生物3D打印仿生支架促进肩袖损伤后的愈合

doi:10.12307/2025.445

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (22): 4761-4770.doi: 10.12307/2025.445

• 细胞外基质材料 extracellular matrix materials • 上一篇下一篇

生物3D打印仿生支架促进肩袖损伤后的愈合

徐杰1，酒精卫1，刘海峰1，赵斌1，2

1山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030000；2骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，山西省太原市 030000

收稿日期:2024-03-23 接受日期:2024-05-18 出版日期:2025-08-08 发布日期:2024-12-06
通讯作者: 赵斌，博士，主任医师，山西医科大学第二医院骨科，山西省太原市 030000；骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，山西省太原市 030000
作者简介:徐杰，男，1996年生，安徽省六安市人，山西医科大学在读硕士，主要从事组织工程干细胞与肩袖损伤治疗的研究。
基金资助:
山西省卫健委重大科技攻关专项项目(2020XM11)，项目负责人：赵斌

Bio-3D printed bionic scaffold promotes healing after rotator cuff injury

Xu Jie1, Jiu Jingwei1, Liu Haifeng1, Zhao Bin1, 2

1Department of Orthopedics, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; 2Shanxi Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Repair, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China

Received:2024-03-23 Accepted:2024-05-18 Online:2025-08-08 Published:2024-12-06
Contact: Zhao Bin, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China; Shanxi Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Repair, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
About author:Xu Jie, Master candidate, Department of Orthopedics, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000, Shanxi Province, China
Supported by:
Shanxi Provincial Health Commission Major Science and Technology Research Project, No. 2020XM11 (to ZB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

明胶微载体：由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率> 90%，粒径大小可控于50-200 μm区间，均一度≤100 μm，可用于细胞的三维动态培养并实现细胞、病毒、细胞产物的收获，具有良好可降解性与生物相容性。
甲基丙烯酸化明胶：是一种由明胶和甲基丙烯酸酐反应得到的光敏性生物材料，具有生物相容性好、可见光固化、力学性能可控等特点，已被广泛应用于细胞3D培养、组织工程、生物3D打印等研究领域。

背景：大多数肩袖损伤发生于冈上肌腱，由于肌腱组织缺少血管以及肩袖复杂的解剖结构，临床治疗效果非常有限。组织工程技术和干细胞生物学的快速发展为提高肌腱修复质量带来了新的希望。

目的：通过生物3D打印技术制备人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架，观察该支架修复肩袖损伤的效果。
方法：①体外细胞实验：制备明胶微载体，将人脐带间充质干细胞接种于明胶微载体表面构建组织工程化干细胞。制备甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水，使用甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水重悬组织工程化干细胞，放入3D打印机的生物墨水容器中进行打印，蓝光照射固化5 min后即得人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架。通过死活染色、CCK-8实验检测支架内人脐带间充质干细胞的活性。②动物体内实验：采用随机区组设计方法将24只SD大鼠随机4组，每组6只：正常组不进行任何处理，肩袖损伤组、单纯支架组、细胞支架组建立冈上肌腱撕裂的肩袖损伤模型，单纯支架组、细胞支架组造模后分别将甲基丙烯酸酐化明胶支架、人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架植入肌腱损伤处。术后4周，分别进行大鼠行为学测试及肩袖冈上肌腱组织学病理组织形态观察。

结果与结论：①体外细胞实验：死活染色结果显示，明胶微载体可减轻3D打印过程对人脐带间充质干细胞造成的损伤，随着培养时间的延长，支架内的人脐带间充质干细胞存活率升高；CCK-8实验结果显示，随着培养时间的延长，支架内的人脐带间充质干细胞活性无明显变化。②动物体内实验：行为学测试结果显示，相较于肩袖损伤组、单纯支架组，细胞支架组大鼠四肢运动功能明显改善；肩袖冈上肌腱苏木精-伊红与Masson染色结果显示，相较于肩袖损伤组、单纯支架组，细胞支架组肌纤维排列较规律，无明显的炎性细胞浸润，胶原容积百分比降低；免疫荧光染色结果显示，相较于肩袖损伤组、单纯支架组，细胞支架组肩袖冈上肌腱内白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白表达明显降低。③结果表明，生物3D打印的人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架可促进肩袖损伤组织修复再生。

https://orcid.org/0009-0000-9727-3352(徐杰)；https://orcid.org/0000-0001-5360-6725 (赵斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 肩袖损伤, 冈上肌腱损伤, 人脐带间充质干细胞, 细胞治疗, 组织工程化干细胞, 生物支架, 甲基丙烯酸化明胶, 生物3D打印

