还原型氧化石墨烯提高脂肪干细胞内皮向分化效率及血管形成能力

doi:10.12307/2026.134

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (13): 3270-3279.doi: 10.12307/2026.134

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还原型氧化石墨烯提高脂肪干细胞内皮向分化效率及血管形成能力

姚金凤1，邓梦昭1，谢添1，陈瞰1，王海霞2

1深圳市第二人民医院/深圳大学第一附属医院口腔科，广东省深圳市 518035；2 联勤保障部队大连第967医院口腔科，辽宁省大连市 116000

收稿日期:2025-05-28 修回日期:2025-08-05 接受日期:2025-08-14 出版日期:2026-05-08 发布日期:2025-12-25
通讯作者: 王海霞，副主任医师，联勤保障部队大连第967医院口腔科，辽宁省大连市 116000
作者简介:姚金凤，女，1981 年生，甘肃省兰州市人，汉族，副主任医师，博士，主要从事骨缺损修复材料相关的基础和临床研究。
基金资助:
广东省医学科学技术研究基金项目( B2023428)，项目负责人：姚金凤

Reduced graphene oxide improves endothelial differentiation efficiency and angiogenesis ability of adipose-derived stem cells

Yao Jinfeng1, Deng Mengzhao1, Xie Tian1, Chen Kan1, Wang Haixia2

1Department of Stomatology, Shenzhen Second People’s Hospital/The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; 2Department of Stomatology, Joint Logistics Support Force 967th Hospital, Dalian 116000, Liaoning Province, China

Received:2025-05-28 Revised:2025-08-05 Accepted:2025-08-14 Online:2026-05-08 Published:2025-12-25
Contact: Wang Haixia, Associate chief physician, Department of Stomatology, Joint Logistics Support Force 967th Hospital, Dalian 116000, Liaoning Province, China
About author:Yao Jinfeng, MD, Associate chief physician, Department of Stomatology, Shenzhen Second People’s Hospital/The First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
Supported by:
Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China, No. B2023428 (to YJF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

还原型氧化石墨烯：为氧化石墨烯经还原处理后保留部分含氧官能团的二维层状碳基纳米材料，其含氧官能团可与细胞表面受体特异性结合，进而激活细胞内信号通路，调控血管生成相关因子的分泌；同时，还原型氧化石墨烯的二维片层结构可模拟细胞外基质成分，为细胞提供类体内环境的支撑平台。还原型氧化石墨烯凭借优异的生物活性和促血管生成潜力，在组织工程血管化领域备受关注。
脂肪干细胞：为源于脂肪组织的间充质干细胞，它具有自我更新和多向分化(如脂肪、成骨、软骨、肌肉和内皮细胞等)潜能，在组织工程中优势显著：一是来源广泛，抽脂手术就能大量获取；二是免疫原性低，同种异体移植时免疫排斥反应弱；三是旁分泌功能强大，可分泌多种生物活性因子促进细胞增殖、分化和组织修复再生，利于构建和优化组织工程微环境以实现组织修复与功能重建。

摘要
背景：脂肪干细胞能够在特定的诱导环境下分化为血管内皮细胞，是组织工程血管化过程中较为理想的种子细胞。然而脂肪干细胞的内皮向分化效率低，严重限制了该方法的应用。
目的：探讨还原型氧化石墨烯对脂肪干细胞内皮向分化效率和血管形成能力的影响。
方法：首先，采用绿色合成工艺制备还原型氧化石墨烯，使用透射电镜、能谱分析和傅里叶变换红外光谱等手段对还原型氧化石墨烯进行材料表征。然后将不同质量浓度的还原型氧化石墨烯与脂肪干细胞共培养，通过CCK-8实验确定还原型氧化石墨烯的安全浓度范围，接着利用安全浓度范围内的还原型氧化石墨烯诱导脂肪干细胞内皮向分化，通过RT-qPCR和Western blot检测脂肪干细胞内皮向分化相关指标的表达。最后，通过划痕实验和小管形成实验评估还原型氧化石墨烯诱导分化后细胞的成管和迁移能力。

