新型含Mn生物陶瓷粉体减轻软骨细胞的氧化应激损伤

doi:10.12307/2025.434

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (16): 3335-3342.doi: 10.12307/2025.434

• 组织工程软骨材料 tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

新型含Mn生物陶瓷粉体减轻软骨细胞的氧化应激损伤

张梓宁1，邓荣辉1，余家阔1，2

1北京大学第三医院运动医学科，北京市 100191；2北京清华长庚医院骨科与运动医学中心，清华大学医学中心，北京市 102218

收稿日期:2024-03-25 接受日期:2024-05-21 出版日期:2025-06-08 发布日期:2024-09-02
通讯作者: 余家阔，主任医师，北京大学第三医院运动医学科，北京市 100191；北京清华长庚医院骨科与运动医学中心，清华大学医学中心，北京市 102218
作者简介:张梓宁，男，1998年生，北京市人，汉族，2024年北京大学医学部毕业，博士，主要从事骨关节炎及滑膜炎方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金-北京市自然科学基金区域新联合发展基金项目(U22A20283)，项目负责人：余家阔

Alleviation of oxidative stress damage in chondrocytes by a new Mn-containing bioceramic powder

hang Zining1, Deng Ronghui1, Yu Jiakuo1, 2

1Department of Sports Medicine, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China; 2Department of Orthopedic and Sports Medicine Center, Beijing Tsinghua Changgung Hospital Medical Center, Medical Center of Tsinghua University, Beijing 102218, China

Received:2024-03-25 Accepted:2024-05-21 Online:2025-06-08 Published:2024-09-02
Contact: Zhang Zining, MD, Department of Sports Medicine, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China
About author:Yu Jiakuo, Chief physician, Department of Sports Medicine, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China; Department of Orthopedic and Sports Medicine Center, Beijing Tsinghua Changgung Hospital Medical Center, Medical Center of Tsinghua University, Beijing 102218, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China-Beijing Natural Science Foundation Regional New Joint Development Fund Project, No. U22A20283 (to YJK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物陶瓷：是指一类稳定性较强且具有良好生物相容性的陶瓷材料。由于生物陶瓷能与组织亲和，较少产生免疫排斥，并且无毒副作用，因此常用于医学修复组织工程领域中。
氧化应激：是指在应激源作用下机体出现氧化/抗氧化失衡状态，过量产生活性氧，并且抗氧化系统不足以代偿，进而引发机体炎症等病理改变。

背景：Mn可参与到多种生物体内氧化还原反应中，比如作为超氧化物歧化酶2中的金属辅助基团发挥辅助清除活性氧的作用，因此近些年开发含Mn的新型抗氧化应激材料成为研究的热点。
目的：探讨含Mn生物陶瓷粉体通过降低活性氧途径对软骨细胞氧化应激损伤的保护作用。
方法：采用熔盐法制备含Mn生物陶瓷粉体。分离培养小鼠原代软骨细胞。在H2O2溶液中分别加入含0，0.15，0.30 mg/mL Mn生物陶瓷粉体，避光孵育后检测H2O2清除率。将第2-4代软骨细胞分别与含不同质量浓度(0，0.15，0.30 mg/mL)含Mn生物陶瓷粉体的完全培养基共培养，采用细胞活死染色检测细胞活性。将第2-4代软骨细胞(或软骨组织)分4组干预：空白对照组加入完全培养基培养，H2O2组加入用含 H2O2的完全培养基培养，H2O2+低质量浓度Mn粉体组加入含H2O2+0.15 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体的完全培养基培养，H2O2+高质量浓度Mn粉体组加入含 H2O2+0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体的完全培养基，采用CCK-8法检测软骨细胞活力，2，7-二氯荧光素二乙酸酯探针检测软骨细胞活性氧生成，qRT-PCR检测软骨细胞相关因子表达，甲苯胺蓝染色检测软骨组织结构与功能。
结果与结论：①两种剂量的含Mn生物陶瓷粉体均可以于体外显著清除H2O2，并且具有质量浓度依赖性；细胞活死染色结果显示，
0.15 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体具有软骨细胞安全性，0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体存在软骨细胞毒性；②CCK-8检测结果显示，两种质量浓度的含Mn生物陶瓷粉体均可以显著减轻H2O2对软骨细胞活力的抑制作用，并可抑制H2O2诱导的软骨细胞活性氧生成，并且具有质量浓度依赖性；两种质量浓度的含Mn生物陶瓷粉体均可逆转H2O2诱导的软骨细胞血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5 mRNA表达升高与蛋白聚糖mRNA表达降低；③甲苯胺蓝染色结果显示，两种质量浓度的含Mn生物陶瓷粉体均可保护氧化应激下软骨组织结构的完整，其中0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体还可以减轻软骨组织的功能损伤；④结果表明，含Mn生物陶瓷粉体可以通过清除活性氧途径维持软骨细胞外基质稳态，从而对氧化应激下的软骨细胞发挥保护作用，但0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体具有一定的软骨细胞毒性，因此更倾向使用0.15 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体进行后续研究。
https://orcid.org/0000-0003-4151-6516 (张梓宁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 生物陶瓷, Mn粉体材料, 软骨损伤, 氧化应激, 活性氧, 骨关节炎, 细胞外基质, 生物安全性