Abstract: BACKGROUND: Most rotator cuff injuries occur in the supraspinatus tendon. Clinical treatment of rotator cuff injuries is very limited due to the lack of blood vessels and the complex anatomical structure of the rotator cuff. The rapid development of tissue engineering technology and stem cell biology has brought new hope for improving the quality of tendon repair.
OBJECTIVE: To prepare human umbilical cord mesenchymal stem cells/gelatin methacrylate composite scaffolds by bio-3D printing technology to observe the effect of this scaffold on repairing rotator cuff injury.
METHODS: (1) In vitro cell assay: The gelatin microcarrier was prepared. The tissue engineered stem cells were constructed by inoculating human umbilical cord mesenchymal stem cells on the surface of gelatin microcarrier. Gelatin methacrylate hydrogel printing ink was prepared. Tissue engineered stem cells were re-suspended with gelatin methacrylate hydrogel printing ink and put into the bio-ink container of 3D printer for printing. Human umbilical cord mesenchymal stem cells/gelatin methacrylate composite scaffold was obtained after 5 minutes of blue light irradiation and curing. The activity of human umbilical cord mesenchymal stem cells in scaffolds was detected by dead/alive staining and CCK-8 assay. (2) In vivo animal experiments: A random block design method was used to randomly assign 24 SD rats to 4 groups with 6 rats in each group. No treatment was given in the normal group. The rotator cuff injury model of supratinatus tendon tear was established in the rotator cuff injury group, the simple scaffold group, and the cellular scaffold group. The gelatin methacrylate scaffold and human umbilical cord mesenchymal stem cell/gelatin methacrylatecomposite scaffold were implanted into the tendon injury after the model was made in the simple scaffold group and the cellular scaffold group, respectively. Four weeks after operation, behavioral tests and histopathological morphology observation of supraspinatus tendon of rotator cuff were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro cellular assay: The dead/alive staining showed that gelatin microcarrier could reduce the damage of human umbilical cord mesenchymal stem cells caused by 3D printing process. With the extension of culture time, the survival rate of human umbilical cord mesenchymal stem cells increased in the scaffold. The results of CCK-8 assay showed that with the extension of culture time, the activity of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the scaffold did not change significantly. (2) In vivo animal experiments: Behavioral test results showed that compared with rotator cuff injury group and simple scaffold group, cellular scaffold group significantly improved limb motor function. The results of hematoxylin-eosin and Masson staining of rotator cuff supraspinatus tendon showed that compared with rotator cuff injury group and simple scaffold group, the muscle fiber arrangement in the cellular scaffold group was more regular; there was no obvious inflammatory cell infiltration, and the percentage of collagen volume decreased. The results of immunofluorescence staining showed that the expression levels of interleukin 6 and tumor necrosis factor α in the rotator cuff supraspinatus tendon were significantly decreased in the cellular scaffold group compared with the rotator cuff injury group and the simple scaffold group. (3) The results showed that bio-3D-printed cell scaffolds encapsulating human umbilical cord mesenchymal stem cells/gelatin methacrylate could promote tissue repair and regeneration of rotator cuff injuries.

Key words: rotator cuff injury, supraspinatus tendon injury, human umbilical cord mesenchymal stem cell, cell therapy, tissue engineered stem cell, biological scaffold, gelatin methacrylate, bio-3D printing

中图分类号:

徐杰, 酒精卫, 刘海峰, 赵斌. 生物3D打印仿生支架促进肩袖损伤后的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(22): 4761-4770.

Xu Jie, Jiu Jingwei, Liu Haifeng, Zhao Bin. Bio-3D printed bionic scaffold promotes healing after rotator cuff injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(22): 4761-4770.

图/表（结果） 6

2.1 明胶微载体与3D打印细胞支架的形态特征多达数万个微载体通过压缩得到实验使用的明胶微载体支架，最终呈多层片状结构(图2A)。将200 μL人脐带间充质干细胞悬液接种于明胶微载体上后，整片微载体膨胀而不散开(图2B)，接种2 h后将无血清培养添加至微载体上，微载体颜色变黄但仍呈圆形膨胀状态(图2C)，吹打均匀后的微载体均匀分布于培养皿中(图2D)。微载体细胞悬液与甲基丙烯酸酐化明胶打印墨水混匀后上生物3D打印机打印，打印过程中细胞支架状态良好没有松散塌陷(图2E)，打印完成后在显微镜明场下观察到微载体均匀地分布在支架上(图2F)。使用扫描电镜分别观察明胶微载体与细胞支架的显微结构，明胶微载体呈现疏松多孔蜂窝状，具有较高的孔隙率(大于90%)，这均为细胞的贴壁吸附提供了条件(图2G)；细胞支架具有格子状的多孔结构(图2H)，为细胞提供了支持并促进营养的扩散，并且孔隙之间的相互连接有利于细胞迁移和营养交换，其次支架的粗糙表面可增强细胞的附着和增殖，建立了稳定的细胞-支架界面。