结果与结论：①还原型氧化石墨烯具有典型的二维片状结构，主要含碳、氧元素，可检测到与含氧官能团相关的特征吸收峰；②CCK-8实验结果显示，10 μg/mL及以下浓度的还原型氧化石墨烯培养72 h对脂肪干细胞的活力无影响；③RT-qPCR和Western blot结果显示，10 μg/mL及以下浓度的还原型氧化石墨烯诱导6，9 d均可以显著提高脂肪干细胞内皮向分化相关标志物的表达，其中5 μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9 d，内皮向分化标志物基因表达差异最大；④划痕实验和小管形成实验结果表明，相较于空白组和对照组，还原型氧化石墨烯组细胞的迁移和成管能力显著增强；⑤结果表明，绿色合成的还原型氧化石墨烯可以显著提高脂肪干细胞的内皮向分化效率，其中5 μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9 d是最佳的时间浓度组合，诱导分化后的细胞具有更好的血管形成功能。

https://orcid.org/0000-0003-1548-1276 (姚金凤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 脂肪干细胞, 还原型氧化石墨烯, 绿色合成工艺, 内皮向分化, 血管生成, 组织工程血管化

Abstract: BACKGROUND: Adipose-derived stem cells can differentiate into vascular endothelial cells in a specific induction environment and are ideal seed cells in the process of tissue engineering vascularization.
OBJECTIVE: To explore the effect of reduced graphene oxide on the endothelial differentiation efficiency and angiogenesis ability of adipose-derived stem cells.
METHODS: Firstly, reduced graphene oxide was prepared by green synthesis process and characterized by transmission electron microscopy, energy spectrum analysis and Fourier transform infrared spectroscopy. Different mass concentrations of reduced graphene oxide were co-cultured with adipose-derived stem cells, and the safe concentration range of reduced graphene oxide was determined by CCK8 assay. Then, the endothelial differentiation of adipose-derived stem cells was induced by reduced graphene oxide in a safe concentration range for different times. The expression of endothelial differentiation-related indicators of adipose-derived stem cells was detected by RT-qPCR and western blot assay. Finally, the tube formation and migration abilities of cells induced by reduced graphene oxide were evaluated by scratch test and tubule formation test.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Reduced graphene oxide has a typical two-dimensional sheet structure, mainly containing carbon and oxygen elements, and characteristic absorption peaks related to oxygen-containing functional groups can be detected. (2) The results of CCK-8 assay showed that reduced graphene oxide at a concentration of 10 μg/mL or less had no effect on the cell viability of adipose-derived stem cells after 72 hours of culture. (3) The results of RT-qPCR and western blot assay show that reduced graphene oxide at a concentration of 10 μg/mL or less could significantly increase the expression of markers related to endothelial differentiation of adipose-derived stem cells after 6 and 9 days of induction, among which 5 μg/mL reduced graphene oxide induced 9 days, and the gene expression difference of endothelial differentiation markers was the greatest. (4) The results of scratch test and tubule formation test showed that compared with the blank group and the control group, the migration and tube formation abilities of cells in the reduced graphene oxide group were significantly enhanced. (5) The results show that green synthesized reduced graphene oxide can significantly improve the endothelial differentiation efficiency of adipose-derived stem cells, among which 5 μg/mL reduced graphene oxide induction for 9 days is the best time-concentration combination, and the induced differentiated cells have better angiogenesis function.

Key words: adipose-derived stem cell, reduced graphene oxide, green synthesis process, endothelial differentiation, angiogenesis, tissue engineering vascularization

中图分类号:

姚金凤, 邓梦昭, 谢添, 陈瞰, 王海霞. 还原型氧化石墨烯提高脂肪干细胞内皮向分化效率及血管形成能力[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(13): 3270-3279.

Yao Jinfeng, Deng Mengzhao, Xie Tian, Chen Kan, Wang Haixia. Reduced graphene oxide improves endothelial differentiation efficiency and angiogenesis ability of adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(13): 3270-3279.

