原蛋白组、实验组和CartiRegen组，每组12只。称量新西兰兔体质量，耳缘静脉注射1%戊巴比妥(3 mL/kg)麻醉兔，侧卧位固定，左后肢剃毛、消毒，行膝关节髌韧带内侧缘纵向3.0-4.0 cm切口，从髌韧带内侧进入，屈曲膝关节，将髌骨导向外侧脱位，暴露出股骨滑车部，在股骨内髁滑车面先用直径2 mm的钻头初步定位，钻出小凹陷，然后换直径4.5 mm钻头在此基础上钻出直径4.5 mm、深3 mm的全层关节软骨缺损区，软骨下骨板被完全破坏，用生理盐水冲洗清除组织碎屑和血块，建立关节软骨缺损模型。
1.4.2 分组干预
材料混合配制：制备人纤维蛋白粘合剂与胶原蛋白的混合物。根据人纤维蛋白粘合剂的产品说明书配制凝血酶溶液和纤维蛋白原溶液，备用。使用2支1 mL无菌注射器(注射器A和注射器B)和一个Y型混合导管，胶原蛋白与凝血酶溶液按照8∶2的体积比(即0.8 mL胶原蛋白与0.2 mL凝血酶溶液)混匀后装入注射器B，另一支注射器A装入1 mL纤维蛋白原溶液(图1a)，两种溶液通过Y型混合导管混合(体积比为1∶1)，备用。
分组干预：先对造模动物行微骨折术，使用18 G无菌注射针在模型动物的缺损软骨下骨上扎3个孔，使骨髓腔中的骨髓流出，微骨折组实验动物行微骨折术后不再做进一步修复处理，逐层缝合切口完成修复。胶原蛋白组、CartiRegen组和实验组行微骨折术后即刻分别将国产胶原蛋白软骨再生载体(1 mL)、进口胶原COLTRIX® CartiRegen与人纤维蛋白粘合剂混合物(混合物体积2 mL)、国产胶原蛋白软骨再生载体与人纤维蛋白粘合剂混合物(混合物体积2 mL)注射至软骨缺损部位(图1b)，注射过程中防止胶原蛋白溢出。待注射材料凝固后膝关节屈伸运动3-5次，检测植入物是否稳定黏附在缺损处。植入成功后逐层缝合切口。

1.4.3 MRI检查术后12，24周，耳缘静脉注射1%戊巴比妥(3 mL/kg)麻醉兔，对修复肢关节部位进行核磁影像学MRI检查。
1.4.4 组织学染色 MRI检查完成后处死兔，每个时间点每组处死6只，取各组软骨缺损区和周围正常软骨组织及对侧肢体正常软骨组织并拍照。每个时间点每组随机取3只兔软骨缺损区组织用于石蜡切片。40 g/L多聚甲醛浸泡固定软骨组织，浸泡于甲酸溶液中脱钙，清洗后放入梯度浓度乙醇中脱水，石蜡包埋后切片(片厚10 μm)；置于二甲苯中充分浸泡10 min，浸泡完后更换二甲苯继续浸泡10 min，放入无水乙醇中浸泡5 min，再依次置于体积分数95%，85%，70%乙醇中各浸泡5 min，使用PBS浸泡清洗3次，每次5 min，分别进行苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O-固绿染色与Ⅱ型胶原免疫组化染色，清洗、封装，使用显微镜观察组织中的细胞外基质和细胞分布、软骨组织多糖生成情况以及软骨、骨组织。
Ⅱ型胶原免疫组化染色：将石蜡组织切片放入55 ℃恒温箱中烤片30 min，放入第一脱蜡液(二甲苯)中充分浸泡30 min、第二脱蜡液中浸泡30 min，依次置于体积分数100%，95%，85%，75%，60%梯度乙醇中分别浸泡5 min；使用PBS浸泡清洗，放入0.3% TritonX-100渗透液中5 min，PBS清洗后放入体积分数3%H2O2去除内源酶干扰5 min，PBS 清洗后放入95 ℃柠檬酸钠缓冲液中30 min，缓慢冷却至室温；用PBS清洗切片2次，每次3 min；滴加5%山羊血清封闭液于37 ℃恒温孵育30 min，去除封闭液，滴加抗兔Ⅱ型胶原蛋白抗体(1∶800)于4 ℃孵育过夜，用缓冲液PBST洗涤5 min；用PBS洗涤3次，每次5 min；滴加二抗(1∶1 000)于37 ℃恒温孵育1 h，用PBST缓冲液洗涤5 min；用PBS洗涤3次，每次5 min；滴加显色工作液，树胶封固。
