白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病

doi:10.12307/2025.512

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (23): 4878-4887.doi: 10.12307/2025.512

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白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病

冯乙芮1，高天芸2，王亚萍3，黄亚红4，王斌2

1南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室，南京大学生命科学学院，江苏省南京市 210008；2南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室，江苏省南京市 210008；3临床干细胞研究室，南京鼓楼医院，南京中医药大学鼓楼临床医学院，江苏省南京市 210008；4南京大学生命科学学院，江苏省南京市 210008

收稿日期:2024-04-07 接受日期:2024-06-26 出版日期:2025-08-18 发布日期:2024-09-27
通讯作者: 王斌，博士，教授，研究员，南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究室，江苏省南京市 210008；并列通讯作者：黄亚红，博士，副教授，南京大学生命科学学院，江苏省南京市 210008
作者简介:冯乙芮，女，1998年生，重庆市人，汉族，南京大学在读硕士，主要从事间充质干细胞临床应用的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82070459，82270701)，项目负责人：王斌

Interleukin-10 engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells for superior treatment of inflammatory bowel disease

Feng Yirui1, Gao Tianyun2, Wang Yaping3, Huang Yahong4, Wang Bin2

1Clinical Stem Cell Research Laboratory of Gulou Hospital Affiliated to Nanjing University School of Medicine, School of Life Sciences of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 2Clinical Stem Cell Research Laboratory of Gulou Hospital Affiliated to Nanjing University School of Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 3Clinical Stem Cell Research Laboratory, Nanjing Gulou Hospital, Gulou Clinical School of Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 4School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Received:2024-04-07 Accepted:2024-06-26 Online:2025-08-18 Published:2024-09-27
Contact: Wang Bin, MD, Professor, Researcher, Clinical Stem Cell Research Laboratory of Gulou Hospital Affiliated to Nanjing University School of Medicine, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; Co-corresponding author: Huang Yahong, MD, Associate professor, School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Feng Yirui, Master candidate, Clinical Stem Cell Research Laboratory of Gulou Hospital Affiliated to Nanjing University School of Medicine, School of Life Sciences of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82070459 and No. 82270701 (to WB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

基因修饰：利用生物化学方法特异性改变遗传物质，将目的基因片段导入宿主细胞内，或者将特定基因片段从基因组中删除，高效而精准地实现基因插入、缺失或替换，从而改变其遗传信息和表现型特征，达到改变宿主细胞基因型或者使原有基因型得到加强的作用。
炎症性肠病：指原因不明、难以治愈的一组非特异性慢性胃肠道炎症性疾病，表现为消化道发炎引起的腹痛、腹泻和血性腹泻，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，克罗恩病可累及消化道的任何部位，而溃疡性结肠炎几乎仅累及结肠。

摘要
背景：间充质干细胞来源广泛、易体外增殖，并可分泌一系列免疫调节因子抑制炎症、促进组织修复再生，广泛应用于各种疾病治疗研究。但是对于多种疾病，间充质干细胞的治疗效果有限。针对疾病特定发病机制或者干预靶点进行工程化修饰间充质干细胞是未来细胞治疗的重要发展方向。
目的：白细胞介素10是一种典型的抗炎细胞因子，有助于调节免疫反应并诱导巨噬细胞向抗炎表型极化，该研究探讨白细胞介素10基因工程化修饰人脐带间充质干细胞对炎症性肠病的治疗效果。
方法：通过电转染建立稳定过表达人白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞，并基于细胞治疗产品标准筛选出临床级细胞。给予C57BL/6J小鼠自由饮用5%葡聚糖硫酸钠盐水溶液建立急性结肠炎模型，分别在造模前1 d(尾静脉途径)与造模后第4天(腹腔途径)注射空质粒转染的人脐带间充质干细胞或过表达人白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞(1×106个/只)。在造模后第6天取结肠组织进行苏木精-伊红染色评估组织学变化，免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原与CD31的表达。