2.2 微载体对打印过程中人脐带间充质干细胞活性的影响打印1 h后立即对支架进行活死染色以观察打印后细胞存活情况，可见不加微载体的细胞支架有大量死亡细胞，未见明显的活细胞；而采用微载体的细胞支架虽有一定数量的死亡细胞，但仍有一部分活细胞，见图3，说明明胶微载体有助于减轻打印过程对细胞造成的损伤。

2.3 人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架中的细胞活性活死染色结果显示，复合支架培养第1，3天的死亡细胞数量明显多于第5天，推测为起始打印过程中喷头挤压作用导致干细胞的机械性死亡，随着培养时间的延长，后续细胞状态得到改善，第5天支架上的大多数细胞存活(80%以上)，仅少量细胞死亡(图4A，B)。CCK-8实验检测结果显示，培养第1，3，5天的细胞活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4C。由此可见，三维支架培养环境可维持干细胞的活力，进一步说明该生物3D打印细胞架具有良好的生物相容性。

2.4 细胞支架修复大鼠肩袖损伤实验结果
2.4.1 实验动物数量分析 24只SD大鼠全部进入结果分析。
2.4.2 各组大鼠动物行为学测试术后4周使用CatWalk小动物步态仪对大鼠进行步态分析，大鼠自由通过固定跑道时摄像头能清晰记录四肢印迹(图5A，B)。正常组大鼠通过固定跑道时步态节律整齐；肩袖损伤组大鼠在通过跑道时节律紊乱，右前肢压力不均匀；单纯支架组大鼠步态节律较肩袖损伤组有所改善；相较于单纯支架组，细胞支架组大鼠上肢步态节律更齐(图5C)。与肩袖损伤组比较，单纯支架组大鼠站立时间、爪印面积、触地宽度均增加(P < 0.05，P < 0.01)，步幅时长减少(P < 0.05)；细胞支架组大鼠站立时间、爪印面积、步幅长度、触地宽度均增加(P < 0.01，P < 0.001)，摆动时长减少(P < 0.05)。与单纯支架组比较，细胞支架组大鼠站立时间、爪印面积与步幅长度均增加(P < 0.01，P < 0.001)，见图5D。

2.4.3 各组大鼠冈上肌腱苏木精-伊红与Masson染色结果苏木精-伊红染色结果显示，正常组冈上肌腱结构完整，肌细胞和细胞外基质组织保持良好状态；相比之下，肩袖损伤组冈上肌腱结构不完整，肌纤维排列混乱并伴有大量炎性细胞浸润及新生血管生成；单纯支架组肌纤维排列混乱，炎性细胞浸润较肩袖损伤组稍有所改善；细胞支架组肌纤维排列有序，无明显的炎症细胞浸润，见图6A。Masson染色结果显示，正常组肌纤维与胶原纤维排列整齐，肩袖损伤组肌纤维与胶原纤维排列紊乱，单纯支架组肌纤维与胶原纤维排列紊乱情况轻于肩袖损伤组，细胞支架组肌纤维与胶原纤维排列紊乱情况得到明显改善，见图6A。组织定量分析结果显示，肩袖损伤组组织学评分、胶原容积百分比显著高于正常组(P < 0.001)，单纯支架组、细胞支架组组织学评分、胶原容积百分比低于肩袖损伤组(P < 0.01，P < 0.001)，细胞支架组胶原容积百分比低于单纯支架组(P < 0.01)，见图6B，C。

2.4.4 各组大鼠冈上肌腱免疫荧光染色结果肩袖损伤组肌腱内白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白表达高于正常组(P < 0.001)，单纯细胞组、细胞支架组肌腱内白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白表达均低于肩袖损伤组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，细胞支架组肌腱内白细胞介素6、肿瘤坏死因子α蛋白表达均低于单纯支架组(P < 0.05，P < 0.01)，见图7。

