3D培养血管基质成分自组装复杂结构血管化成骨类器官

doi:10.12307/2026.112

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (11): 2681-2690.doi: 10.12307/2026.112

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3D培养血管基质成分自组装复杂结构血管化成骨类器官

吴佳洲1，2，钱陶2，刘泽贤2，武艳斌2，何莹2，李亚洲2，彭江1，2

1贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；2中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所，北京市 100853

收稿日期:2025-02-06 接受日期:2025-06-09 出版日期:2026-04-18 发布日期:2025-09-02
通讯作者: 彭江，博士，教授，主任医师，贵州医科大学附属医院骨科，贵州省贵阳市 550004；中国人民解放军总医院第四医学中心骨科医学部研究所，北京市 100853
作者简介:吴佳洲，男，1998年生，浙江省绍兴市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事类器官和组织工程领域的研究。
基金资助:
国家重点研发计划课题项目(2024YFA1108605)，项目负责人：彭江

Three-dimensional culture of stromal vascular fraction self-assembles into complex vascularized osteogenic organoids

Wu Jiazhou1, 2, Qian Tao2, Liu Zexian2, Wu Yanbin2, He Ying2, Li Yazhou2, Peng Jiang1, 2

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Institute of Orthopedics, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Received:2025-02-06 Accepted:2025-06-09 Online:2026-04-18 Published:2025-09-02
Contact: Peng Jiang, MD, Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Institute of Orthopedics, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
About author:Wu Jiazhou, MS candidate, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Institute of Orthopedics, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
Supported by:
National Key Research and Development Program of China, No. 2024YFA1108605 (to PJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血管基质成分：从脂肪组织中提取的细胞复合体，包括脂肪来源干细胞、内皮细胞等多种细胞类型，用于再生医学和组织工程，促进组织修复和再生。
类器官：由干细胞或前体细胞在体外特定条件下自组织形成的微型三维组织结构，能够模拟真实器官的结构和功能，被广泛应用于疾病建模、药物筛选和生物医学研究。

背景：相较于2D培养技术，3D培养技术能够更准确地模拟细胞自然生长的体内环境，成为基础科学研究和转化医学领域的关键焦点。
目的：通过3D培养技术构建预血管化的成骨类器官。
方法：从同一人体脂肪组织中分别分离提取血管基质成分、脂肪间充质干细胞，通过流式细胞学鉴定细胞组分。将血管基质成分、脂肪间充质干细胞分别接种于96孔U型板内，培养3 d后血管基质成分自组装成型、脂肪间充质干细胞成球，培养第14天，通过苏木精-伊红染色与细胞骨架染色观察球体内部结构和细胞形态；培养0，7，14，21 d，Presto Blue实验检测细胞活性；培养3 d后分别进行成骨、成软骨与成脂诱导分化，诱导14 d后，茜素红染色观察成骨分化，阿利新蓝染色观察成软骨分化，油红O染色观察成脂分化，免疫荧光染色共定位成骨诱导后CD31(内皮细胞标志物)、RUNX2(早期成骨标志物)、CD44(间充质干细胞标志物)、Ⅰ型胶原(晚期成骨标志物)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(成脂标志物)的表达，qRT-PCR检测成骨诱导后RUNX2、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、Sp7转录因子、CD31和血管内皮生长因子mRNA表达。
结果与结论：①流式细胞分析表明，血管基质成分包含脂肪间充质干细胞和内皮细胞等多种细胞类型，脂肪间充质干细胞球主要由脂肪间充质干细胞构成；②苏木精-伊红染色及细胞骨架染色显示，相对于脂肪间充质干细胞球，血管基质成分类器官结构更贴近天然组织，细胞排列有序，细胞外基质更丰富；细胞活性测试显示，脂肪间充质干细胞球培养7 d的细胞活性高于血管基质成分类器官(P < 0.05)，培养21 d的细胞活性低于血管基质成分类器官(P < 0.05)，说明血管基质成分类器官的细胞活性持续时间更长；③相较于脂肪间充质干细胞球，血管基质成分类器官具有更优的骨、软骨和脂肪形成能力；多色免疫荧光共定位显示，血管基质成分类器官中血管网络和成骨标志物表达丰富，细胞间和细胞-基质相互作用复杂，脂肪间充质干细胞球结构单一且缺乏内皮细胞基因表达；qRT-PCR检测结果显示，血管基质成分类器官中RUNX2、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、Sp7转录因子、CD31和血管内皮生长因子mRNA表达均高于脂肪间充质干细胞球(P < 0.05)；④结果表明，血管基质成分类器官具备复杂的生理结构和更强的血管形成和骨形成能力，以及更持久的细胞活性。
https://orcid.org/0009-0003-1793-9639(吴佳洲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 三维培养, 血管基质成分, 脂肪间充质干细胞, 内皮细胞, 类器官, 成骨分化, 血管生成, 工程化材料