Abstract: BACKGROUND: Mn can participate in oxidation-reduction reactions in various organisms. For example, as a metal-assisted group in superoxide dismutase 2, Mn plays a role in helping to remove reactive oxygen species. Therefore, the development of novel anti-oxidative stress materials containing Mn has become a research focus in recent years.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect of Mn bioceramic powder material on oxidative stress damage to chondrocytes by reducing the reactive oxygen species pathway.
METHODS: Bioceramic powders containing Mn were prepared by molten salt method. Primary mouse chondrocytes were isolated and cultured. Bioceramic powder containing 0, 0.15, and 0.30 mg/mL of Mn was added into H2O2 solution. The H2O2 clearance rate was detected after incubation without light. The passage 2 to passage 4 chondrocytes were co-cultured with complete media containing Mn-containing bioceramic powder with different mass concentrations (0, 0.15, and 0.30 mg/mL). Cell viability was detected by cell live/dead staining. The passage 2-4 chondrocytes (or cartilage tissue) were divided into four groups for intervention: Complete culture medium was added to the blank control group. The H2O2 group was added and cultured with complete medium containing H2O2. H2O2+low mass concentration Mn powder group was cultured by adding H2O2+0.15 mg /mL Mn-containing bioceramic powder. The complete medium containing H2O2+0.30 mg/mL Mn-containing bioceramic powder was added to the H2O2+high mass concentration Mn powder group. Viability of chondrocytes was detected by CCK-8 assay. Generation of reactive oxygen species of chondrocytes was detected by 2,7-dichlorofluorescein diacetate probe. Expression of chondrocyte-related factors was detected by qRT-PCR. The tissue structure and function of cartilage were detected by toluidine blue staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Both doses of Mn-containing bioceramic powders could significantly remove H2O2 in vitro, and they were concentration dependent. The results of cell live/death staining showed that 0.15 mg/mL bioceramic powder containing Mn had chondrocyte safety, and 0.30 mg/mL bioceramic powder containing Mn had chondrocytotoxicity. (2) The results of CCK-8 assay showed that the two mass concentrations of Mn-containing bioceramic powders could significantly reduce the inhibitory effect of H2O2 on chondrocyte viability, and inhibit the generation of reactive oxygen species induced by H2O2 in chondrocytes in a mass concentration dependent manner. Both kinds of Mn-containing bioceramic powders could reverse the H2O2-induced increase of mRNA expression of a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5 and decrease of proteoglycan mRNA expression in chondrocytes. (3) Toluidine blue staining results showed that both concentrations of Mn-containing bioceramic powder could protect the integrity of cartilage tissue structure under oxidative stress, and 0.30 mg/mL of Mn-containing bioceramic powder could also reduce the functional damage of cartilage tissue. (4) The results indicate that the Mn-containing bioceramic powder can protect chondrocytes under oxidative stress by clearing reactive oxygen species, maintaining the extracellular matrix homeostasis. However, 0.30 mg/mL Mn-containing bioceramic powder has certain chondrocytotoxicity, so 0.15 mg/mL Mn-containing bioceramic powder is preferred for follow-up studies.