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引言

肩袖是由冈上肌、冈下肌、小圆肌和肩胛下肌的肌腱附着于关节囊形成的包绕肱骨头的肌腱复合体，肩袖损伤通常由于退行性变、暴力作用或剧烈运动引起[1]，主要临床表现为肩部疼痛、肿胀以及肩关节运动受限等症状，绝大多数肩袖损伤发生于冈上肌腱，其中以肩袖冈上肌腱撕裂最为常见[2]。冈上肌腱撕裂损伤演变过程包括初始炎性反应阶段，即肌腱组织细胞变性和退行性改变，随后是肌腱纤维化和瘢痕形成阶段，此阶段常会限制冈上肌腱的血液供应，最后转化为功能障碍和运动局限性[3-4]。因此，早期干预和合适的康复措施对于减缓这一恶化趋势至关重要。肩袖修复手术已被证实能够显著缓解疼痛、增强肌力、促进功能恢复，但由于撕裂的肌腱组织缺乏血液供应，所以手术复发率高，修复效果并不理想[5]。因此，寻求有益于冈上肌腱恢复和再生的有效策略对临床治疗具有重大影响和意义。
组织工程技术和干细胞生物学的快速发展为提高肌腱修复质量带来了新的希望[6]。干细胞治疗被视为肌腱再生领域的一种充满希望的前沿方法，而获得足够数量的理想种子细胞是实现这一目标的前提和关键。肌腱干/祖细胞是肌腱组织最常见的细胞来源，在体内肌腱损伤修复方面取得了良好结果[7-8]，但肌腱干/祖细胞中调控肌腱细胞谱系表型的基因——转录因子Scleraxis在体外培养过程中会逐渐丢失，导致肌腱干/祖细胞分化和基质沉积发生改变，最终严重影响肌腱干/祖细胞的疗效[9]，故寻找肌腱干/祖细胞的替代细胞成为当前研究的热点。人脐带间充质干细胞采集过程无痛苦，细胞增殖速度快，自我更新能力强，并且具有较高的细胞活性与较低的免疫原性[10]，已被用于促进鼠子宫内膜再生及脊髓损伤的恢复[11-12]。人脐带间充质干细胞可抑制组织细胞的炎症反应和成肌腱分化，从而平衡胶原纤维的合成和分解过程，重塑肌腱结构，恢复肌腱生物力学性能[13-15]；同时，人脐带间充质干细胞可通过旁分泌功能改善肌腱组织重塑微环境，增强肌腱特异性基质成分[16]，由此推测人脐带间充质干细胞可能是肌腱组织工程中理想种子细胞来源。但人脐带间充质干细胞在体内应用仍面临细胞定位的不可控性、移植后的低存活率和植入效率低等问题[17]。
组织工程技术是利用干细胞、支架材料和生长因子3种关键要素来修复或替代受损器官或组织的一种新型技术[18]，其中支架作为干细胞的载体有效解决了干细胞在体内定植和存活率低的问题，同时支架作为连接干细胞和组织的桥梁，可在体内将细胞分泌因子运输到损伤部位并作为一个持续释放体。组织工程支架有三维海绵、水凝胶、电纺丝薄膜等多种形式。明胶微载体的出现加速了细胞二维培养向三维培养的转变，增加了细胞间的沟通连接，并且具有适宜的空间结构和孔隙率，这为干细胞的黏附、扩增和分化提供了适宜的环境[19-20]；同时微载体较软的基质刚度通过机械刺激进一步影响干细胞的定向分化与旁分泌功能[21]，这为干细胞在组织工程中的成功应用提供了有力条件[22-23]。
肌腱组织是由可溶性Ⅰ型胶原蛋白分子在分泌并交联成胶原微原纤维后自发组装形成并呈现出波浪卷曲形态的有序排列，而瘢痕组织的形成会导致损伤肌腱组织的排列序向性与生物力学特性发生改变[24]。由于肌腱组织特殊的生理结构，单一的微载体联合干细胞在体内并不能完全实现对损伤部位的精准递送和延续肌腱组织的序向性修复效果。
生物3D打印是组织工程中的一项创新技术，能够精确制备出细胞或因子均匀分布的生物材料，以构建具有复杂功能的活体组织[25-26]。至今，生物3D打印已被用于构建多种组织和器官，包括心脏、骨骼、软骨和骨骼肌[27-29]。生物3D打印具有将孔径和孔隙率控制在微米级的优势，可为干细胞生长提供良好的微环境；此外，逐层打印方式可通过在计算机中设置不同的孔径和使用不同比例原材料的生物打印墨水来实现纵向的分层结构和组成，这种结构可以在很大程度上避免支架塌陷，而将该技术联合微载体后能够改善微载体的不足，具有极大的应用前景，但其安全性及有效性仍需进一步验证。
此次实验将人脐带间充质干细胞接种在微载体上并结合生物3D打印技术构造一种用于冈上肌腱再生微环境的人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架，通过体外细胞培养实验分析3D打印支架对人脐带间充质干细胞活性的影响，通过体内动物实验评估该支架对损伤冈上肌腱修复的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，随机对照动物实验，组间比较采用单因素(ANOVA)方差分析和t检验。
1.2 时间及地点实验于2023年1-12月在山西医科大学第二医院骨科基础实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雄性SD大鼠24只，8周龄，体质量200-250 g，购自山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(晋)2019-0004，饲养环境：屏障环境。动物实验获得山西医科大学第二医院动物福利伦理委员会批准(伦理号：DW2024017)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，所有操作最大限度地减少其痛苦和死亡。
1.3.2 细胞人脐带间充质干细胞购自北京华龛生物有限公司(批号：HK-QD-P2)。
1.3.3 主要试剂明胶、戊二醛、硼氢化钠、聚乳酸购自美国Sigma公司；聚甲基丙烯酸甲酯板购自美国Sunjin Electronics Co公司；甲基丙烯酰化明胶[批号：R201(A-F)]、光引发剂LAP(批号：R101A)购自上海华夏司印生物有限公司；干细胞专用培养基购自北京华龛生物有限公司(批号：RMZ010-GY)；活死染色试剂盒购自中国贝博生物有限公司(批号：BB23101)；PBS购自杭州慧颖生物有限公司(批号：SH30256.01B)；CCK-8试剂盒购自南京沃博生物科技有限公司(批号：C4018-1ML)，白细胞介素 6 抗体(批号：NB600-1131SS)、肿瘤坏死因子α抗体(批号：NBP1-19532SS)购自NOVUS生物公司；苏木精及伊红染液(批号：G1120)、Masson 染液试剂盒(批号：# G1340)购自中国索莱宝有限公司。