Abstract: BACKGROUND: Compared with two-dimensional culture techniques, three-dimensional culture technology can more accurately simulate the in vivo environment of natural cell growth, which becomes a key focus in the fields of basic scientific research and translational medicine.
OBJECTIVE: To construct prevascularized osteogenic organoids through three-dimensional culturing techniques.
METHODS: Stromal vascular fraction (SVF) and adipose mesenchymal stem cells were isolated and extracted from the same human adipose tissue, and the cell components were identified by flow cytometry. The SVF and adipose mesenchymal stem cells were inoculated into 96-well U-plates. After 3 days of culture, the SVF was self-assembled and the adipose mesenchymal stem cells were formed into spheres. On the 14th day of culture, the internal structure of the spheres and cell morphology were observed by hematoxylin-eosin staining and cytoskeletal staining. Viability of the cells was detected by Presto Blue assay on days 0, 7, 14, and 21 of culture. Osteogenic, chondrogenic, and lipogenic differentiation were induced after 3 days of culture. After 14 days of induction, alizarin red staining was used to observe osteogenic differentiation; alizarin blue staining to observe chondrogenic differentiation; oil red O staining to observe lipogenic differentiation; immunofluorescence staining to co-localize CD31 (endothelial cell marker), RUNX2 (early osteogenic marker), CD44 (mesenchymal stem cell marker), type I collagen (late-stage osteogenic marker), and peroxisome proliferator-activated receptor γ (lipogenic markers); and qRT-PCR to detect the mRNA expression of RUNX2, osteopontin, type I collagen, Sp7 transcription factor, CD31, and vascular endothelial growth factor.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Flow cytometry results revealed that the SVF contained various cell types including adipose mesenchymal stem cells and endothelial cells, whereas adipose mesenchymal stem cell spheroids were primarily composed of adipose mesenchymal stem cells. (2) Hematoxylin-eosin staining with cytoskeleton staining indicated that compared with adipose mesenchymal stem cell spheroids, SVF organoids more closely mimicked natural tissue structures with orderly arranged cells and richer extracellular matrix. Cell viability tests showed that adipose mesenchymal stem cell spheroids had higher activity on day 7, but SVF organoids surpassed the cells by day 21 (P < 0.05), exhibiting longer-lasting cell viability. (3) In tri-lineage differentiation experiments, SVF organoids demonstrated superior osteogenic and chondrogenic potential compared with adipose mesenchymal stem cell spheroids. Multicolor immunofluorescence colocalization revealed rich vascular networks and pronounced osteogenic marker expression in SVF organoids, with complex cell-to-cell and cell-to-matrix interactions, whereas adipose mesenchymal stem cell spheroids showed a simpler structure with a lack of endothelial gene expression. qRT-PCR results indicated significantly higher expression of RUNX2, osteopontin, type I collagen, Sp7 transcription factor, CD31, and vascular endothelial growth factor in SVF organoids compared with adipose mesenchymal stem cell spheroids (P < 0.05). Overall, the findings suggest that SVF organoids possess complex physiological structures with enhanced capabilities in vascular and bone formation, as well as sustained cell viability.

Key words: three-dimensional culture, stromal vascular fraction, adipose mesenchymal stem cells, endothelial cells, organoids, osteogenic differentiation, angiogenesis, engineered materials

中图分类号:

吴佳洲, 钱陶, 刘泽贤, 武艳斌, 何莹, 李亚洲, 彭江, . 3D培养血管基质成分自组装复杂结构血管化成骨类器官[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(11): 2681-2690.

Wu Jiazhou, Qian Tao, Liu Zexian, Wu Yanbin, He Ying, Li Yazhou, Peng Jiang. Three-dimensional culture of stromal vascular fraction self-assembles into complex vascularized osteogenic organoids[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(11): 2681-2690.

