1.1 设计 活性因子结合干细胞的生物学特性实验，通过设立空白对照验证血小板衍生生长因子DD调控肌腱干细胞增殖和分化的作用。
1.2 时间及地点 实验于2023年11月至2024年3月在武汉市第四医院动物实验中心完成。
1.3 对象
1.3.1 入选对象 该研究经武汉市第四医院伦理委员会批准(批准号为KY-2024-04-23)，按照指导方针和有关规定执行。共入选10例需实行肩袖手术患者，标本来自于手术过程中获得的肩袖退变性组织。标本的获取均先告知患者本人并征得同意。
纳入标准：①确诊为巨大肩袖撕裂(MRI提示累及肌腱≥2根或肌腱缺损> 5 cm，残存肩袖组织脂肪浸润Goutallier分级≤3)；②非创伤导致的急性损伤，病程长达6个月以上，保守治疗效果不佳；③年龄35-50岁；④术中关节镜下可见肩关节无明显炎症反应。
排除标准：①肩关节功能尚可，可行保守治疗者；②年龄< 35岁或> 50岁；③由于创伤等因素导致的急性损伤，或病程短于6个月；④肩关节伴有明显炎症；⑤近3个月行肩关节药物注射或口服相关药物等保守治疗。
1.3.2 试剂与仪器 血小板衍生生长因子DD(武汉拜意尔生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶-EDTA、高糖型DMEM/F12完全培养基(Thermo，美国)；Ⅰ型胶原酶(Gibco，美国)；链霉素-青霉素双抗生素液、PBS、茜素红染液、成骨诱导分化完全培养基、成软骨诱导分化完全培养基、成脂诱导分化完全培养基(Servicebio，武汉)；DAPI、苏木精(Sigma-Aldrich，美国)；牛血清白蛋白(Biofroxx，德国)；山羊封闭血清(ZLI-9310，中山金桥，北京)；鬼笔环肽-TRITC(Yeasen，上海)；EdU试剂盒(锐博生物，苏州)；Triton-X-100、油红O(国药，武汉)；阿利新蓝8GX(Aladdin，上海)；标记山羊抗人IgG、PrimeScript RT reagent Kit(Takara，日本)；荧光显微镜(IX51，Olympus，日本)；共聚焦显微镜(LSM880，ZEISS，德国)；流式细胞仪(334224，BD，美国)；细胞培养箱(3308，Thermo，美国)。
1.4 方法
1.4.1 肌腱干细胞的培养及鉴定 取肩袖组织标本，用含2%链霉素-青霉素双抗生素液的PBS反复冲洗10次，将洗净的组织标本剪成1 mm3大小置于培养皿中，加入5.0-6.0 mL 3 mg/mL Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL中性蛋白酶的混合酶溶液，于37 ℃、体积分数5% CO2的恒温培养箱中消化1.5 h左右，每隔15 min将培养皿取出搅拌混匀。消化完成后，用含有山羊封闭血清的高糖型DMEM/F12完全培养基终止消化，并通过60目滤网过滤消化的组织，去除较大团块。用吸管将滤液转移到15 mL离心管，加入PBS至12 mL，以1 000 r/min离心8 min，弃上清液后，用高糖型DMEM/F12完全培养基制成单细胞悬液，细胞计数，以1×108 L-1的细胞浓度接种于10 cm培养皿中，记为第1代肌腱干细胞，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养，48 h后更换培养基去除未贴壁细胞，之后每隔3 d换液1次，待细胞生长至80%以上融合度时以1∶2进行传代。
(1)通过鬼笔环肽免疫荧光检测肌腱干细胞的骨架形态：待第3代肌腱干细胞生长至80%以上融合度，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，以1 000 r/min离心8 min，弃上清液，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次，涡旋混匀后涂片，用组化笔画圈，防止后面过程孵育液流走，PBS洗涤3次，用1%牛血清白蛋白按1∶300稀释绿光鬼笔环肽-TRITC配制工作液，37 ℃避光孵育1.5 h，PBS洗涤3次，滴加DAPI染核，室温避光孵育30 min，PBS洗涤3次，用抗荧光淬灭封片剂封固，显微镜下观察拍照。
(2)采用流式细胞术进行表型鉴定：待第3代肌腱干细胞生长至80%以上融合度，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS重悬，细胞计数，调整细胞浓度为1×108 L-1，用1% Triton-X-100通透细胞10 min，PBS冲洗2次，室温下1%牛血清白蛋白孵育细胞1 h，以800 r/min离心6 min，弃上清液，加入20 μL 1% 牛血清白蛋白稀释的CD34、CD44、CD90和CD106抗体，稀释浓度为1∶500，4 ℃孵育4 h，PBS洗涤细胞3次，以800 r/min离心6 min，分别加入对应的二抗，PBS稀释到最佳浓度，室温下孵育1 h，PBS洗涤细胞3次，以800 r/min离心6 min，用预冷的PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。
1.4.2 肌腱干细胞增殖实验