1.4.5 软骨修复评分按照国际软骨修复协会(International
Cartilage Repair Society，ICRS)分级系统[34]，对软骨组织的结构、病变、症状和功能进行评估，综合评估软骨修复效果。按照Mankin评分系统[35]，从结构变化、细胞数量、基质染色程度、潮线等各方面对软骨效果进行评分。
1.4.6 软骨修复组织生物力学性能检测术后24周，每组取3只兔软骨修复组织与正常软骨组织，通过纳米压痕实验检测压缩模量和硬度。纳米压痕仪选择立方直角压头，压头半角为35.26°、夹角90°，实验机最大载荷为10 mN，最大位移为5 μm。将样品放置在纳米压痕仪的载物台上，利用操作系统多次移动并调节试样高度，保证光学显微镜可清晰地观察到实验测量区域，采用连续刚度测量，设置加载频率为45 Hz，泊松比υ取0.3，最大热漂移设置为0.5 nm/s。执行压痕测试时，压头以设定速率加载至最大载荷，获得载荷-位移曲线(P-h曲线)，在样品的不同位置进行5次压痕测试，排除局部异质性影响，确保数据统计有效性。压痕测试点之间的间距设置为30 μm，以防止实验过程中相邻测试点之间的相互作用。全部样本测试完后，记录、导出压缩模量和硬度数据。
1.5 主要观察指标各组兔膝关节软骨修复组织MRI检查、组织学染色、ICRS 评分、Mankin评分以及生物力学检测结果。
1.6 统计学分析由一名独立的病理学者对所有实验动物的修复效果进行评价(包括大体外观、MRI阅片、软骨组织评分和组织学染色评价)，评价采用盲法，由实验者提供带编号的动物的实验数据，由病理学者独立评价后返回所有数据，由实验者进行数据的分组整理汇总。由实验者收集各组的压缩模量和硬度数据，汇总进行数据分析。使用Origin 2021对实验数据进行统计学分析。所有数据均通过正态分布检验，以x±s表示。采用单因素ANOVA (One-Way ANOVA)方法进行假设检验，事后组间两两比较，双侧检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经北京大学第三医院生物统计学专家审核。

讨论

胶原蛋白作为一种具有良好生物相容性的天然生物材料，能够植入体内作为一个生物支架促进缺损软骨的修复与再生。目前临床上最为常用的软骨修复技术——微骨折术是通过手术将骨髓腔中的骨髓释放出来，骨髓中含有的纤连蛋白结合成为凝固物附着在软骨缺损部位，该凝固物相当于一个生物支架为骨髓间充质干细胞提供一个生长空间，并且骨髓中还含有多种生长因子，在体内微环境下骨髓间充质干细胞增殖、分化为成软骨细胞，修复损伤软骨组织。但是由于骨髓形成的凝固物主要是由纤维蛋白构成，其生物学性能、力学性能与软骨组织的胶原蛋白存在差别，导致骨髓间充质干细胞分化形成的成软骨细胞表型发生改变，进而形成纤维化软骨组织。
基于自体软骨细胞移植技术的修复方法，已有多款胶原蛋白膜实现商业化，盖氏(Geistlich)公司的胶原膜(Chondro-Gide®)和Vericel公司的胶原膜(MACI®)已在临床应用多年并显示出积极的修复效果[36-37]，但是该技术需要将胶原蛋白膜通过缝合方式固定在受损软骨组织上，并且需要根据软骨组织损伤的形状和大小对膜进行裁切，手术操作繁琐。并且自体软骨细胞移植需要进行二次手术，费用高、周期长；此外自体软骨细胞长时间体外培养会导致其表型发生改变，移植入体内后发生纤维化。基质诱导自体软骨细胞移植通过将自体软骨细胞与修复支架材料在体外复合后移植，与自体软骨细胞移植相比极大降低了手术复杂度。基于基质诱导自体软骨细胞移植技术也有多款商业化产品在国外临床应用，例如，Hyalograft C支架是基于透明质酸苄酯制成的，直接在支架上培养软骨细胞作为植入物无需额外粘合剂即可植入受损处[38]。