图/表（结果） 4

2.1 血管基质成分和原代脂肪间充质干细胞表型检测结果流式细胞术检测结果显示，扩增培养后的原代脂肪间充质干细胞中的脂肪间充质干细胞(CD45-/CD73+/CD90+)比例较血管基质成分显著富集[(98.58±1.55)%，(70.9±9.17)%，P < 0.01]，内皮祖细胞(CD45-/CD31+/CD34+)比例明显低于血管基质成分[(0.03±0.04)%，(6.04±2.95)%，P < 0.01]，见图1。
2.2 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球大体观和细胞形态染色图2A，B分别为脂肪间充质干细胞球和血管基质成分类器官在96孔超低黏附U型板中培养3 d后自组装聚集成球的宏观表现，可见两者尺寸无明显差异，但血管基质成分类器官底下有红细胞层衬托。苏木精-伊红、细胞骨架染色结果显示，脂肪间充质干细胞球表现为相同细胞的无序堆积，细胞外基质较少，细胞骨架无序且杂乱；血管基质成分类器官表现为更丰富的细胞外基质，细胞排列更加有序，细胞骨架也显示出更符合生理的结构特点，见图2C-J。
2.3 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球的细胞活性比较成球培养第0，14天，血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球的吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，脂肪间充质干细胞球成球培养第7天的吸光度值大于血管基质成分类器官
(P < 0.05)、成球培养第21天的吸光度值小于血管基质成分类器官(P < 0.05)，见图3。在成球后21 d的培养过程中，脂肪间充质干细胞球的细胞活性先升高再下降，血管基质成分类器官的细胞活性始终保持上升趋势，说明血管基质成分类器官具有更持久更稳定的细胞活性。
2.4 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球成骨成脂成软骨分化能力成骨诱导14 d后，血管基质成分类器官中矿化沉积的红染钙结节较脂肪间充质干细胞球更多、颗粒更大，茜素红相对平均表达量高于脂肪间充质干细胞球(P < 0.001)，见图4A-C。成脂诱导14 d后，血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球的红染脂质油滴都主要集中在球体外周，其中血管基质成分类器官的脂滴更大，血管基质成分类器官油红O相对平均表达量高于脂肪间充质干细胞球(P < 0.01)，见图4D-F。成软骨诱导14 d后，血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球阿利新蓝染色均可见阳性表达，其中血管基质成分类器官蓝染颜色更深，表明有更多的软骨特异性细胞外基质产生，血管基质成分类器官阿利新蓝相对平均表达量显著高于脂肪间充质干细胞球(P < 0.01)，见图4G-I。上述结果证明两者均有三系诱导分化潜能，血管基质成分类器官的成骨成脂成软骨潜能明显强于脂肪间充质干细胞球。
2.5 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球多色免疫荧光共定位结果成骨诱导14 d后免疫荧光染色共定位结果显示(图5)，血管基质成分类器官中血管内皮细胞标志物CD31(绿色)表达明显，并且形成了血管网络状的结构，脂肪间充质干细胞球中CD31表达较弱；早期成骨标志物RUNX2(红色)在血管基质成分类器官中也形成了一种独特的分布，主要集中在球体内部并分布在内皮细胞周围，脂肪间充质干细胞球中的RUNX2呈现均匀分布；晚期成骨标志物Ⅰ型胶原(青色)在血管基质成分类器官中形成网络状的更符合生理特征的有序分布，而在脂肪间充质干细胞球中为颗粒状的散在分布且表达较弱；间充质干细胞标志物CD44(紫色)在两种球体中的表现相似，都较均匀地分布于整个球体；成脂标志物过氧化物酶体增殖物激活受体γ(橙色)在两种球体中的表达均较弱，说明成骨诱导分化后两种球体内的脂肪间充质干细胞成脂基因表达都在减弱，成脂能力降低。结果表明血管基质成分类器官形成了复杂且有序的内部结构，并且拥有良好的骨和血管生成能力。
2.6 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体外成骨成血管基因表达检测成骨诱导14 d后，qRT-PCR 检测结果显示，血管基质成分类器官成骨相关标志物RUNX2、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、Sp7转录因子mRNA 表达量均高于脂肪间充质干细胞球(P < 0.01或P < 0.001)，成血管相关标志物CD31、血管内皮生长因子mRNA表达量均高于脂肪间充质干细胞球(P < 0.001)，见图6。