1.3.4 主要仪器细胞培养箱购自美国Thermo公司(批号：BB150)；荧光倒置显微镜购自德国Leica公司(批号：DMi8)；细胞超净工作台购自上海力申科学仪器有限公司(批号：HFsafe-1200)；高速离心机购自于德国Eppendorf公司(批号：5810R)；激光雕刻机购自澳大利亚Rayjet Laser System公司；石蜡切片机购自德国Leica公司(批号：ArcadiaH+C ArcadiaH+C)；细胞3D打印机购自于上普博源(北京)生物科技有限公司(批号：SunP ALPHA-CPT2)；小动物步态分析仪购自诺达思(北京)信息技术公司(批号：Noldus Catwalk)；酶标仪购自上海赛默飞世尔科技(批号：Thermo-51119000)；扫描电子显微镜购自日本日立高科技公司(批号：S-4800)。
1.4 实验方法
1.4.1 明胶微载体的制备使用干细胞专用培养基制备4%明胶溶液，以形成预设的明胶微载体支架溶液，于冰上向预设的明胶微载体支架溶液中加入0.3%戊二醛溶液使其充分混合，获得明胶微载体支架聚合物溶液。利用激光雕刻机对聚甲基丙烯酸甲酯板进行精细雕刻，雕刻完成后将聚甲基丙烯酸甲酯板置于等离子体清洗器中进行表面活性处理100 s。将明胶微载体支架聚合物溶液缓慢注入聚甲基丙烯酸甲酯板的圆柱体孔洞中，置于-20 ℃环境中冷冻16 h以成型；成型后放入冷冻干燥机中(-50 ℃，20 Pa)进行3 h的干燥处理，以便获得多孔结构。采用0.1 mol/L NaBH4溶液对明胶微载体支架进行清洗，以清除残余的戊二醛溶液。使用去离子水清洗并将明胶微载体支架铺设为单层排列进行预冷处理，置入冷冻干燥机中进行干燥处理(-50 ℃，20 Pa，干燥30 h)，得到明胶微载体支架。通过扫描电子显微镜观察明胶微载体的微观形态。
1.4.2 人脐带间充质干细胞的培养采用人脐带间充质干细胞专用无血清培养体系培养细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中静置培养。每3 d换液1次，镜下观察细胞融合达80%后按1∶3比例进行传代。选取第3-5代干细胞用于实验。
1.4.3 人脐带间充质干细胞与明胶微载体的体外结合取明胶微载体置入6孔板中待用，在6孔板的孔隙中添加2.0-3.0 mL PBS以构建湿盒环境。取第4代人脐带间充质干细胞，消化后离心(1 200 r/min，5 min)并重悬，调整细胞浓度为3×109 L-1。将200 μL人脐带间充质干细胞悬液接种于明胶微载体上，随后置于细胞培养箱中培养，2 h后向每孔中添加干细胞专用培养基4 mL，隔天更换培养基，用于后续实验。
1.4.4 甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水的制备将甲基丙烯酸酐化明胶粉末溶解在无血清培养基中，在70 ℃水浴锅中水浴4 h，得到100 g/L甲基丙烯酸酐化明胶溶液。将0.25%光引发剂LAP加入到甲基丙烯酸酐化明胶溶液中，充分振荡，置于60 ℃水浴锅中反应 2 h，得到100 g/L甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水。
1.4.5 甲基丙烯酸酐化明胶支架的制备将2 mL甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水倒入细胞3D打印机的生物墨水容器中，设置好参数(支架建模为立方体，喷嘴直径0.3 mm，喷射压强2 060 kPa，喷射时间4 001 200 μs，喷射点距0.050.07 mm)，自动打印支架完成后，蓝光固化支架5 min，得到甲基丙烯酸酐化明胶支架，置于培养基中用于后续实验。
1.4.6 人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶支架的制备人脐带间充质干细胞与明胶微载体体外结合培养3 d后，用巴士管吸取4 mL细胞悬液于10 mL离心管中，800 r/min离心1 min后弃上清，用2 mL甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶打印墨水重悬细胞(细胞数量6×105)，将充满细胞的生物墨水倒入3D打印机的生物墨水容器中，设置好参数(层高0.35 mm，直线距离1.5 mm，打印速度2.0 mm/s，挤压速度0.2 mm3/s，连续运动30 mm/min)，自动打印支架完成后，蓝光固化支架5 min，得到人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶细胞支架，置于细胞培养箱内培养，隔天更换培养基，用于后续实验。同理制备未加入明胶微载体的人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架。
1.4.7 支架内人脐带间充质干细胞的活性检测
支架死活染色：用高压灭菌(0.15 MPa，30 min)后的显微镊夹取加入明胶微载体的人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架于48孔板中，用PBS清洗3次；将细胞活死染色工作液加入48孔板中浸没支架，置于细胞温箱孵育30 min，吸出工作液，用PBS清洗支架3次，置于荧光显微镜下观察支架上的细胞活死情况。
CCK-8实验：将人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架放入48孔板内培养。培养1，3，5 d后，去除48孔板中无血清培养基，用PBS清洗1次，每孔加入500 μL CCK-8工作溶液孵育2 h；吸取10 μL上清液转移至96孔板中，使用酶标仪检测450 nm处的吸光度值。每个时间点样本量为3个。
1.4.8 细胞支架修复大鼠肩袖损伤
实验动物分组：采用随机区组设计方法将24只SD大鼠随机分为正常组、肩袖损伤组、单纯支架组与细胞支架组，每组6只。除正常组外，其他3组建立冈上肌腱撕裂的肩袖损伤模型。