结果与结论：构建的稳定过表达白细胞介素10的工程化人脐带间充质干细胞，满足临床级人脐带间充质干细胞质量标准；人脐带间充质干细胞对小鼠急性结肠炎具有修复效果，过表达白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞的治疗效果更加优效，更显著地抑制急性结肠炎小鼠的体质量下降(P < 0.05)、结肠缩短(P < 0.05)以及结肠组织损伤(P < 0.05)；过表达白细胞介素10基因人脐带间充质干细胞组结肠组织切片中增殖细胞核抗原阳性细胞与CD31阳性细胞显著多于人脐带间充质干细胞组，表明过表达白细胞介素10基因的人脐带间充质干细胞可能通过显著促进肠组织细胞增殖和血管再生进而促进结肠组织修复。

https://orcid.org/0000-0003-3981-8849 (王斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 白细胞介素10, 人脐带间充质干细胞, 工程化修饰间充质干细胞, 炎症性肠病, 再生修复, 细胞增殖, 肠再生

Abstract: BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have been widely used in the treatment of various diseases due to their wide range of sources, their ease of proliferation in vitro and their ability to secrete a range of immunomodulatory factors to suppress inflammation and promote tissue repair and regeneration. However, in the treatment of many diseases, the therapeutic effect is limited. The effort to engineer and modify mesenchymal stem cells for specific disease pathogenesis or intervention targets is an important development for cell therapy in the future.
OBJECTIVE: Interleukin-10 is a typical anti-inflammatory cytokine that helps to modulate the immune response and induces macrophage polarization towards an anti-inflammatory phenotype. This study investigated the therapeutic effect of interleukin-10 engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells on inflammatory bowel disease.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells stably overexpressing interleukin-10 were established by electro-transfection, and screened for clinical-grade cells based on the cell therapy product criteria. C57BL/6J mice were given 5% aqueous dextran sulfate sodium ad libitum to establish a model of acute colitis. Empty plasmid-transfected human umbilical cord mesenchymal stem cells or interleukin-10-human umbilical cord mesenchymal stem cells (1×106 cells/each mouse) were injected on day 1 before modeling (tail vein injection) and day 4 (intraperitoneal injection) after modeling, respectively. On day 6 after modeling, colon tissue sections were taken for hematoxylin-eosin staining to assess histological changes. Immunofluorescence staining was performed to detect the expression of proliferating cell nuclear antigen and CD31.
RESULTS AND CONCLUSION: The engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells stably overexpressing interleukin-10 were constructed, and met the quality standard of clinical-grade human umbilical cord mesenchymal stem cells. Human umbilical cord mesenchymal stem cells could repair acute colitis in mice. The therapeutic effect of interleukin-10-human umbilical cord mesenchymal stem cells was more efficacious, which more significantly suppressed body weight loss (P < 0.05), colon shortening (P < 0.05), and damage of colonic tissues (P < 0.05) in acute colitis mice. In interleukin-10-human umbilical cord mesenchymal stem cell treatment group, there were significantly more proliferating cell nuclear antigen-positive cells and CD31-positive cells in the colon sections than in the human umbilical cord mesenchymal stem cell treatment group, suggesting that interleukin-10-overexpressing human umbilical cord mesenchymal stem cells contributed to the repair of colon tissue by significantly promoting the proliferation of intestinal tissues and angiogenesis.

Key words: interleukin-10, human umbilical cord mesenchymal stem cell, engineered mesenchymal stem cell, inflammatory bowel disease, regeneration and repair, cell proliferation, intestinal regeneration

中图分类号:

冯乙芮, 高天芸, 王亚萍, 黄亚红, 王斌. 白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4878-4887.

Feng Yirui, Gao Tianyun, Wang Yaping, Huang Yahong, Wang Bin. Interleukin-10 engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells for superior treatment of inflammatory bowel disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(23): 4878-4887.