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引言

相较于2D培养技术，3D培养技术能够更准确地模拟细胞自然生长的体内环境，成为基础科学研究和转化医学领域的关键焦点[1]。在3D培养中，细胞嵌入于丰富的细胞外基质构成复杂的三维结构，这种结构不仅支持空间上的三维分布，还促进细胞间及细胞与基质之间的交互作用，对细胞的排列和功能有重要影响[2]。3D培养技术提供了一个仿生的环境，极大地促进了特定生物功能器官结构的形成，为组织工程提供了新的可能性[3]。对比之下，2D培养系统虽提供基本模型，但无法复现体内复杂的成分和结构，因此，实验室已开始开发多种组织的3D培养模型，以更好地恢复天然组织功能、细胞异质性及特定的细胞微环境，其中三维结构起到了关键作用[4-6]。
在胚胎发育期间，骨形成是通过骨生成和血管生成及内皮细胞的紧密相互作用共同推动的。此次研究创新性地探索使用血管基质成分自组装成预血管化成骨类器官的潜力，旨在显著提升组织工程中移植后的再生效果及功能维持，这对于再生医学领域是一大突破[7]。脂肪间充质干细胞的3D培养创造了有利的空间环境，促进血管和成骨过程的形态发生，并模拟这些过程的交互作用[8-9]。由于成骨细胞仅在200 μm范围内有效交换气体和营养物质，构建预血管化结构变得至关重要[10]。目前，常见的方法包括在单层培养或水凝胶中将不同细胞固定在基质上共同培养，以促进骨组织的血管生成[11-12]，如将骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞结合使
用[13]，尽管这是一种有效方法，但由于细胞来源的差异限制了该方法在自体移植中的应用。研究显示，脂肪间充质干细胞在血管生成方面具有明显优势，不仅因为它们包含能够分化为内皮细胞、骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的多能细胞群体，还因为它们通过旁分泌作用能够刺激血管生成[14-16]。与脂肪间充质干细胞相比，从人体脂肪组织中提取的血管基质成分也具有独特的优势，血管基质成分是一种异质细胞群，不仅包括内皮细胞、脂肪间充质干细胞、血管周细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和前脂肪细胞，而且作为产生高度血管化骨移植物的有效原代细胞来源[17-19]，能够作为干细胞和内源性内皮细胞的来源，用于生成血管化的类器官。由于血管生成和骨形成是相互依赖的过程，血管化是在创造尽可能接近原生态功能模型时的一个关键考虑因素[20]；此外，血管化的骨组织工程移植物还提供了额外的优势，如与原位血管快速连接及支持血管的存活和功能[21]，这不仅加速了组织整合，还减少了缺氧和细胞死亡的风险[22-23]。目前关于血管基质成分类器官的研究尚且不足，并且主要是用于生成血管化脂肪类器官，用于整形外科脂肪填充和2型糖尿病的治疗，缺乏关于骨组织工程方面的应用[24-27]。
因此，此次研究利用血管基质成分作为脂肪间充质干细胞和内源性内皮细胞的来源，不仅旨在探索通过3D培养系统实现血管基质成分的血管化及成骨分化的能力，而且详细描述了这些复杂类器官结构的构建结果，以期为模拟体内环境的体外研究平台提供坚实的实验数据和分析结果，为骨组织再生和修复机制的深入研究打下基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计体外观察性实验。
1.2 时间及地点实验于 2022年11月至 2024年5月在中国人民解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料

1.3.1 脂肪组织实验所用脂肪组织取自中国人民解放军总医院第四医学中心行吸脂手术的10例患者，均为男性，年龄28-35岁，中位年龄32岁，体质量指数(24.57±3.93) kg/m2。脂肪供者人口学特征见表1。所有供者无全身代谢及内分泌疾病，无酗酒及吸烟史，无服用利尿剂等影响糖类脂类代谢药物史。供者对实验均知情同意，并签署了知情同意书。实验方案已通过中国人民解放军总医院伦理委员会批准(编号：2023KY088-KS001)。