(1) EdU免疫荧光分析：选取第3代肌腱干细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，按照2×104个/cm2的细胞密度接种到6孔板，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养，待细胞生长至80%以上融合度，加入10 μmol/L EdU，混匀后孵育45 min，参照既往相关文献及预实验[16-17]，血小板衍生生长因子DD组更换含5 μg/mL血小板衍生生长因子DD的高糖DMEM/F12完全培养基，对照组更换高糖DMEM/F12完全培养基，每组重复5次。培养48 h，两组肌腱干细胞以1 000 r/min离心8 min，弃上清液，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3次，涡旋混匀后涂片，用组化笔画圈，防止后面过程孵育液流走，PBS洗涤3次，配制破膜液，室温下孵育10 min，PBS洗涤3次，室温下晾干，配制1X Apollo567染色反应液，避光37 ℃孵育1.5 h，PBS洗涤3次，滴加DAPI染液染核，室温下避光孵育30 min，PBS洗涤3次，用抗荧光淬灭封片剂封固，显微镜下观察拍照。
(2) CCK-8法：第3代肌腱干细胞以1×104个/孔接种至96孔板，待细胞生长至80%以上融合度，血小板衍生生长因子DD组更换含5 μg/mL血小板衍生生长因子DD的高糖DMEM/F12完全培养基，对照组更换高糖DMEM/F12完全培养基，每组设5个复孔，于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中孵育，每3 d换液1次，连续8 d同一时间点，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h后，用酶标仪测定450 nm波长处吸光度值，绘制增殖曲线。
1.4.3 肌腱干细胞三系分化实验
(1)成骨诱导分化：选取第3代肌腱干细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，按照2×104个/cm2的细胞密度接种到6孔板，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养，待细胞生长至80%以上融合度，血小板衍生生长因子DD组更换含5 μg/mL血小板衍生生长因子DD的成骨诱导分化完全培养基，对照组更换成骨诱导分化完全培养基，空白对照组继续用高糖DMEM/F12完全培养基培养，每组重复5次。成骨诱导7 d，1 000 r/min离心8 min，弃上清液，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，纯水洗涤3次，茜素红染液染色10 min，PBS洗涤2次，倒置显微镜下观察细胞染色情况。
(2)成脂诱导分化：选取第3代肌腱干细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，按照2×104个/cm2的细胞密度接种到6孔板，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养，待细胞生长至80%以上融合度，血小板衍生生长因子DD组更换含5 μg/mL血小板衍生生长因子DD的成脂诱导分化完全培养基，对照组更换成脂诱导分化完全培养基，空白对照组继续用高糖DMEM/F12完全培养基培养，每组重复5次。成脂诱导7 d，1 000 r/min离心8 min，弃上清液，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，纯水洗涤3次，滴加油红O母液与蒸馏水按3∶2配制混合液染色10 min，用60%异丙醇分化3 min，纯水洗涤2次，倒置显微镜下观察细胞染色情况。
(3)成软骨诱导分化：选取第3代肌腱干细胞，调整细胞浓度为1 ×108 L-1，按照2×104个/cm2的细胞密度接种到6孔板，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养，待细胞生长至80%以上融合度，血小板衍生生长因子DD组更换含5 μg/mL血小板衍生生长因子DD的成软骨诱导分化完全培养基，对照组更换成软骨诱导分化完全培养基，空白对照组继续用高糖DMEM/F12完全培养基培养，每组重复5次。成软骨诱导7 d，1 000 r/min离心8 min，弃上清液，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定20 min，纯水洗涤3次，阿利新蓝染液染30 min，纯水洗涤2次，倒置显微镜下观察细胞染色情况。
1.5 主要观察指标 ①肌腱干细胞的形态观察和表型鉴定；②血小板衍生生长因子DD对肌腱干细胞增殖能力的影响；③血小板衍生生长因子DD对肌腱干细胞成脂、成软骨和成骨分化能力的影响。
1.6 统计学分析 应用SPSS 26.0(IBM，美国)统计学软件进行统计学分析。数据以x±s表示，采用Shapiro-Wilk检验数据是否服从正态性分布，组间样本比较采用独立样本t检验，两组多时间点比较采用重复测量方差分析，若不满足球形检验，采用Greenhouse-Geisser法进行校正，同组不同时间点比较采用Bonferroni法。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过华中科技大学同济医学院统计学专家审核。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