ChondroTM纤维蛋白基凝胶支架是另一种与软骨细胞结合用于软骨修复的材料，将软骨细胞与纤维蛋白以1∶1的比例混合后直接注射到缺损处，移植12个月后患者没有出现移植物相关并发症，并且形成了几乎正常的软骨组织[39]。但是这类产品在临床使用过程中依然需要进行二次手术和软骨细胞体外培养，增加了治疗周期和治疗费用。为了克服这些缺点，自体基质诱导软骨再生技术概念的无细胞携载修复支架应运而生，该支架材料植入体内后负载内源性干细胞进行修复。TruFit和MaioRegen是两种目前已上市的此类支架，TruFit支架由聚乳酸-乙交酯共聚物、硫酸钙、聚乙交酯纤维和表面活性剂组成，临床研究表明TruFit支架修复关节软骨缺损具有良好的远期效果[40]；而MaioRegen支架是由Ⅰ型胶原蛋白和羟基磷灰石组成的三层仿生支架，一项多中心前瞻性研究表明，植入MaioRegen支架显著改善了膝关节全层软骨缺损患者的膝关节症状[41]。然而，这些支架均为固态结构，形状和体积均是固定的，在临床使用时需要在术前对患者的软骨损伤形状和损伤面积进行检测并预估，然后根据检测和预估结果在无菌条件下对这类支架材料进行形状裁剪，使其植入后与周围软骨组织形成良好的整合性，这无疑增加了手术的复杂性和难度。
此次研究创新性地应用和改进了自体基质诱导软骨再生概念，将液态的胶原蛋白材料与纤维蛋白粘合剂混合形成复合生物支架，然后联合微骨折术治疗软骨缺损。相较于目前已经商业化的软骨修复产品，此次研究中使用的胶原蛋白材料为可注射凝胶，在临床使用时无需根据软骨缺损的形状和面积对支架材料进行裁剪，提高了临床使用的便利性。为了提高胶原蛋白材料在软骨缺损部位黏附的牢固性，此次研究将胶原蛋白与纤维蛋白原混合并原位激活纤维蛋白原快速固化的方式，提高了植入支架在体内的稳定性。与此同时，为了解决材料中缺乏种子细胞的问题，应用时使用支架材料植入联合微骨折术，在获取自体干细胞同时也避免了细胞长时间体外培养导致的细胞表型改变和高费用等问题。随着组织工程技术快速发展，微骨折术联合胶原蛋白材料治疗软骨损伤在临床上已有应用，并且取得了满意效果[42]。KIM等[43]对30例ICRS分级Ⅲ/Ⅳa级膝关节软骨缺损患者采用微骨折术联合胶原支架进行治疗，术后6年随访显示患者膝关节功能评分显著提升，影像学结果证实新生组织为透明状软骨组织，特性与原生软骨相似，显著改善了软骨缺损症状。ANDERS等[44]采用微骨折术联合Ⅰ/Ⅲ型胶原基质(Chondro-Gide®)治疗缺损面积平均为3.4 cm2的关节软骨缺损患者，术后1，2年随访显示新生软骨填充均匀且无相关不良事件，证实该胶原蛋白基质增强微骨折术治疗大面积软骨缺损是一种安全有效的选择。微骨折术联合胶原蛋白材料治疗软骨缺损能够取得较好效果的原因在于：微骨折术释放自体骨髓间充质干细胞的同时还能让植入的材料流入微骨折术形成的空洞中，形成“铆钉”进一步增强材料在植入部位的稳固性，解决了临床医生担忧的材料脱落问题。因此，与以往研究相比，此次研究从使用修复材料的形态选择、材料的使用方式以及修复手术的选择上均有巨大的改进和创新。
从大体外观和MRI影像结果来看，单纯使用微骨折术进行治疗的软骨缺损基本填充，软骨修复组织与周围正常软骨组织的整合性较差；使用胶原蛋白结合微骨折术治疗的软骨缺损基本填充完全，与周围正常软骨组织基本完全整合，略有差异；使用胶原蛋白与人纤维蛋白粘合剂的复合支架材料结合微骨折术进行修复的CartiRegen组和实验组软骨缺损填充完全，与周围健康软骨组织的整合、平面等基本未见明显差异，基本接近正常软骨。