冈上肌腱撕裂的肩袖损伤模型构建与分组干预：腹腔注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉大鼠，使用剃毛刀剔除手术区域的毛发并用碘伏进行消毒，于右侧肩部外侧切开皮肤，纵行切开三角肌，逐层分离直至显露肱骨大结节后即找到冈上肌腱，用无菌刀片撕裂冈上肌腱造成冈上肌腱撕裂的肩袖损伤模型，使用无菌显微镊将撕裂处稍撑开，单纯支架组与细胞支架组分别将甲基丙烯酸酐化明胶支架、人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架植入冈上肌腱撕裂的缺损窗口处，逐层缝合切口。肩袖冈上肌腱撕裂模型建立方法见图1。

行为学测试：术后4周，采用小动物步态分析仪检测大鼠运动功能恢复情况。将大鼠转移至空鼠盒内，避光环境下将鼠盒置于步态仪后端的鼠盒托架中，为大鼠建立一个熟悉的步态环境。用体积分数10%乙醇擦拭步态玻璃板后，将大鼠放置于提前设定好大鼠步态参数(跑道宽度，摄像机增益，红光电压，绿光电压，绿光强度阈值，采集速度范围，采集脚印数量，采集持续时间范围)的仪器玻璃板跑道上，在大鼠匀速通过固定检测区域跑道时，依据大鼠通过固定跑道时四肢产生的压力可检测其通过跑道过程中大鼠步态特征(站立时间，摆动时长，步幅长度，触地宽度，脚爪面积，步幅时长)。每组记录3次合格的运动，得到3组数据作为测量结果。
组织学观察：行为学测试完成后，过量麻醉处死大鼠，于肱骨大结节冈上肌腱止点处横断冈上肌腱组织，置入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，组织脱水、石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红、Masson染色染色，观察组织修复与胶原纤维分布情况。使用Image J软件分析胶原容积分数。根据组织纤维结构、纤维排列、核圆度、炎症细胞、血管数量、细胞数量进行组织学评分[30]，评分越高说明修复效果越差。
免疫荧光染色：组织切片脱蜡、脱水，37 ℃加入胃蛋白酶抗原修复50 min，用PBS清洗3次后吸水纸吸干，滴加山羊血清封闭1 h，滴加兔抗大鼠肿瘤坏死因子α及白细胞介素6抗体(稀释比均为1∶100)4 ℃孵育过夜；次日用PBS冲洗3次，滴加相应荧光二抗后避光室温孵育1 h；清洗吸水纸吸干，加入DAPI复染细胞核 20 min，用PBS冲洗3次后加入抗荧光淬灭剂，封固剂封固，置于荧光显微镜下观察。使用Image J软件分析荧光表达量。
1.5 主要观察指标人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架中的细胞活性，以及该支架修复大鼠肩袖损伤的效果。
1.6 统计学分析使用SPSS 21.0软件进行统计分析，实验结果以x±s表示，组间比较采用单因素(ANOVA)方差分析和t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。使用GraphPad Prism 9.0 软件进行图片处理。文章的统计学方法已由山西医科大学统计学专家审核。