图/表（结果） 3

2.1 成功构建IL10-UCMSCs并符合间充质干细胞的通用评价标准 成功构建了过表达白细胞介素10的UCMSCs，并从多个细胞克隆中挑选出高表达白细胞介素10的细胞株，分别收集第11，13，15代细胞培养上清，ELISA检测白细胞介素10的表达水平，结果显示IL10-UCMSCs克隆高水平表达白细胞介素10，尽管白细胞介素10分泌水平随着代数的增加而有所下降，但仍保持较高的表达水平，见图2A，B。
电转染并未改变UCMSCs的细胞形态，电转染前间充质干细胞(第6代)与构建的IL10-UCMSCs(第6代)的细胞形态相似。进一步对细胞表面标志物进行分析，IL10-UCMSCs表面标记物CD73、CD90和CD105呈阳性(大于95%)，CD19、CD34、CD11b、CD45和HLA-DR呈阴性(小于2%)，与未电转染的UCMSCs一致，见图3A，B。通过茜素红染色、油红O染色检测IL10-UCMSCs的分化潜力，结果显示白细胞介素10基因修饰的UCMSCs依然保持多谱系分化能力，见图4A，B。
CCK-8结果显示IL10-UCMSCs与UCMSCs增殖能力相近，过表达白细胞介素10并未对UCMSCs的增殖能力产生影响，见图5。
为了研究IL10-UCMSCs的成瘤性，皮下注射IL10-UCMSCs到严重联合免疫缺陷小鼠的双颈部，小鼠无成瘤，其主要器官(包括肺、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、皮肌)苏木精-伊红染色均未观察到肿瘤组织或者肿瘤细胞浸润，见图6。
将UCMSCs和IL10-UCMSCs与RAW264.7细胞共培养48 h，q-PCR检测RAW264.7细胞中炎症相关因子mRNA水平的表达，见图7。IL10-UCMSCs对促炎因子白细胞介素6和白细胞介素1β的表达具有更强的抑制作用，对抗炎因子白细胞介素10的表达具有更强的促进作用，由此说明IL10-UCMSCs具有更强的抗炎特性。

2.2 IL10-UCMSCs优效治疗葡聚糖硫酸钠盐诱导的小鼠急性结肠炎模型 葡聚糖硫酸钠盐造模成功的小鼠主要表现为腹泻、粪便黏稠、肉眼血便以及体质量减轻。造模组明显的体质量减轻与疾病活动指数评分升高证明5% 葡聚糖硫酸钠盐自由饮水成功诱导了C57BL/6J小鼠急性结肠炎。UCMSCs组与IL10-UCMSCs组都有效抑制了小鼠的体质量下降，其中IL10-UCMSCs组表现出更为明显的抑制效果，见图8A。结肠炎会使结肠长度缩短，PBS组小鼠的结肠最短，UCMSCs组和IL10-UCMSCs组小鼠的结肠长度都明显恢复，但二者相比之下，IL10-UCMSCs的缓解更为突出，见图8C，D。疾病活动指数评分进一步说明IL10-UCMSCs治疗相较于UCMSCs表现更为优效，见图8B。
2.3 IL10-UCMSCs治疗更显著地减少肠道损伤并促进结肠组织再生修复 结肠组织病理切片苏木精-伊红染色结果显示，葡聚糖硫酸钠盐可致小鼠结肠中免疫细胞大量浸润、杯状细胞缺失和隐窝破坏，而这些症状通过UCMSCs和IL10-UCMSCs治疗得到显著恢复，并且IL10-UCMSCs治疗组小鼠结肠的破坏程度更轻，见图9A-E。
增殖细胞核抗原是一种DNA聚合酶的辅助蛋白，与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，可作为细胞增殖状态的指标。用免疫荧光染色结肠切片中的增殖细胞核抗原阳性细胞，发现UCMSCs和IL10-UCMSCs都促进了肠道损伤后的组织修复，而IL10-UCMSCs表现出更为明显的促增殖作用，见图10A-E。
CD31是血管内皮分化标志物，通过免疫荧光染色发现UCMSCs组与IL10-UCMSCs组相比于造模组，结肠组织中CD31阳性的内皮细胞数量显著增加以及平均血管面积增加，表明UCMSCs和IL10-UCMSCs促进了结肠部位的血管生成，其中IL10-UCMSCs的促血管生成作用更为明显，见图11A-E。