从软骨组织评分来看，术后12，24周，微骨折组软骨缺损区ICRS评分和Mankin评分都是最高的，提示修复效果最差，其次为胶原蛋白组，CartiRegen组和实验组ICRS评分和Mankin评分最低，提示修复效果较好。随着时间的推移，CartiRegen组和实验组软骨缺损区ICRS评分和Mankin评分下降，这说明使用胶原蛋白与人纤维蛋白粘合剂的复合支架材料结合微骨折术修复治疗的受损软骨正逐渐向正常软骨转变。结果表明，无论是国产胶原蛋白还是进口胶原蛋白，与纤维蛋白粘合剂混合后治疗软骨损伤的效果优于单纯使用胶原蛋白材料结合微骨折术或者单纯微骨折术治疗。
从软骨组织形态上看，苏木精-伊红、免疫组化、甲苯胺蓝和番红O-固绿染色结果表明，无论是进口胶原蛋白还是国产胶原蛋白，与纤维蛋白粘合剂混合后结合微骨折术治疗软骨损伤的修复效果优于单纯使用胶原蛋白结合微骨折术，仅使用微骨折术治疗的效果是4组中最差的，修复组织呈纤维状修复，这与文献[13]的结论相一致。
从修复软骨组织的生物力学上看，微骨折组软骨缺损修复区压缩模量和组织硬度低于胶原蛋白组、实验组和CartiRegen组；胶原蛋白组软骨缺损修复区硬度值低于实验组和CartiRegen组，压缩模量低于实验组和CartiRegen组，这表明胶原蛋白和人纤维蛋白粘合剂的联合使用相比单纯使用胶原蛋白可以进一步提高新生软骨的组织硬度，可显著提高新生软骨的压缩模量。但实验组和CartiRegen组软骨缺损修复区的压缩模量和组织硬度距离原生软骨还存在一定差距，这可能因为样本量较小或者检测时间太短(仅为术后24周)，软骨组织的修复需要更长时间才能逐步恢复到接近健康软骨的力学性能。
从修复时间上来看，术后24周的软骨修复结果优于术后12周，使用胶原蛋白材料联合人纤维蛋白粘合剂的实验组和CartiRegen组的组织学染色逐渐深染，周围组织过渡光滑平整，提示分泌蛋白多糖的细胞数量逐渐增加；MRI影像显示软骨缺损填充完全，缺损处未见高亮信号，与周围软骨组织接线不明显，在MRI上已经非常接近正常软骨表现；软骨组织评分也进一步下降，说明修复的软骨组织性能在改善，这些均提示受损修复软骨正在逐渐向正常软骨转变。
从软骨修复材料的角度看，使用国产胶原蛋白材料和进口胶原蛋白材料修复缺损软骨组织，无论从修复的软骨大体外观、MRI影像、组织评分、组织形态、组织生物力学等角度评价，基本不存在显著差异，这表明自主研发的国产胶原蛋白材料与目前获批上市的进口胶原蛋白材料在治疗兔软骨损伤中的修复效果方面未见显著性差异，这对于降低成本、推动国产胶原蛋白产品的研发和临床应用有积极的意义。此外，使用胶原蛋白材料混合人纤维蛋白粘合剂进行微骨折术，相比仅使用微骨折术能更好地修复软骨损伤，这也与之前的研究结果相一致[45-46]，这是因为胶原蛋白以及胶原蛋白和纤维蛋白复合物为骨髓间充质干细胞的增殖、分化提供物理空间和生物微环境。此次研究使用的Ⅰ型胶原蛋白，其主要组成、分子结构甚至生物性能与软骨组织的主要成分Ⅱ型胶原蛋白非常相似，因此，Ⅰ型胶原蛋白支架植入体内后能很好地模拟体内软骨组织微环境，为骨髓中释放的间充质干细胞提供黏附、迁移、增殖、分化的物理空间和微环境，同时也为周围健康软骨组织中的软骨细胞提供迁移、增殖的物理空间。胶原蛋白支架与天然软骨组织细胞外基质相似的组成和组织微环境，使新生软骨组织的结构与功能更接近天然软骨组织。
此次研究创新性添加纤维蛋白粘合剂，该材料被广泛用于心血管、妇科、泌尿、矫形外科等众多领域，联合缝合术或单独使用用于创伤部位的止血[47]，一些较新的应用研究方向包括缓释系统和支架材料[48]。在软骨修复领域，纤维蛋白粘合剂可以结合软骨修复材料或同种异体软骨用于软骨修复或软骨移植，例如，曾俐等[49-50]自制纤维蛋白粘合剂用于兔膝关节同种异体软骨移植，促进血管及纤维组织增生，有利于软骨愈合；杨贵勇等[51]认为相比化学粘合剂，生物粘合剂更适宜用于修复关节软骨缺损；JEONG等[52]在微骨折术中将去端肽胶原和纤维蛋白胶混合物移植到家兔软骨缺损处，显著提升了软骨缺损修复效果。此次研究将人纤维蛋白粘合剂与国产胶原蛋白支架材料结合用于治疗软骨损伤，证实人纤维蛋白粘合剂的添加使胶原蛋白支架能更好地黏附在软骨缺损部位，因此表现出相比于单纯使用胶原支架更好的修复效果。