讨论

此次实验提出并构建了一种生物3D打印联合干细胞的细胞支架，体外培养结果表明，负载人脐带间充质干细胞的甲基丙烯酸酐化明胶支架在体外维持了良好的细胞活性及增殖能力，随后通过手术构建急性肩袖损伤冈上肌腱撕裂动物模型，细胞支架植入治疗4周后可显著抑制炎症反应，促进动物功能的恢复，充分发挥了生物3D打印技术与干细胞疗法的协同作用。
冈上肌腱是连接肩部肌肉和骨骼的重要结构，它承担着支撑和稳定肩关节的重要功能。肩袖损伤是导致肩关节疼痛及功能障碍的常见原因，其中肩袖肌腱撕裂是引起肩痛的最常见原因之一，绝大多数肩袖损伤肌腱撕裂发生在冈上肌腱。冈上肌腱的愈合过程是一个复杂的生物学过程，涉及到多种细胞和分子的相互作用，其中一些主要因子包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6等，它们在肩袖损伤发生后迅速释放并引发局部炎症反应，激活免疫细胞[31-32]。现有的肌腱组织工程研究主要集中在肌腱组织的愈合过程上，忽略了早期阶段抑制炎症反应的过度激活。早期干预炎症有利于加速炎症的消退、增强成纤维细胞的增殖能力以及协调细胞外基质的有效重构，加速受损组织的修复过程。已有研究表明，人脐带间充质干细胞可通过抑制炎症递质的释放和炎症细胞的激活调节炎症反应，从而减轻组织损伤[33-35]。
组织工程支架修复肩袖损伤是现阶段的研究热点，干细胞接种与定位是组织工程的关键步骤，允许细胞直接附着在支架上并最终在支架上生长的静态接种已被广泛采用，组织工程支架构建的关键是如何将种子细胞接种培养到支架上。通常情况下，种子细胞在支架表面培养，随后在支架材料的物理作用下细胞完全迁移到支架孔内，此类方法接种率低，体外培养过程中细胞容易脱落[36]。此外，现有的组织工程支架均有一定的缺陷，例如：三维海绵难以实现不规则形状缺损的完全填充，水凝胶缺乏细胞黏附点，电纺丝薄膜细胞黏附空间有限、力学性能较差、修复速率慢等。为此，此次实验将干细胞接种于微载体上，微载体已被用于促进间充质干细胞的增殖，以响应干细胞在细胞治疗和组织工程等众多应用中不断增长的需求[37-38]。相比较传统的2D平面细胞培养，微载体的3D结构在一定程度上挽救了细胞的行为和生物学功能[39]，其多孔结构和高表面积体积比模拟了体内微环境并建立起有效和多向的细胞-细胞、细胞-细胞外基质相互作用[40-41]，实现高效3D细胞附着培养；细胞-细胞黏附作用可在微载体上形成多细胞球体，这种多细胞球体不仅维持了细胞之间的相互作用，而且可作为营养成分和生长因子渗透的迁移桥梁[41]。但针对肩袖损伤的具体部位，如冈上肌腱撕裂部位，需要精准的植入定位，以确保干细胞能够有效地与宿主沟通并发挥其修复功能；同时考虑到肌腱组织特殊的生理结构以及机械特性，单一的微载体并不能很好地在体内锚定在损伤部位并发挥机械负荷作用，因此联合使用具有生物可降解性和机械强度的组织工程支架至关重要。支架在损伤部位提供暂时的支持，直到新组织已经建立到能够发挥功能和承受负荷的状态，这样的复合支架能在组织再生和机械性能之间取得适当平衡，重建肌腱组织修复的序向性。
生物3D打印技术可以利用生物材料模拟细胞外基质，与细胞混合制成生物墨水后打印成3D生物支架。生物3D打印技术具有可定制性和高度灵活性，打印出的生物支架可以更好地复现受损肌腱的原有功能和结构，在组织工程支架构建上体现出无可比拟的优势。在组织工程研究中，使用与天然细胞外基质相似的水凝胶来刺激细胞形成具有机械完整性的功能组织，以确保移植物在植入后存活。甲基丙烯酸酐化明胶作为一种生物相容性好、可生物降解的多功能基质[42-43]，已被用于设计从脉管系统到软骨和骨骼的组织类似物[43-45]。与其他水凝胶相比，甲基丙烯酸酐化明胶突出的优点是力学性能可受多种因素调节，如甲基丙烯酸酐化明胶浓度、光引发剂的种类和光交联次数等[46]，因此3D打印甲基丙烯酸酐化明胶支架具有良好的机械性能，能在体内模拟正常肌腱组织的生物力学特性。另外，甲基丙烯酸酐化明胶和微载体都是明胶来源，这有利甲基丙烯酸酐化明胶包封明胶微载体细胞微球，为细胞提供良好的黏附点。利用基于甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶的墨水对细胞进行3D打印，可以将细胞直接嵌入到支架结构中，这已成为组织工程研究中一种有吸引力的方法[47-48]。