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引言

炎症性肠病是一种病因不明、无法治愈的全球性疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其特征是肠黏膜的非特异性炎症，临床特征包括腹痛、腹泻、便血、发烧，反复复发和缓解[1]。炎症性肠病的自然病程高度个体化，因疾病阶段不同，表现从无症状或轻度反应到手术、残疾甚至导致死亡[2]。目前尚不清楚炎症性肠病的确切病因，但多种因素(包括遗传易感性、肠道微生物组变化、先天性和适应性免疫系统缺陷以及各种环境暴露)可能导致这种疾病[3]。炎症性肠病的传统治疗药物主要包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素以及甲氨蝶呤等免疫抑制剂。5-氨基水杨酸可阻断前列腺素及白三烯的生成以降低肠道炎症；糖皮质激素可抑制免疫系统，常用于治疗炎症性肠病的急性发作，但不适用于维持治疗；免疫抑制剂调节人体免疫系统，从而抑制炎症，但长期使用免疫抑制剂会带来一系列不良反应(感染、出血、患癌)风险增高。除此之外，越来越多的生物制剂和新型小分子治疗药物如抗肿瘤坏死因子α抗体得到了开发与应用，但仍有大量患者难以通过这些方法治愈[4]。大多数炎症性肠病患者通过药物治疗实现长期症状控制，但药物控制不能充分抑制肠道炎症，易出现多种并发症，严重影响患者的生活质量，目前尚无有效治疗方法将其治愈[5]。
间充质干细胞具有强大的免疫调节能力和巨大的再生潜力[6]，可以分化为特定细胞类型，从而修复受损或濒死细胞，还可以旁分泌一系列功能因子，如血管内皮生长因子、血小板源性生长因子、血管生成素1、白细胞介素11、前列腺素E2、基质细胞衍生因子1、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子1等调节免疫细胞、拯救受损细胞、减少组织损伤并加速修复。间充质干细胞还可以通过细胞外囊泡(如外泌体或微囊泡)传递蛋白质/肽、RNA、激素和化学物质[7]。基于间充质干细胞的强大功能，间充质干细胞疗法已成为一种前景广阔的治疗炎症性肠病的新疗法[8]。目前已有多项啮齿类动物炎症性肠病模型研究证实，静脉或腹腔注射间充质干细胞可显著改善肠道炎症[9-10]。此外，在临床试验中接受细胞疗法治疗的克罗恩病和溃疡性结肠炎患者也观察到了同样的积极效果[11]。超过200例难治性瘘管患者接受了局部注射间充质干细胞治疗，一半以上的患者完全缓解。在难治性克罗恩病中，报告了49例全身性间充质干细胞输注治疗，使用自体间充质干细胞输注缓解了病状，而使用同种异体间充质干细胞输注患者中约40%也达到临床缓解[12]。因此，间充质干细胞是治疗炎症性肠病的一种有前景且安全的方法，尤其是对于药物难治性炎症性肠病患者。干细胞药物Alofisel®于2018年在欧盟批准上市，用于治疗对至少一种常规或生物疗法无效的非活动性/轻度活动性克罗恩病成人患者的复杂肛周瘘。
尽管间充质干细胞疗法前景广阔，但其作为治疗炎症性肠病的有效选择仍存在挑战。间充质干细胞作为细胞治疗产品，在患者纳入标准、移植方法、治疗剂量选择、治疗频率、移植并发症的治疗等方面仍未达成明确共识[13]。对于间充质干细胞治疗炎症性肠病，虽然能有效缓解病情，但是效果还不能令人满意。为了进一步优化间充质干细胞的治疗效果，在许多临床前模型中用病毒或非病毒载体转染间充质干细胞进行特定基因编辑以表达营养细胞因子、治疗性肽以及其他有益的基因产物[14]。白细胞介素10(interleukin-10，IL10)是一种抗炎细胞因子，对先天性免疫系统和适应性免疫系统皆具有抑制作用，有助于调节免疫反应并诱导巨噬细胞极化为抗炎表型。白细胞介素10限制肠道炎症反应，以维持肠道中共生微生物的稳态，并在致病性感染期帮助炎症消退[15]。在该研究中，将人白细胞介素10基因引入人脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)中，筛选出高表达白细胞介素10的克隆株，并根据细胞治疗产品的标准，对白细胞介素10工程化修饰的UCMSCs(IL10-UCMSCs)的一般特征、分化能力和免疫调节特性进行综合评估；然后将其运用于治疗小鼠炎症性肠病，结果发现IL10-UCMSCs比未基因修饰的UCMSCs具有更加优效的治疗效果，IL10-UCMSCs显著降低了炎症性肠病模型小鼠的疾病评分，而且促进了肠道组织的修复，进一步发现IL10-UCMSCs治疗组结肠组织切片中增殖细胞核抗原阳性细胞与CD31阳性细胞显著多于UCMSCs治疗组，表明IL10-UCMSCs可能通过显著促进肠组织细胞增殖和血管再生进而促进结肠组织修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 动物体内实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年11月至2024年4月在南京大学医学院附属鼓楼医院临床干细胞研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 脐带组织 来源于南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科正常足月顺产婴儿，与产妇及其家属签署知情同意书后，在产房无菌条件下获取。