此次研究也有不足之处：①实验终点设置为术后24周，软骨修复效果比术后12周已有进一步提高，但距离原生软骨仍有差距，例如，使用胶原蛋白和人纤维蛋白粘合剂治疗软骨缺损的修复组织的组织硬度只有原生正常软骨硬度的80%左右，并且修复软骨组织的压缩模量和硬度与健康软骨均存在显著差异。行标YY/T 0606.10-2008《组织工程医疗产品第10部分：修复或再生关节软骨植入物的体内评价指南》指出，在形态学和组织生物化学检测结果的基础上判断关节软骨修复或再生程度通常应需要8-12个月[53]。《用于关节软骨组织修复或再生的植入性医疗器械体内评价》中指出，大型动物模型8-12周的研究仅能评估生物相容性、早期细胞反应及植入物存留状况，判断软骨修复再生程度需 6-12个月[54]。也有研究者认为软骨再生的初步研究可在术后12周(约3个月)进行早期评估，但修复效果的全面评估通常需6-12个月[55]。大动物模型研究显示，短期实验仅能评估生物相容性，而揭示关节软骨修复再生效果需依赖长期研究[56]，因此，建议更长随访时间(如术后12个月)观察软骨修复效果。②研究使用的样本数量偏小，由于要检测和评价的指标较多且样本不可重复使用，导致结果可能会受到个体差异的影响，未来研究或可能需要更大样本量进行验证。③研究在进行软骨修复效果评估时，尤其是涉及主观评分(如软骨组织评分)时，仅由一名病理学者进行独立阅片打分，虽已采用盲法进行评分以减少偏倚，但仍具有局限性，未来宜更科学地设立评价方法和流程，如进行标准化培训(统一评分标准)，由2名以上评分者独立评分并在出现分歧时引入第三位仲裁。此外，此次研究使用的生物力学评价指标只包括压缩模量和硬度，未来可纳入更多更合适指标全面评价新生软骨组织的力学性能，如组织渗透性、动态机械性能等[53-57]。④研究选择了兔为实验对象，其自身的软骨损伤修复能力以及软骨组织受力特点与大型动物特别是人类具有较大差异[58-59]，未来可能需要开展大动物实验，进一步验证胶原蛋白材料治疗软骨缺损的有效性。
综合大体外观、MRI影像结果、软骨组织评分(ICRS和Mankin评分)和组织学染色结果，单纯使用微骨折术修复缺损的效果最差，胶原蛋白结合微骨折术修复组整体修复效果好于微骨折组，而使用胶原蛋白与人纤维蛋白粘合剂复合支架结合微骨折术进行修复的效果最好，表明胶原蛋白和人纤维蛋白粘合剂的联合使用可以提高新生软骨组织的压缩模量和组织硬度。
此次研究在动物实验层面验证了一种改良的基于自体基质诱导软骨再生术方案，即利用液态的国产胶原蛋白水凝胶结合纤维蛋白粘合剂，在微骨折术的基础上进行软骨损伤治疗，显著提高了支架材料与缺损部位的黏附稳定性，从而获得更接近原生透明状软骨的修复组织。这种技术的改进、支架材料的创新对于提高组织工程软骨修复的疗效具有指导意义。此外，自主研发的国产胶原蛋白材料修复软骨损伤的效果与已上市的进口胶原蛋白材料相当，这对于解决核心支架材料卡脖子问题、降低成本、推动国内产品研发、实现进口替代具有积极的意义。
综上所述，取材于猪皮的去端肽Ⅰ型胶原蛋白材料能够作为一种良好的生物支架，联合微骨折术治疗兔软骨损伤具有良好的修复效果，优于单纯使用微骨折术进行软骨修复；通过添加人纤维蛋白粘合剂有利于胶原蛋白在软骨缺损部位的固定，进一步提升修复效果，为关节软骨损伤的一步法组织工程修复提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程