此次实验将干细胞治疗与3D打印技术相结合，将人脐带间充质干细胞接种于明胶微载体上进行广泛的细胞扩增，将负载干细胞的微载体封装于甲基丙烯酸酐化明胶墨水中进行活细胞生物3D打印，实现细胞与支架的一体化，以提高细胞存活率并实现细胞在支架上的均匀分布。相较于传统的活细胞3D打印，此次实验将干细胞提前接种于微载体上，微载体的三维多孔结构不仅为干细胞的黏附、扩增和分化提供了适宜环境，而且可以保护细胞在打印的过程中免受剪切力而导致的细胞死亡[49]。体外培养实验结果表明，3D打印细胞支架可以维持良好的细胞活性并具有良好的细胞相容性，可以作为安全的组织工程材料。
通过大鼠急性肩袖损伤模型进一步评估了3D打印细胞支架的治疗效果，结果显示：冈上肌腱损伤部位植入细胞支架4周后大鼠运动行为学测试、组织病理学得到显著改善，单纯植入支架虽可一定程度缓解冈上肌腱损伤情况，但不及细胞支架组；免疫荧光染色结果显示，生物3D打印人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架在肌腱愈合过程中可抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素6炎症递质的表达，减轻肩袖冈上肌腱的炎症反应。明胶微载体为人脐带间充质干细胞在支架上附着提供了良好的黏附点，有效地支持干细胞的附着和生长并实现在支架上的均匀分布，支架为人脐带间充质干细胞提供了稳定的三维支撑框架，支架的孔隙结构直接影响干细胞的迁移、增殖和分化，为细胞生长和组织形成创造了良好的微环境；细胞支架能够将干细胞局限在损伤部位，延续肌腱组织的序向性修复效果，从而促进冈上肌腱再生。
该实验有一定局限性，设计的甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶支架虽然具有生物活性和快速光交联的物理化学特性，但其机械性能还是相对较弱，缺乏足够的强度和硬度，应考虑对其加以修饰，以调节各种特性，例如物理强度、化学性质和孔隙率等；在进行动物体内取材时未研究甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶支架在体内的降解情况；仅在啮齿动物体内进行实验，未来应开展中、大型动物实验研究。
综上所述，生物3D打印的人脐带间充质干细胞/甲基丙烯酸酐化明胶复合支架具有良好的生物相容性，能够加速大鼠肩袖损伤的修复，改善大鼠运动功能，这一效果归因于其抑制胶原容积和局部炎症微环境的作用。组织工程已成为肩袖损伤的一种新治疗策略，生物3D打印技术有望将关键要素整合到支架设计过程中，在特定的三维层次结构中构建出多元化支架。总之，未来的多学科研究和创新有望改善3D打印技术在组织工程和再生医学中的应用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

生物3D打印仿生支架促进肩袖损伤后的愈合

Bio-3D printed bionic scaffold promotes healing after rotator cuff injury

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