1.3.2 细胞 RAW264.7细胞系购买自美国ATCC公司。
1.3.3 实验动物 8周龄雄性C57BL/6J小鼠30只，体质量20-25 g，8周龄雄性NU/NU Nude小鼠6只，体质量25-30 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0006，饲养于23 ℃，12 h/12 h明暗交替SPF级小鼠饲养环境中。该研究的实施符合南京市第一医院(南京医科大学附属南京医院)的相关伦理要求(批件号：DWSY-23029333)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.4 实验试剂和仪器 DMEM基础培养基(10567014，GIBCO，美国)；胎牛血清(12664025，GIBCO，美国)；细胞消化液(Tryple)、DPBS、青链霉素、Endofree质粒试剂盒(QIAGEN，德国)；NruI限制性内切酶(1168A，Takakra，日本)；白细胞介素10 ELISA 试剂盒(EK110/2-96，联科生物公司，中国杭州)；油红O(1320-06-5，Sigma-Aldrich，美国)；茜素红(130-22-3，Sigma-Aldrich，美国)；抗人CD14、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、C105和HLA-DR抗体(BD，美国)；干扰素γ(I4777，Sigma-Aldrich，美国)；脂多糖(L6386，Sigma-Aldrich，美国)；RNA-easy分离试剂(R711-01，诺唯赞，南京)；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)( R223-01，诺唯赞，南京)；Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix( Q712-03，诺唯赞，南京)；CCK-8试剂盒(C0038，碧云天，上海)；抗小鼠增殖细胞核抗原抗体(13110T，CST，美国)；抗小鼠CD31抗体(ab182981，Abcam，美国)；Alexa Fluor 488和568标记的山羊抗兔/鼠荧光二抗(Invitrogen，美国)；DAPI(ab104139，Abcam，美国)；超净工作台(Airtech，中国苏州)；UY21EDIT II超级多模式基因电转仪(BEX，日本)；体视显微镜(麦克奥迪，中国)；QuantStudio™ 6 Flex 实时荧光定量PCR系统(Thermo Fisher，美国)；流式细胞仪(BD，美国)；荧光共聚焦显微镜(Leica，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 临床级UCMSCs的分离和培养 经审查委员会批准和所有产妇知情同意后，取一段15 cm长的脐带组织样本，根据组织外植体法获得UCMSCs[16]。分离、培养、鉴定、质量控制、贮存等全过程均符合GMP质量标准[17]。评估后，将分离自3条新生儿脐带的临床级第2代UCMSCs混合并复苏，以避免个体异质性。
1.4.2 IL10-UCMSCs的构建 人白细胞介素10基因(参考序列NM_000572.2)由北京义翘神州公司合成，具体序列如图1。表达载体pCMV/hygro用于在哺乳动物宿主中稳定地高水平表达，载体包含CMV启动子、Kozak序列。使用QIAGEN Endofree质粒试剂盒纯化白细胞介素10重组载体，并用限制性内切酶NruI线性化后进行电转染。CUY21EDIT II超级多模式基因电转仪用于电转染，各项参数如下：脉冲电压(150 PpV)、驱动电压(20 PdV)、脉冲时间(10 ms)和循环次数(20次)。将转染的细胞分为空白对照质粒组和重组白细胞介素10质粒组。电转染后，将混合物接种在10 cm培养皿中，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养24 h，评估细胞状态和死亡率，然后使用100 μg/mL潮霉素进行稳定克隆筛选。14 d后，在体视显微镜下挑出细胞集落进行扩增培养，每个集落代表1个细胞株，当每个克隆株生长到90%融合时，收获上清液并使用ELISA试剂盒检测白细胞介素10分泌水平。