Key words: bioceramic, Mn powder material, cartilage injury, oxidative stress, reactive oxygen species, osteoarthritis, extracellular matrix, biosafety

中图分类号:

张梓宁, 邓荣辉, 余家阔. 新型含Mn生物陶瓷粉体减轻软骨细胞的氧化应激损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3335-3342.

hang Zining, Deng Ronghui, Yu Jiakuo. Alleviation of oxidative stress damage in chondrocytes by a new Mn-containing bioceramic powder[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(16): 3335-3342.

图/表（结果） 6

2.1 含Mn生物陶瓷粉体的体外H2O2清除率如图1所示，0，0.15，0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体组H2O2清除率分别为(2.7±0.8)%，(29.3±6.8)%，(39.9±2.2)%。0.15，0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体组H2O2清除率高于0 mg/mL 含Mn生物陶瓷粉体组(P < 0.01)，0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体组H2O2清除率高于0.15 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体组(P < 0.01)。

2.2 含Mn生物陶瓷粉体对软骨细胞活性的影响各组软骨细胞活死染色结果如图2所示。在共聚焦显微镜下3组均可以观察到绿色荧光标记的活细胞，0，0.15 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体组未观察到红色荧光标记的死细胞，0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体组可观察到被红色荧光所标记的死细胞，说明0.15 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体具有软骨细胞安全性，而0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体存在软骨细胞毒性。

2.3 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨细胞活力的影响各组软骨细胞活力CCK-8检测结果如图3所示。空白对照组、H2O2组、H2O2+低质量浓度Mn粉体组、H2O2+高质量浓度Mn粉体组的细胞活力分别为(100.0±6.3)%，(57.2±9.3)%，(98.3±8.7)%，(93.6±6.5)%。与空白对照组比较，H2O2组细胞活力显著降低(P < 0.01)；与H2O2组比较，H2O2+低质量浓度Mn粉体组、H2O2+高质量浓度Mn粉体组细胞活力升高(P < 0.01)；H2O2+低质量浓度Mn粉体组与H2O2+高质量浓度Mn粉体组细胞活力比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨细胞活性氧产生的影响各组软骨细胞2，7-二氯荧光素二乙酸酯探针检测活性氧生成，见图4所示。共聚焦显微镜下可见空白对照组细胞无活性氧生成(活性氧呈绿色荧光)，H2O2组软骨细胞均表达大量绿色荧光，两种质量浓度Mn粉体组绿色荧光较H2O2组降低，并且具有Mn粉体质量浓度依赖性。活性氧相对荧光强度定量分析结果显示，空白对照组、H2O2组、H2O2+低质量浓度Mn粉体组、H2O2+高质量浓度Mn粉体组分别为1.0±0.4，44.4±8.2，17.6±2.1，6.5±1.0，组间活性氧相对荧光强度两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)。表明，H2O2介导的氧化应激可以显著增加软骨细胞内活性氧水平，而含Mn生物陶瓷粉体可以显著降低氧化应激产生的活性氧水平，并且其清除活性氧能力随粉体质量浓度的增加而提高。

2.5 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨细胞相关因子表达的影响 qRT-PCR检测各组软骨细胞相关因子mRNA表达结果，见图5所示。空白对照组、H2O2组、H2O2+低质量浓度Mn粉体组、H2O2+高质量浓度Mn粉体组血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5 mRNA相对表达分别为1.0±0.1，16.9±1.8，11.7±2.0，5.2±2.6，组间血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5 mRNA相对表达两两比较差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)。
空白对照组、H2O2组、H2O2+低质量浓度Mn粉体组、H2O2+高质量浓度Mn粉体组蛋白聚糖mRNA相对表达分别为1.00±0.08，0.22±0.04，0.56±0.13，0.53±0.12，除H2O2+低质量浓度Mn粉体组与H2O2+高质量浓度Mn粉体组蛋白聚糖mRNA相对表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)外，其余组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)。