图/表（结果） 6

2.1 还原型氧化石墨烯材料学表征结果 透射电镜图像直观展示了还原型氧化石墨烯的片层结构，片层较薄且呈现褶皱和透明特征，见图1A。X射线衍射仪测量结果显示，10°附近的氧化石墨烯峰已基本消失或显著减弱，说明氧化石墨烯被还原；25°-26°有一个宽的衍射峰，这符合还原型氧化石墨烯的(002)面特征，见图1B。X射线光电子能谱仪结果显示，还原型氧化石墨烯中C1s的峰面积为786 795，O1s的峰面积为216 098，计算得到的碳氧比(C/O比)约为3.64，还原型氧化石墨烯表面的碳氧比显著提高，表明氧化石墨烯被有效还原，且存在C-C、C-O和C=O等键合状态，见图1C，D。拉曼光谱中，D带与G带的强度比(ID/IG)略微降低，表明还原过程中sp2结构部分恢复，见图1E。综合表征结果表明，还原型氧化石墨烯具有较高的还原程度和良好的结构特性。

2.2 还原型氧化石墨烯的安全浓度范围 为确定还原型氧化石墨烯的安全浓度范围以应用于后续细胞实验，将脂肪干细胞在含有不同质量浓度还原型氧化石墨烯的培养基中培养12，24，48，72 h，通过CCK-8实验评估脂肪干细胞的细胞活力。结果显示，使用质量浓度为2.5-10 μg/mL的还原型氧化石墨烯处理12，24，48，72 h细胞活力不受影响。然而，20 μg/mL及以上质量浓度的还原型氧化石墨烯处理后细胞活力显著降低，见图2。这些结果表明，20 μg/mL及以上质量浓度的还原型氧化石墨烯对脂肪干细胞具有细胞毒性，而10 μg/mL及以下质量浓度是还原型氧化石墨烯的安全浓度范围。因此，选择10 μg/mL及以下质量浓度的还原型氧化石墨烯进行后续实验，设计质量浓度梯度为2.5，5，10 μg/mL。

2.3 还原型氧化石墨烯促进脂肪干细胞向血管内皮细胞分化 与空白组和0 μg/mL 还原型氧化石墨烯组相比，2.5，5，10 μg/mL还原型氧化石墨烯组脂肪干细胞标志物的表达显著降低(图3)，血管内皮细胞标志物的表达显著升高(图4)，而且标志物表达的差异随着诱导时间的延长而增大，说明还原型氧化石墨烯可以显著提高脂肪干细胞的内皮分化效率。进一步对比分析不同质量浓度还原型氧化石墨烯的诱导效果，发现5 μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9 d后各标志物基因表达差异最显著。综上，5 μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9 d是脂肪干细胞内皮向分化效率最高的时间浓度组合，因此选择该时间浓度组合进行后续血管形成功能检测。

2.4 还原型氧化石墨烯诱导分化后细胞的血管生成相关蛋白表达 与空白组和对照组相比，5 μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9 d后血管生成相关蛋白CD31和血管内皮生长因子受体的表达升高，见图5。Western blot检测结果与qPCR结果相一致，表明还原型氧化石墨烯可以促进脂肪干细胞内皮向分化。

2.5 还原型氧化石墨烯诱导分化后细胞的迁移能力增强 还原型氧化石墨烯组12，24 h均有大量的细胞向中间的划痕区域迁移，细胞分布广泛，划痕愈合面积明显多于空白组和对照组，见图6。以上结果表明：相较于常规方法诱导分化的细胞，还原型氧化石墨烯诱导分化的细胞具有更好的迁移能力。

2.6 还原型氧化石墨烯诱导分化后细胞的成管能力增强 空白组细胞呈现出明显的聚集成团现象，仅在少数区域有初步伸展和连接的趋势，所形成的类似管状结构也极为短小、狭窄且不规则。对照组细胞相互连接并延伸，形成了一些具有管状特征的结构。然而这些管状结构在某些部位出现中断，无法构成完整的封闭环状结构，整体的管状结构仍存在缺陷。还原型氧化石墨烯组细胞能够有效地相互连接、伸展，并形成成熟的管状结构，这些管状结构长度较长、宽度适中，具有很高的完整性，见图7A。此外，应用Image J软件对每组形成小管的节点数量、主节长度和网格数量进行统计分析，结果显示还原型氧化石墨烯组的节点数量、主节长度和网格数量明显高于其他两组，见图7B。