1.4.3 临床级IL10-UCMSCs的质量评估

(1)表面标志物鉴定：分别收集2×105个IL10-UCMSCs或对照UCMSCs并重悬于100 μL PBS中，然后与单克隆抗体CD34、CD45、CD90、CD19、CD44、CD73、CD105和HLA-DR在室温下避光孵育30 min，PBS洗涤3次，并重悬于洗涤缓冲液上流式细胞仪检测，实验结果用FlowJo V10软件进行分析。
(2)成骨、成脂定向诱导分化：分别将IL10-UCMSCs或对照UCMSCs以1×105个/孔接种于6孔板内，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞。当细胞达到70%融合度时，更换为成脂或成骨分化培养基，诱导成脂、成骨分化，每隔3 d换液1次。诱导21 d后，将细胞于体积分数4%甲醛中固定30 min，并用油红O或茜素红染色30 min，PBS洗涤3次，显微镜下观察判断成脂和成骨分化情况。
(3)细胞增殖性能测定：分别将IL10-UCMSCs或对照UCMSCs以5 000个/孔接种于96孔板内，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，24 h后按照说明书每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育1-4 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。
(4)致瘤性测定：对严重联合免疫缺陷的雄性NU/NU Nude小鼠皮下注射1×107个 IL10-UCMSCs，每周监测1次肿瘤形成情况，持续4周，收集主要器官进行苏木精-伊红染色。

(5)免疫调节能力测定：RAW264.7细胞按1×105个/孔密度接种于6孔板中，用含体积分数10%灭活胎牛血清的1640完全培养基培养；UCMSCs或IL10-UCMSCs按1×105个/孔接种于6孔板规格的Transwell小室，用含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM完全培养基培养。24 h细胞贴壁后，将铺有UCMSCs或IL10-UCMSCs的Transwell小室转移到铺有RAW264.7的6孔板中，用含2.5 ng/mL干扰素γ、1 μg/mL脂多糖、体积分数10%胎牛血清的1640完全培养基共培养48 h，收集RAW264.7细胞，用RNA-easy提取RNA，用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR对提取的RNA进行反转录，再按比例配制成混合液，反应体系见表1。引物设计见表2，引物由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成；qPCR反应程序见表3，由QuantStudio™ 6 Flex 实时荧光定量PCR仪进行分析，以GAPDH的Ct值为内参，采用2-ΔΔct计算基因的相对表达量。