2.6 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨组织结构与功能的影响各组软骨组织甲苯胺蓝染色结果如图6所示。空白对照组软骨组织结构正常，甲苯胺蓝染色较深；H2O2组软骨结构被破坏，部分软骨细胞崩解，残余的软骨甲苯胺蓝染色非常浅；H2O2+低质量浓度Mn粉体组软骨结构正常，但甲苯胺蓝染色非常浅；H2O2+高质量浓度Mn粉体组软骨结构正常，甲苯胺蓝染色较前两组加深。定量统计软骨区域甲苯胺蓝相对染色强度，空白对照组、H2O2组、H2O2+低质量浓度Mn粉体组、H2O2+高质量浓度Mn粉体组分别为1.00±0.12，0.29±0.04，0.31±0.12，0.76±0.07。与空白对照组比较，H2O2组甲苯胺蓝相对染色强度降低(P < 0.01)；与H2O2组比较，H2O2+高质量浓度Mn粉体组甲苯胺蓝相对染色强度升高(P < 0.01)；与H2O2+低质量浓度Mn粉体组比较，H2O2+高质量浓度Mn粉体组甲苯胺蓝相对染色强度升高(P < 0.01)。以上结果显示，两种质量浓度的Mn生物陶瓷粉体均可以保护软骨结构的完整性，并且高质量浓度的含Mn生物陶瓷粉体还可以显著提升甲苯胺蓝染色强度，表明高质量浓度Mn生物陶瓷粉体可以减轻氧化应激对软骨功能的影响。

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引言

骨关节炎是最常见的慢性关节炎症，软骨损伤是其主要病理表现，并且伴随滑膜炎症、软骨下骨重塑、骨赘形成、滑液因子改变等病理变化[1]。研究表明，骨关节炎与包括年龄、超重、关节创伤、遗传因素等在内的多种危险因素相关[2]。对骨关节炎最好的管理方式是改变或延缓其病程，预防病程长期进展后患者出现疼痛、关节破坏、功能紊乱甚至致残等严重临床症状，以减轻疾病带来的经济、生活负担[3]。然而，目前临床上的非手术治疗仅能缓解疼痛和炎症，尚无可以逆转软骨损伤的药物[4]。因此，针对不同靶点研制新型临床治疗药物是解决骨关节炎疾病负担的重要研究目标。
虽然骨关节炎的发病机制尚未被探明，但研究显示氧化应激在其发生进展过程中起到了重要作用。病理条件下，软骨细胞受到应激原刺激，表现为活性氧的产出过量，进而引发炎症聚集，导致软骨不可逆损伤[5]，除此之外，活性氧还可通过增加线粒体损伤、促进软骨细胞外基质降解、引起软骨细胞凋亡等方式加重骨关节炎中的软骨损伤[6]。因此，能起到清除活性氧作用的维生素C、维生素E、植物多酚等药物常被用于研究治疗骨关节炎，但此类天然抗氧化剂生物利用度和稳定性较差，并且极易在关节腔内被自身清除，无法起到长期抗氧化应激的治疗作用[7-9]。因而研究人员开发并表征了多种具有活性氧清除酶样能力的自由基清除剂，将其局部注射至关节腔内来减轻氧化应激，从而达到保护软骨细胞的功效[10]。目前已开发出多种具有类酶活性的纳米材料来治疗骨关节炎，一项研究表明，具有纳米酶活性的氧化铈微粒不仅可在体外清除活性氧，在关节炎动物模型中也能减轻氧化应激对软骨细胞的损伤[11]；另一研究团队则开发了具有活性氧清除能力的黑磷纳米片，具有保护软骨基质合成及分解代谢稳态的功效[12]。然而这些材料也面临着长期安全性及疗效的挑战，尚未应用到临床治疗中。
生物陶瓷是一类具有良好生物相容性、稳定性和安全性的材料，常作为一种优质载体应用于骨和软骨组织工程修复领域[13]。既往已有研究将镁黄长石生物陶瓷材料与抗氧化纳米颗粒结合，研制成具有抗氧化和多模酶样清除能力的新型材料来修复软骨损伤[14]。此次实验制备了一种具有类酶催化作用的新型含Mn生物陶瓷粉体，研究其抗软骨细胞氧化应激损伤的功效，进而为该材料应用于骨关节炎的治疗奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外软骨细胞及软骨组织干预实验，采用单因素方差分析(AVOVA)及Tukey’s事后检验。