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引言

组织工程为器官损伤修复与功能重建提供了创新的治疗方案，然而血管化不足严重阻碍了其临床应用。血管化不足会导致营养和氧气供应不足、代谢废物积累，引发细胞死亡和组织坏死，影响组织工程构建物的存活与功能[1]。将内皮细胞或具有内皮分化潜能的干细胞整合到基质材料中，利用细胞的自我组装能力形成初步的血管结构是促进组织工程血管化的重要策略[2]。其中，间充质干细胞具备自我更新和多向分化潜能，可在特定条件下分化为内皮样细胞参与血管构建，是组织工程血管化策略的重要种子细胞来源[3]。
脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一类具有自我更新和多向分化潜能的间充质干细胞，它们能够分化为多种细胞类型，如内皮细胞、脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞等，在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。相较于其他类型的间充质干细胞，脂肪干细胞具有以下优势：①来源丰富、获取简便：脂肪组织在体内广泛存在，通过抽脂等简单微创的方式即可获取大量的脂肪组织来分离脂肪干细胞，而且脂肪组织内的干细胞密度高[4]；②免疫原性更低：低免疫原性亚群(如CD73⁺/CD90⁺/CD105⁺及肿瘤坏死因子α刺激基因诱导蛋白6高分泌群体)通过低表达主要组织相容性复合体Ⅱ、分泌白细胞介素10和转化生长因子β等抗炎因子，抑制宿主免疫反应[5-6]；③稳定性好：年轻供者腹部皮下脂肪来源干细胞增殖能力强，多次传代后遗传性状稳定，衰老程度低[7-8]。然而，脂肪干细胞的内皮向分化效率低，这严重限制了其在组织工程血管化中的应用，如何提高脂肪干细胞的内皮向分化效率是当前亟待解决的问题。
石墨烯基生物材料因独特的力学、电学等性能，能模拟细胞微环境、促进细胞黏附分化，还可以精准负载运输药物，在组织修复、干细胞调控及药物递送等再生医学领域具有巨大的转化应用价值[9]。氧化石墨烯和还原型氧化石墨烯作为石墨烯衍生物，保留了石墨烯的优异性能，同时因含氧官能团的存在，具有更好的水溶性、分散性和化学反应性[10]。研究表明，氧化石墨烯和还原型氧化石墨烯均能以剂量依赖性的方式促进血管内皮细胞增殖和迁移，从而刺激血管生成[11]。此外，氧化石墨烯可以促进脐带间充质干细胞向血管内皮细胞分化，进而促进血管生成[12]。相较于氧化石墨烯，还原型氧化石墨烯因去除了大量含氧官能团，从而降低了引发炎症反应的风险，生物相容性更佳。此外，还原型氧化石墨烯优异的力学性能可模拟细胞外基质环境，促进细胞黏附、增殖和分化[13-14]。然而，还原型氧化石墨烯是否能提高脂肪干细胞的内皮向分化效率，从而更好地促进组织工程血管化尚不清楚。
该研究从细胞层面探究还原型氧化石墨烯是否能够提高脂肪干细胞的内皮向分化效率，进而促进血管生成，为还原型氧化石墨烯调控脂肪干细胞在组织工程血管化中的应用提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 材料制备及表征，体外细胞学观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2024年9月至2025年2月在南方医科大学口腔医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞 大鼠脂肪干细胞(RASMD-01001，赛业生物科技有限公司，广州，中国)。