1.4.4 葡聚糖硫酸钠盐诱导的急性结肠炎模型建立及IL10-UCMSCs治疗 造模小鼠自由饮用5%葡聚糖硫酸钠盐水溶液5 d，未处理组小鼠饮用正常水，小鼠体质量减轻、稀便、腹泻甚至血便，即可视为造模成功。所有小鼠随机分为4组进行处理：①正常对照组：不做任何处理；②造模组：饮用5%葡聚糖硫酸钠盐水溶液造模，通过腹腔和尾静脉分别注射200 μL生理盐水；③UCMSCs治疗组：饮用5%葡聚糖硫酸钠盐水溶液造模，通过腹腔和尾静脉分别注射1×106个UCMSCs (200 μL)；④IL10-UCMSCs治疗组：饮用5%葡聚糖硫酸钠盐水溶液造模，通过腹腔和尾静脉分别注射1×106个IL10-UCMSCs (200 μL)。所有葡聚糖硫酸钠盐造模组小鼠在造模前1 d通过尾静脉注射UCMSCs或PBS；造模后第4天通过腹腔注射UCMSCs或PBS。造模后第6天，麻醉后处死所有小鼠，取出结肠组织用于后续实验。
1.4.5 结肠炎评分 根据表4中的疾病活动指数评分标准，每天观察记录小鼠的体质量、腹泻、粪便情况并进行评分。在造模第6天处死全部小鼠后，取出完整结肠，在无菌预冷PBS中洗涤2次，测量长度并拍照。然后清除结肠中的余便，用无菌预冷PBS清洗2次，切下一段1 cm的结肠在40 g/L多聚甲醛中固定过夜。将固定好的结肠样本进行石蜡包埋、脱蜡处理，切成5 μm厚度的石蜡切片，用苏木精和伊红染色，显微镜拍照，根据表5列出的评分标准计算得出微观炎症评分。

1.4.6 免疫荧光染色检测肠道组织的再生修复情况 用PBS配置的0.5%Triton X-100通透石蜡切片15 min；再用5% BSA封闭组织切片1 h，然后在4 ℃下与CD31抗体和增殖细胞核抗原抗体(1∶200稀释)孵育过夜，PBST洗涤3次，在室温下与Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568偶联的相应二抗孵育1 h(1∶1 000稀释)，PBST洗涤3次，使用DAPI封固，在荧光共聚焦显微镜下拍照。用软件Image J进行量化，CD31标记的血管荧光面积/DAPI标记的肠道黏膜总面积比值即为平均血管面积。
1.5 主要观察指标 IL10-UCMSCs培养上清中的白细胞介素10分泌量；IL10-UCMSCs的质量评价指标：特定细胞表面标志物的表达、成骨成脂分化能力、增殖性能、致瘤性与免疫调控能力；IL10-UCMSCs对急性结肠炎小鼠模型的治疗效果，包括表型指标与组织学检查。
1.6 统计学分析 通过GraphPad Prism 5.0软件进行分析。数据以x±s表示。使用单因素ANOVA进行显著性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已通过南京大学医学院附属鼓楼医院生物统计学专家审核。