1.2 时间及地点实验于2022年7月至2023年4月在北京大学第三医院运动医学实验室完成。

1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性BalB/c小鼠12只，SPF级，6周龄，体质量16-18 g，购于北京维通利华公司，许可证号：SCXK(京)2022-0052，单笼饲养于北京大学医学部毒理系SPF实验室，环境温度控制在20-26 ℃，相对湿度为40%，环境噪声≤60 dB。实验方案已通过北京大学第三医院伦理委员会批准，伦理批准号：LA2019357。
1.3.2 主要实验器械电子分析天平购于德国Sartorius；医用手术器械购于上海普伦科技有限公司；Varioskan Flash多功能酶标仪购于美国ThermoFisher；倒置显微镜、LSM900共聚焦激光扫描显微镜购于德国ZEISS；实时荧光定量PCR仪购于美国Axygen；数字病理切片扫描仪购于日本Hamamatsu。
1.3.3 主要实验试剂氯化锂(LiCl)、氯化钾(KCl)、氯化锰(MnCl2)购于中国医药集团有限公司；镁黄长石(Ca2MgSi2O7)购于昆山华侨科技新材料有限公司；Ⅱ型胶原酶、含EDTA胰蛋白酶、高糖DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液购于美国Gibco；PBS、甲苯胺蓝染色液(1%，磷酸盐法)购于北京索莱宝科技有限公司；体积分数3%H2O2购于美国Sigma-Aldrich；40 g/L多聚甲醛固定液、H2O2检测试剂盒、细胞活性与细胞毒性检测试剂盒、活性氧检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；CCK-8试剂盒、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司；RevertAid RT 反转录试剂盒购于美国ThermoFisher；引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。
1.4 实验方法
1.4.1 新型含Mn生物陶瓷粉体制备称取1.1 g KCl、0.9 g LiCl、1.0 g镁黄长石和10.0 mg MnCl2置于研钵内研磨均匀。转移混合物至坩埚中，于氩气氛环境下在350 ℃气氛烧结炉内加热至熔融态反应1 h。待温度降至室温后，用超纯水清洗反应物5次以清除残余的可溶性盐，然后置于
60 ℃恒温箱内烘干，得到含Mn生物陶瓷粉体。
1.4.2 小鼠原代软骨细胞及软骨组织提取使用异氟烷吸入麻醉小鼠，维持有效浓度1%，于麻醉状态下处死小鼠12只，浸泡于体积分数75%乙醇内消毒5 min。将小鼠固定于操作台面，使用消毒过的手术器械分离小鼠后肢皮肤及软组织。①取6只小鼠小心地将棕色的骨组织剔除，分离出股骨头、股骨髁及胫骨平台处透明的关节软骨，将其剪成1 mm ×1 mm×1 mm大小的组织碎片，用无菌PBS清洗2次。将软骨组织转移至放有10 mL 0.25%胰蛋白酶的离心管内，置于37 ℃摇床内振荡20 min，振荡速率20次/min。1 000 r/min离心3 min后弃去上清液，用无菌PBS清洗2次。使用高糖DMEM培养基配置0.2%Ⅱ型胶原酶溶液。在离心管内加入10 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶溶液，置于37 ℃摇床内振荡6 h。1 000 r/min离心3 min后弃去上清液，用无菌PBS清洗2次，保留软骨细胞沉淀。向离心管内加入10 mL完全培养基(由445 mL 高糖DEME培养基、50 mL胎牛血清及5 mL青霉素-链霉素溶液配制)重悬软骨细胞，过无菌细胞筛网后接种于培养皿内，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。于显微镜下观察软骨细胞形态，细胞为不规则多边形，呈铺路石样聚集。使用P2-P4代软骨细胞进行后续实验。②分离剩余6只小鼠的髋臼与股骨头，沿股骨颈剪下覆盖软骨的股骨头，用无菌PBS清洗2次，转移至含完全培养基的6孔板内，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。
1.4.3 含Mn生物陶瓷粉体体外H2O2清除率实验按照H2O2检测试剂盒说明书所示，将H2O2标准溶液稀释至1，2，5，10，20，50，100 μmol/L，使用酶标仪测定A560值，减去超纯水对照组A560值后，绘制吸光度值与浓度的标准曲线。在100 μmol/L H2O2溶液中分别加入0，0.15，
0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体，振荡均匀后于室温避光下孵育8 h；4 ℃下10 000 r/min离心5 min，取上清液测定A560值，减去超纯水对照的A560值，根据标准曲线可得H2O2浓度并计算其清除率。每组样本重复6次。