1.3.2 主要试剂 氧化石墨烯(100023；Nanoinnova，西班牙)；红景天(以岭，石家庄，中国)；DMEM/F-12培养基、澳洲胎牛血清、PBS、0.25%胰酶-EDTA、青霉素-链霉素混合溶液(C11330500BT，C2027050，C10010500BT，25300120，15140-122；Gibco，美国)；内皮细胞培养基(1001；ScienCell，美国 )；CCK-8 试剂盒(C0037；碧云天，上海，中国)；Matrigel基质胶(356237；Corning，美国)；TRIzol试剂(Trizol，Invitrogen，美国)；异丙醇、无水乙醇(I811930，E809056；麦克林，上海，中国)；DEPC水(NR0001；雷根，北京，中国)；反转录试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒(A6A2301，A6A1651；艾科瑞生，湖南，中国)；RIPA裂解液(P0013B；碧云天，上海，中国)；BCA 蛋白测定试剂盒(A53225；Thermo Scientific，美国)；抗CD31和抗GAPDH抗体(28083-1-AP，10494-1-AP；三鹰，武汉，中国)；抗血管内皮生长因子受体抗体(HA210186；华安，杭州，中国)；ECL试剂盒(WBLKS0500；Merck Millipore，美国)。
1.3.3 主要仪器 透射电子显微镜(Hitachi，日本)；原子力显微镜(Bruker，德国)；X射线光电子光谱仪(Thermo Fisher Scientific，美国)；FT-IR光谱仪(Bruker，德国)；拉曼显微镜(HORIBA Scientific，法国)；VersaMax酶标仪(Molecular Device，美国)；相差光学显微镜(Olympus，日本)；LightCycler® 96 Instrument(Roche，瑞士)；自动化学发光图像分析系统(Tanon，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 还原型氧化石墨烯的制备 以红景天提取物为还原剂，通过绿色合成工艺制备还原型氧化石墨烯[15]。①首先制备红景天提取物：使用高精度微量天平称量50 g红景天，使用双蒸水洗涤，然后在50 ℃下干燥并研磨，将产物过筛并以料液比1∶10 (g/mL)加入体积分数为95%乙醇中。将混合物在70 ℃水浴中回流提取3次，每次持续30 min。每次提取后，过滤溶液。将3种滤液混合，并在50 ℃下蒸发浓缩至原始体积的一半。②然后制备还原型氧化石墨烯：将0.2 g氧化石墨烯加入到150 mL去离子水中，超声处理40 min，使氧化石墨烯均匀分散形成稳定的悬浮液。将50 mL红景天提取物加入到氧化石墨烯溶液中，使用磁力搅拌加热器在40 ℃下搅拌混合物8 h，在80 ℃下搅拌1 h，然后过滤混合物并用去离子水洗涤固体3次，冷冻干燥48 h后获得还原型氧化石墨烯。
1.4.2 还原型氧化石墨烯的表征 ①使用透射电子显微镜检测还原型氧化石墨烯的尺寸和形态特征。②使用X射线光电子能谱仪分析还原型氧化石墨烯的光电子能量分布，确定还原型氧化石墨烯中元素的种类、化学状态以及相对含量，检测碳元素、氧元素相关的峰位和峰强度，以判断还原型氧化石墨烯的还原程度和官能团状态。③使用X射线衍射仪测量还原型氧化石墨烯对X射线的衍射角度和强度，以分析还原型氧化石墨烯的晶体结构、层间距以及可能存在的杂质或缺陷。④使用拉曼显微镜分析还原型氧化石墨烯的拉曼光谱，检测D峰(约1 350 cm-1)和G峰(约1 580 cm-1)的位置、强度以及它们的比值，以评估还原型氧化石墨烯的结构有序性和缺陷程度[10，16]。
1.4.3 细胞培养 脂肪干细胞在含体积分数15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基中培养，培养条件为37 ℃、体积分数5% CO2培养箱，每2 d更换1次培养基。镜下观察细胞形态及生长变化，细胞生长至融合80%左右时用胰蛋白酶进行消化，离心收集细胞，用于传代和冻存。后续实验的细胞在第3次和第6次传代之间[17]。
1.4.4 CCK-8检测还原型氧化石墨烯的安全浓度范围 使用CCK-8试剂盒检测不同质量浓度还原型氧化石墨烯作用于脂肪干细胞不同时间的细胞活性，以确定还原型氧化石墨烯的生物安全性，并筛选适合后续实验的安全浓度范围[18]。将脂肪干细胞以2×103/孔的密度接种于96孔板中过夜培养后，使用含有不同质量浓度还原型氧化石墨烯(0，2.5，5，10，20，40，60，80 μg/mL)的培养基继续培养12，24，48，72 h，去除旧培养基，每孔加入含10% CCK-8溶液的新鲜培养基，37 ℃孵育2 h，每孔吸取100 µL上清液转移至新的96孔板中并使用VersaMax酶标仪在450 nm处测量吸光度值。