讨论

炎症是人体对于刺激的一种防御反应，当组织和细胞受到有害物质(如病原体、化学物质或物理损伤)的攻击时，机体通过不同程度的发烧、白细胞增多和增强新陈代谢来修复受损组织、恢复器官功能并维持体内平衡[18]。虽然炎症主要是一个生理性且有益的过程，但不受控制的炎症会导致组织损伤，最后形成炎症性疾病，包括炎症性肠病、神经退行性疾病和类风湿性关节炎等[13]。炎症性肠病以胃肠道特发性黏膜炎症为特征，溃疡性结肠炎通常只影响大肠的黏膜，而克罗恩病可能在胃肠道的任何部位引起炎症反应。
白细胞介素10是一种具有强大抗炎特性的多效细胞因子，先天性和适应性免疫系统的许多细胞都表达白细胞介素10，其中巨噬细胞和树突状细胞是白细胞介素10的主要来源[19]。白细胞介素10受体的遗传变异以及白细胞介素10和STAT3基因的遗传变异都与炎症性肠病有关，提示白细胞介素10信号级联反应参与克罗恩病和溃疡性结肠炎的发病机制[20]。白细胞介素10也被证明可激活PI3K/Akt通路以促进细胞增殖[21]，以及激活p38/MAPK通路以抑制巨噬细胞中肿瘤坏死因子α的翻译[22]。还有研究进一步表明，抗肿瘤坏死因子在解决肠道炎症方面的治疗效果严重依赖于巨噬细胞中的白细胞介素10信号传导[23]。肠道免疫炎症和调节途径处于高度动态平衡之中，以确保黏膜屏障得以修复，而不会产生不可逆转的炎症或演变为自我延续的结肠炎，白细胞介素10在其中起着关键作用，并控制着炎症性肠病的易感性[24]。早在1990年代中期，重组人白细胞介素10静脉推注首次用于治疗克罗恩病，其安全性与积极结果为克罗恩病的更多治疗选择带来了希望[25]。而在另外一项临床试验研究中，评估了重组白细胞介素10(Tenovil)对克罗恩病患者在肠切除术后连续12周的安全性和耐受性，内窥镜检查结果显示没有观察到Tenovil预防克罗恩病复发的证据，尽管观察到临床反应有所改善，但未检测到缓解率的差异[26]。白细胞介素10在体循环中的半衰期短(两三个小时)可能是影响其疗效的关键因素。LIU等[27]设计了一种称为Gal-IL10-EVs(C/A)的递送系统，可保护白细胞介素10在胃中不降解，将白细胞介素10靶向递送至浸润结肠固有层的炎性巨噬细胞，有效缓解了结肠炎症反应并保护肠道屏障。
已有多项研究结果表明间充质干细胞的治疗益处可能来自于多种旁分泌因子的释放和协同作用[28]。间充质干细胞作为通过免疫调节和促进肠道修复等机制治疗炎症性肠病的有希望候选细胞药物，可合成和释放多种细胞因子和生长因子，例如白细胞介素11、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子2和胰岛素样生长因子1，这些因子已被证明可增强细胞增殖或抑制上皮细胞凋亡，从而促进肠黏膜修复[29]。为了克服白细胞介素10蛋白在体内半衰期短、价格昂贵的缺点，该研究在UCMSCs中过表达白细胞介素10(IL10-UCMSCs)，在发挥UCMSCs自身免疫调控能力基础上，持续稳定高表达白细胞介素10，通过协同作用来发挥IL10-UCMSCs对炎症性肠病的优效治疗作用。
基于细胞产品标准建立了重组白细胞介素10基因修饰工程化UCMSCs，并系统地进行了质量评估确认其符合间充质干细胞的认定标准，为未来临床应用提供了条件。实验结果表明，与UCMSCs相比，IL10-UCMSCs治疗更加有效减轻了小鼠急性结肠炎的症状，葡聚糖硫酸钠盐造模导致的结肠缩短、体质量下降、结肠组织的炎症浸润都被更有效地抑制。另外，与UCMSCs相比，IL10-UCMSCs治疗后结肠组织中增殖细胞核抗原阳性细胞更多。增殖细胞核抗原是一种DNA聚合酶的辅助蛋白，与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，可作为细胞增殖状态的指标，所以IL10-UCMSCs表现出更为明显的促增殖作用。CD31是血管内皮分化标志物，IL10-UCMSCs治疗后结肠组织中CD31阳性内皮细胞数量以及平均血管面积显著增加，表明IL10-UCMSCs的促血管生成作用更为明显，所以IL10-UCMSCs持续稳定高表达白细胞介素10，发挥强大的抗炎症反应，在UCMSCs其他生物效应的协同下，显著促进了肠道组织的再生及血管生成可能是IL10-UCMSCs比UCMSCs治疗炎症性肠病更优效的机制。该研究为针对特定疾病(如炎症性肠病)发病机制或者干预靶点进行工程化修饰间充质干细胞进而提高治疗效果提供了证据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

白细胞介素10工程化修饰人脐带间充质干细胞优效治疗炎症性肠病

Interleukin-10 engineered human umbilical cord mesenchymal stem cells for superior treatment of inflammatory bowel disease

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