1.4.4 含Mn生物陶瓷粉体对软骨细胞活性的影响在共聚焦培养皿内接种软骨细胞，细胞密度为1×104/皿，分3组培养，分别加入含0，0.15，0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体的完全培养基1 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。培养24 h后，用PBS清洗3次，加入配置的Calcein AM/PI工作染液避光孵育1 h，用PBS清洗3次，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞荧光染色情况，活细胞用绿色荧光的Calcein AM标记，Ex/Em=494/517；死细胞用红色荧光的PI标记，Ex/Em=535/617。每组样本重复4次。
1.4.5 实验分组与干预取软骨细胞或软骨组织，分4组干预：空白对照组加入完全培养基，H2O2组加入含200 μmol/L H2O2的完全培养基[15-17]，H2O2+低质量浓度粉体组加入含200 μmol/L H2O2+0.15 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体的完全培养基，H2O2+高质量浓度粉体组加入含
200 μmol/L H2O2+0.30 mg/mL含Mn生物陶瓷粉体的完全培养基。置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内，达实验周期后行进一步操作。
1.4.6 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨细胞活力的影响在96孔板内接种软骨细胞，细胞密度为1×103/孔，按照1.4.5分组干预。干预24 h后，用PBS清洗3次，加入配置好的CCK-8工作溶液避光孵育2 h，注意此步骤不应在孔中产生气泡，否则将干扰测定结果。使用酶标仪测定A450值，并与空白对照相比计算细胞活力。每组样本重复6次。
1.4.7 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨细胞活性氧生成的影响在共聚焦培养皿内接种软骨细胞，细胞密度为1×104/皿，按照1.4.5分组干预。干预4 h后，用PBS清洗3次，加入2，7-二氯荧光素二乙酸酯工作溶液避光孵育20 min。用PBS清洗3次，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞荧光染色情况。活性氧用绿色荧光的DCF标记，Ex/Em=488/525。使用Image J软件统计平均荧光强度。每组样本重复4次。
1.4.8 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨细胞基因表达的影响在培养皿内接种软骨细胞，细胞密度为1×104/皿，按照1.4.5分组干预。干预24 h后，用PBS清洗3次，加入TRIzol以裂解细胞提取RNA。使用RevertAid RT反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。按以下方法qRT-PCR反应体系(共20 μL)：10 μL Hieff qPCR SYBR Green Master Mix、0.4 μL前引物、0.4 μL后引物、1 μL cDNA模板及8.2 μL无酶无菌水。引物序列如表1所示。设置反应程序：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环40次扩增反应；记录熔解曲线。以β-actin为内参基因，使用Livak法计算即为mRNA相对表达量。每组技术重复3次，样本重复3次。1.4.9 含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨组织结构与功能的影响将软骨组织按照1.4.5分组干预7 d，每隔2 d更换培养基。干预结束后，用PBS清洗3次，室温固定于40 g/L多聚甲醛5 d，使用EDTA脱钙液室温脱钙7 d，第4天更换1次脱钙液。用PBS清洗3次，后续使用组织脱水包埋一体机对组织样本脱水、透明、浸蜡、包埋，在切片机上将石蜡块切成4 μm厚度切片，置于载玻片上烤干4 h。切片脱蜡至水，滴加甲苯胺蓝染液染色5 min，置于PBS缸内浸泡5 min。浸入体积分数95%乙醇缸内3 s后迅速捞出，重复此操作5次以分化染液。后续脱水、透明、中性树脂封固，使用数字病理切片扫描系统扫描后观察。使用Image J软件统计甲苯胺蓝平均染色强度。每组样本重复3次。
1.5 主要观察指标含Mn生物陶瓷粉体的体外H2O2清除率及对软骨细胞活性的影响，以及对氧化应激下软骨细胞活力、活性氧生成与血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5、蛋白聚糖mRNA表达的影响；含Mn生物陶瓷粉体对氧化应激下软骨组织结构与功能的影响。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析及绘图。结果数据使用x±s表示，采用单因素方差分析(AVOVA)及Tukey’s事后检验，P < 0.05视为差异有显著性意义。该文统计学方法已经北京大学第三医院生物统计学专家审核。