1.4.5 RT-qPCR检测脂肪干细胞内皮向分化相关指标的mRNA表达 使用安全浓度范围内(0，2.5，5，10 μg/mL)的还原型氧化石墨烯诱导脂肪干细胞内皮向分化6 d和9 d，采用qRT-PCR检测脂肪干细胞标志物(CD73和CD44)以及血管内皮细胞标志物(CD31、血管内皮生长因子受体、血管性血友病因子和血管内皮生长因子A)的mRNA表达[19]。首先，将脂肪干细胞以4×105个密度接种于6 cm培养皿中，使用含有相应质量浓度还原型氧化石墨烯(0，2.5，5，10 μg/mL)的内皮细胞培养基诱导培养6 d和9 d，期间每隔2 d半量换液，每隔4 d全量换液。参照PubmedGeneBank中的基因序列设计相关基因引物，所有引物由上海生工公司合成。用TRIzol法提取细胞RNA，紫外分光光度计检测总RNA的浓度及纯度。取待测样品总RNA 1 000 ng，按照说明书进行反转录反应合成cDNA。将合成的cDNA进行稀释，取2 μL稀释后的cDNA进行RT-qPCR反应。配制20 μL PCR反应体系：2SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free ddH2O 7.2 μL。PCR反应条件为95 ℃、2 min循环1次；95 ℃、5 s循环40次；60 ℃、30 s循环40次，最后进入熔解曲线。脂肪干细胞内皮向分化相关指标的基因引物序列，见表1。每组检测4个不同的样品(n=4)。以GAPDH为内参基因，根据以下公式进行计算：∆Ct=Ct目的基因-Ct内参基因，∆∆Ct=∆Ct实验样本-∆Ct对照样本，目的基因相对表达量=2-∆∆Ct。

1.4.6 Western blot检测脂肪干细胞内皮向分化相关指标的蛋白表达
实验分组：空白组使用DMEM/F-12完全培养基培养，对照组使用内皮细胞培养基培养，还原型氧化石墨烯组使用含有5 μg/mL还原型氧化石墨烯的内皮细胞培养基培养。诱导时间为9 d。
具体步骤：将脂肪干细胞以4×105个密度接种于6 cm培养皿中，根据实验分组诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化。当细胞汇合度达70%-80%时，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解，并使用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组蛋白质样品，然后将蛋白质转印到PVDF膜上，用含有5%BSA的TBST封闭1 h，用抗CD31(1∶5 000)、抗血管内皮生长因子受体(1∶4 000)和抗GAPDH抗体(1∶20 000)与膜在4 ℃下孵育过夜，用TBST洗涤后，将膜与相应的二抗室温孵育1 h，使用ECL试剂盒和自动化学发光图像分析系统进行蛋白质条带可视化，并对蛋白表达量进行统计分析[20]。
1.4.7 划痕实验评估还原型氧化石墨烯诱导分化后细胞的迁移能力
实验分组：空白组使用DMEM/F-12完全培养基培养，对照组使用内皮细胞培养基培养，还原型氧化石墨烯组使用含有5 μg/mL 还原型氧化石墨烯的内皮细胞培养基培养。诱导时间为9 d。
具体步骤：将脂肪干细胞接种到培养皿中培养24 h，弃去培养基，根据实验分组诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化，期间每隔2 d半量换液，每隔4 d全量换液。诱导9 d后，按1.5×105/孔的密度接种于24孔板中，培养至融合度达到100%，用200 μL微量移液器枪头在单层细胞上做划痕并用PBS清除未贴壁的细胞，然后使用无血清培养基培养24 h，在0，12，24 h时使用相差光学显微镜观察划痕愈合情况并拍照。使用Image J软件测量各组的划痕愈合面积[21]。
1.4.8 小管形成实验评估还原型氧化石墨烯诱导分化后细胞的成管能力
实验分组：空白组使用DMEM/F-12完全培养基培养，对照组使用内皮细胞培养基培养，还原型氧化石墨烯组使用含有5 μg/mL还原型氧化石墨烯的内皮细胞培养基培养。诱导时间为9 d。
具体步骤：首先，将脂肪干细胞接种到培养皿中培养24 h，弃去培养基，根据实验分组诱导脂肪干细胞向血管内皮细胞分化，期间每隔2 d半量换液，每隔4 d全量换液。诱导9 d后，在冰上以50 μL/孔Matrigel基质胶包被96孔板，并于37 ℃孵箱中固化1 h。然后，将诱导后的脂肪干细胞消化、计数并调整细胞浓度，按2×108 L-1，100 μL/孔接种细胞于Matrigel基质胶包被的96孔板中。细胞接种后每隔2 h使用相差光学显微镜观察细胞形态变化，使用Image J分析各组形成小管的主段长度以及节点和网格的数量[22]。
1.5 主要观察指标 ①还原型氧化石墨烯的表征；②还原型氧化石墨烯的安全工作质量浓度；③脂肪干细胞内皮向分化相关指标的基因和蛋白表达；④脂肪干细胞诱导分化后的迁移和血管形成能力。
1.6 统计学分析 每个实验至少进行3次独立的分析。实验数据采用GraphPad Prism 9.0.0软件进行分析，数据以x±s表示，使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验确定组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过深圳大学第一附属医院生物统计学专家审核。