讨论

骨关节炎的发病及进展和诸多环境因素及遗传基因相关，病因学研究显示氧化应激和活性氧的过量表达是其中重要的一环[18]。静息的软骨细胞处于低氧状态，自身较少表达活性氧；而在应激条件下机体的氧化/抗氧化平衡被打破，活性氧过量表达，进而导致后续软骨病理损伤[19]。活性氧包括过氧化氢、羟基自由基及超氧阴离子等基团，它们主要是在线粒体内产生，相互之间可转化[20-21]。当活性氧产生增加时抗氧化系统被激活，过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等酶类物质可以催化过量的活性氧分解为无害的水及氧气，以此来维持内循环稳态[22]。生理条件下活性氧可以直接介导巨噬细胞清除病原体，也可以作为信号分子参与到细胞通路的激活中。在创伤、缺血或异常应力等病理环境下，软骨细胞氧化应激水平提高，过量的活性氧无法被抗氧化剂清除，便会激活炎症通路，进而促进炎症因子的表达和聚集，抑制软骨细胞外基质的合成并促进其降解，损伤线粒体正常功能，诱导软骨细胞的衰老和凋亡[23]。因此针对氧化/抗氧化失衡，对应清除活性氧或补充抗氧化剂是减轻骨关节炎进展的重要治疗策略。
既往研究表明，通过药物治疗清除过量产生的活性氧可以减轻软骨细胞的损伤及凋亡。关节腔内注射重组超氧化物歧化酶在动物模型上可以有效抑制骨关节炎的进展，但由于其免疫原性、半衰期短及生产成本较高的原因，并未在临床中应用[24]。一项有关大鼠骨关节炎模型的研究显示，使用超氧化物歧化酶模拟化合物可以显著降低氧化应激及活性氧水平，防止组织病理上的改变，但相应化合物仅能清除对应的超氧阴离子，而对其余类别的活性氧如过氧化氢、羟自由基无显著作用[25]。天然酶类抗氧化物如维生素C、褪黑素、天然植物提取物等也被广泛研究应用于清除氧化应激对骨关节的影响，细胞水平及动物模型的研究均显示，通过补充抗氧化剂减少活性氧的过量产生可以有效缓解骨关节炎的进展[26-28]。这些药物部分仅停留在体外实验水平，部分在长期临床随访中的治疗效果不尽如人意，这可能与药物生物稳定性较低、半衰期较短有关[29]。因而，具有类酶活性且能长期起效的纳米酶成为骨关节炎潜在的治疗药物。
Mn可参与到多种生物体内氧化还原反应中，比如作为超氧化物歧化酶2中的金属辅助基团发挥辅助清除活性氧的作用[30]，因此近些年有部分含Mn的新型抗氧化应激材料被陆续开发出来。目前金属基纳米酶研究中的Mn主要是以MnO2、Mn3O4等氧化物形态在医药领域进行表征实验[31-32]。此次实验参照XIAO等[33]的研究，通过熔盐法形成液态环境，使得镁黄长石微粒上均匀分散Mn2+。熔盐法常应用于化工领域中新型催化剂、陶瓷材料及光电材料的制备中[34-35]，但较少应用于生物医学工程领域内。在材料合成过程中，液态的熔融盐内反应物扩散速率较快，产生的强极化力使得镁黄长石表面形成较强的Mn-O键，有效防止金属原子聚集成团，从而减少活性氧的催化效率，保护镁黄长石结构免于破坏。单原子形式的金属材料表面积较高，其单位体积催化效率也随之升高。与先前的文献类似，新型含Mn生物陶瓷粉体在体外水平同样具有活性氧清除酶样能力；在软骨细胞实验中，也同样证实该材料可以清除软骨细胞产生的过量活性氧，对氧化应激下软骨细胞活性起到保护作用，并且该保护作用与材料的质量浓度呈正相关。