讨论

该研究以红景天提取物为还原剂绿色合成还原型氧化石墨烯。相较于传统化学还原剂(如水合肼、硼氢化钠)，红景天提取物具有以下优势：①无毒性与生物相容性：避免使用剧毒化学品，产物残留无生物毒性，适合生物医学应用(如药物载体、组织工程)[14]；②温和反应条件：通常在常温或低温下进行，无需高温高压或强腐蚀性介质，降低能耗与设备要求[23]；③可持续资源：红景天为可再生植物资源，符合循环经济理念。值得注意的是，红景天提取物在还原氧化石墨烯的过程中，其活性成分可能会通过共价键或氧化偶联反应修饰还原型氧化石墨烯表面，成为材料固有组成部分，这种修饰可以赋予还原型氧化石墨烯传统方法无法实现的生物活性与界面特性。此外，相较于其他植物基还原剂(如绿茶多酚、蜂蜜)，红景天提取物具有以下优势：①还原效率高：邻苯二酚结构比普通酚类(如单酚)电子转移能力更强，还原速率更快[24]；②功能多样性：红景天提取物的糖苷结构可增强还原型氧化石墨烯的水分散性，避免团聚问题[25]；③资源独特性：红景天生长于高海拔极端环境，其提取物具有特殊的抗应激成分，可能赋予还原型氧化石墨烯耐极端条件(如低温、低氧)的性能[26]。
该研究以还原型氧化石墨烯为诱导剂，探究其是否能有效地促进脂肪干细胞内皮向分化及血管形成。首先，通过CCK-8实验明确10 μg/mL及以下浓度的还原型氧化石墨烯对脂肪干细胞的活力无影响。因此，选择10 μg/mL及其以下浓度的还原型氧化石墨烯进行后续实验。接着，使用DMEM/F-12培养基和含不同质量浓度还原型氧化石墨烯的内皮细胞培养基(0，2.5，5，10 μg/mL)诱导脂肪干细胞内皮向分化，通过检测内皮向分化标志物的基因表达评估分化效果，结果显示，无论是否含有还原型氧化石墨烯，脂肪干细胞在内皮细胞培养基中均能够成功表达血管内皮细胞标志物，这是由于内皮细胞培养基含有血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等成分，本身是诱导脂肪干细胞内皮向分化的一种常规方法。然而即使在诱导9 d后，0 μg/mL 还原型氧化石墨烯组内皮细胞标志物表达仍然较低，这一结果与之前报道的脂肪干细胞内皮分化效率低一致[15]。另外，与0 μg/mL还原型氧化石墨烯组相比，2.5，5，10 μg/mL还原型氧化石墨烯组脂肪干细胞标志物的表达显著减少，血管内皮细胞标志物的表达显著增加，说明还原型氧化石墨烯可以显著提高脂肪干细胞的内皮分化效率。此外，与2.5 μg/mL还原型氧化石墨烯组相比，5 μg/mL还原型氧化石墨烯组和10 μg/mL还原型氧化石墨烯组诱导脂肪干细胞内皮向分化的能力显著增强，其中5 μg/mL还原型氧化石墨烯组诱导6 d时CD31的表达量以及诱导9 d时CD31和血管性血友病因子的表达量显著高于10 μg/mL还原型氧化石墨烯组，其他内皮向分化相关指标则无显著性差异。鉴于5 μg/mL还原型氧化石墨烯组具有更好的促分化效果和更高的生物安全性，选择5 μg/mL还原型氧化石墨烯进行后续实验。在诱导6 d时各组内皮向分化指标的基因表达已具有显著性差异，在9 d时差异进一步增大，说明诱导9 d具有更好的促分化效果。另外由于RT-qPCR检测的是转录水平的改变，而从转录到蛋白翻译和功能发挥，需要一定的时间。因此，在诱导时间上，选择诱导9 d进行后续实验。综上，5 μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9 d是使脂肪干细胞内皮向分化效率最高的时间浓度组合，因此选择该时间浓度组合进行后续的诱导后细胞血管形成功能检测。通过划痕实验和小管形成实验明确在该时间浓度组合下，诱导分化的细胞具有形成血管的功能活性。值得注意的是，除了能够提高脂肪干细胞内皮向分化的效率，这种方法诱导出的细胞具有成熟的血管内皮细胞功能，这提示它们可能具有良好的血管形成能力、细胞间连接特性以及对血流动力学的适应性等，这些功能对于构建具有功能性血管的组织至关重要。
此外，还原型氧化石墨烯的生物相容性是一个复杂且备受关注的问题[10]。一方面，还原型氧化石墨烯展现出一定良好的生物相容性特征，其独特的二维平面结构和较大的比表面积，使它能够与生物分子和细胞发生相互作用，并且在适当的修饰和处理下，可支持细胞的黏附、增殖和分化。例如，在组织工程领域，还原型氧化石墨烯被引入到支架材料中，有助于细胞在支架上更好地铺展和生长，促进组织修复与再生[27]。同时，还原型氧化石墨烯具有较好的化学稳定性，在生理环境中不易发生剧烈的化学反应，这为其在生物体系中的应用提供了一定保障[28]。然而，还原型氧化石墨烯在机体内的滞留也可能带来潜在危害。由于还原型氧化石墨烯具有较强的疏水性，进入机体后可能难以被正常代谢清除，容易在体内蓄积，长时间滞留在体内的还原型氧化石墨烯可能引发炎症反应，刺激免疫系统，导致免疫细胞的异常激活和炎症因子的释放，进而对周围组织和器官造成损伤[29]。此外，还原型氧化石墨烯的锐利边缘可能会物理性地损伤细胞和生物大分子，干扰细胞内正常的生理过程。而且，还原型氧化石墨烯在体内的长期存在还可能影响生物体内的信号传导通路，对细胞间通讯和机体的正常生理功能产生不良影响[30]。因此，在将还原型氧化石墨烯应用于生物医学领域时，必须充分考虑其生物相容性以及在机体内滞留可能带来的危害，开展深入研究以确保其安全性和有效性。
然而，该研究也存在以下局限性：一是在制备工艺上存在不足。在还原型氧化石墨烯制备过程中，缺少对红景天提取物的质量进行检测，若可以补充相关实验明确各批次间红景天提取物质量的一致性将使研究更为完整。例如，使用高效液相色谱法测定红景天苷等主要成分含量；使用薄层色谱法对成分进行定性分析，明确是否含目标成分及杂质；使用紫外-可见分光光度法测定某类成分总量等[31]。此外，在还原型氧化石墨烯制备过程中可能存在红景天提取物残留，虽然已通过过滤、多次充分洗涤以及冷冻干燥等方式尽可能减少红景天的残留量，可以在还原型氧化石墨烯使用之前，再次洗涤获取上清，采用高效液相色谱法明确制得的还原型氧化石墨烯中红景天残留量将使研究更为严谨。二是该研究仅为细胞层面研究，缺少动物实验。动物实验能反映完整生物体的综合反应，涵盖多组织器官间相互作用，可模拟更真实生理病理状态；而细胞实验多局限于单一细胞类型或简单细胞体系。此外，通过动物实验可对新药物或新治疗方法进行安全性和有效性的初步评估，避免直接应用于人体带来的潜在风险，为后续临床试验奠定坚实基础。
综上，该研究成功绿色合成还原型氧化石墨烯，并对其形貌、结构、促内皮向分化及血管形成性能进行了全面评价，结果表明绿色合成的还原型氧化石墨烯可以有效提高脂肪干细胞内皮向分化效率和血管形成能力，为其在组织工程血管化领域的应用提供了重要的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

还原型氧化石墨烯提高脂肪干细胞内皮向分化效率及血管形成能力

Reduced graphene oxide improves endothelial differentiation efficiency and angiogenesis ability of adipose-derived stem cells

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