既往的部分关于含Mn的抗氧化应激材料仅验证了其清除活性氧的能力以及抗炎能力，并未进一步探明确这些材料在骨关节炎中对软骨细胞的保护能力[36-37]，此次实验进一步完善新型含Mn生物陶瓷粉体对软骨细胞外基质的保护作用。蛋白聚糖作为软骨细胞外基质的重要组成部分，起到了软骨结构支撑和保护的作用[38]。而在氧化应激条件下，血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5等因子表达增加，降解蛋白聚糖并减少其生成，破坏软骨细胞外基质的稳态，从而加重软骨损伤[39]。此次实验使用含Mn生物陶瓷粉体干预氧化应激下的软骨细胞，结果显示该材料可以显著减轻血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5基因的表达，同时促进蛋白聚糖基因的表达，这表明含Mn生物陶瓷粉体削弱了氧化应激对软骨细胞外基质稳态的影响。软骨组织甲苯胺蓝染色进一步说明含Mn生物陶瓷粉体可以保护软骨组织的结构和功能，并且高质量浓度含Mn生物陶瓷粉体的效果优于低质量浓度含Mn生物陶瓷粉体，说明该粉体材料能有效减轻氧化应激所导致的软骨损伤。此外，既往的抗骨关节炎纳米材料需要较为复杂的结构组装才可实现其治疗效果，而这阻碍了相关材料的扩大生产及应用[40]，材料的粒径、电荷及药物负载量也易在扩大生产中发生变化[41]。而熔盐法制备的材料由于其工艺流程、均一性较强且生物陶瓷稳定性较强，不易被机体清除，可长期发挥治疗作用。
在聚焦于含Mn生物陶瓷粉体治疗效果的同时，新型材料的安全性也值得被关注。生物陶瓷本身具有良好的生物相容性，同时此次实验使用的镁黄长石载体也在既往研究中被验证具有安全性。金属Mn高浓度暴露下被报道具有神经毒性[42]，但用Mn制成的金属基纳米酶在适当浓度下无细胞毒性[43]。此次实验使用细胞活死染色评估不同质量浓度含Mn生物陶瓷粉体对软骨细胞的安全性，较为遗憾的是，结果显示保护效果较好的高质量浓度含Mn生物陶瓷粉体有可能对软骨细胞存在毒性，而保护效果较弱的低质量浓度含Mn生物陶瓷粉体则无明显软骨细胞毒性。因此，结合粉体材料治疗效果及细胞安全性的综合考量，作者更倾向于使用0.15 mg/mL的含Mn生物陶瓷粉体进行后续研究及治疗效果验证。在后续实验中将进一步在骨关节炎动物模型中研究含Mn生物陶瓷粉体的软骨保护效果，深入挖掘该材料清除活性氧治疗骨关节炎的分子机制，完成其生物代谢过程及安全性评估，寻找到治疗效果与生物安全的最佳平衡点。
综上所述，此次实验使用熔盐法制备了一种新型含Mn生物陶瓷粉体，通过化学材料与生物医学应用领域之间的交叉融合，探索更广泛的组织工程材料的制备方法。新型含Mn生物陶瓷粉体可以通过清除活性氧途径维持软骨细胞外基质稳态，从而对氧化应激下的软骨细胞发挥保护作用，同时为后续探寻临床治疗骨关节炎潜在应用奠定了研究基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

新型含Mn生物陶瓷粉体减轻软骨细胞的氧化应激损伤

Alleviation of oxidative stress damage in chondrocytes by a new Mn-containing bioceramic powder

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