1.3.2 主要试剂与材料 96孔超低黏附U型板(Corning，美国)；LiberaseTM 研究级(Roche，瑞士)；T75培养瓶(Corning，美国)；苏木精-伊红染色液(索莱宝，中国)；成骨诱导培养基、成软骨诱导培养基、成脂诱导培养基、茜素红染色液、阿利新蓝染色液、油红O染色液(赛业，中国)；PrestoBlue™ HS细胞活力检测试剂(Thermo Fisher，美国)；人间充质干细胞无血清培养基(MSC-T4)，人间充质干细胞培养基血清替代物(BASO，美国)；小鼠来源微管一抗(Abcam ab7291，美国)；小鼠来源CD31一抗(Abcam ab9498，美国)；兔来源RUNX2一抗(Abcam ab192256，美国)；兔来源Ⅰ型胶原一抗(Abcam ab138492，美国)；兔来源CD44一抗(Abcam ab254530，美国)；兔来源过氧化物酶体增殖物激活受体γ一抗(Abcam ab45036，美国)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(诺唯赞，中国)；七色多重荧光染色试剂盒(博士德 PTSA-67，中国)。
1.3.3 主要仪器全组织切片多色荧光定量分析仪(Akoya，美国)；荧光显微镜(Nikon，日本)；实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher，美国)；全景共聚焦数字切片扫描仪(达迈，中国)；流式细胞仪(BD LSRFortessa Special Order Research Product，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 分离血管基质成分与脂肪间充质干细胞无菌条件下获取抽吸的脂肪，每例吸脂脂肪标本均在获取后6 h内进行脂肪基质血管成分的提取操作。将人脂肪抽吸物用生理盐水清洗一遍，900 r/min离心1 min后去除上层油层及下层液体层，留取中间脂肪层，记录剩余脂肪组织的体积。将每例脂肪样本分为2份，一份 20 mL(用于分离提取血管基质成分)，另一份5 mL(用于分离提取脂肪间充质干细胞)，将来自同一脂肪样本的血管基质成分与脂肪间充质干细胞进行比较分析。
分离提取血管基质成分：将脂肪样本于终质量浓度为0.1 mg/mL的Liberase胶原酶中37 ℃水浴消化45 min，加入含血清替代物的MSC-T4培养基以中和胶原酶的作用，1 500 r/min离心10 min后弃上层油、未消化脂肪和其余上清，将剩余的血管基质成分用少量含血清替代物的MSC-T4培养基重悬，用100 μm滤网过滤，计数细胞数量并调整细胞悬液浓度，最终以3×105/孔的密度(计数时不计算红细胞)接种于96孔U型板，每孔含200 μL MSC-T4培养基。
分离提取脂肪间充质干细胞：将脂肪样本于终质量浓度为0.1 mg/mL的Liberase胶原酶消化得到细胞悬液，将细胞悬液分装入数个75 cm2培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。待细胞融合达80%-90%后胰酶消化，将原代脂肪间充质干细胞按照3×105/孔的密度接种至96孔U型板，每孔含200 μL MSC-T4培养基。
1.4.2 血管基质成分和脂肪间充质干细胞的细胞成分检测识别并验证血管基质成分和原代脂肪间充质干细胞在成球前的细胞组成，以评估细胞类型的丰富度和多样性。取血管基质成分和原代脂肪间充质干细胞的单细胞悬液，2 000 r/min离心5 min后弃上清，加1.4 mL PBS，吹打混匀重悬沉淀细胞，细胞浓度调至1×109 L-1，将细胞悬液分别移入7个1.5 mL EP管中，每管0.2 mL。将7个EP管分别编号为 A、B、C、D、E、F、G。向A管中加入CD31、CD34、CD45、CD73、CD90一抗作为样本组。为调节荧光补偿，向B管中加入CD3一抗，向C管中加入 CD34一抗，向D管中加入CD45一抗，向E管中加入CD73 一抗，向F管中加入CD90一抗，作为5个单阳管对照；向G管中加入PBS，作为空白对照。此后向所有7个EP管中加入1 μL活死染料常温避光孵育30 min，孵育结束后，每管加入1 mL PBS充分洗涤，2 000 r/min离心5 min后弃上清，重复2次。每管中加入0.2 mL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，利用FlowJo软件对所得数据进行分析。
1.4.3 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体构建和细胞结构染色通过三维自组装方法构建血管基质成分来源的复杂结构类器官，以探索二者模拟自然组织结构的能力。将血管基质成分、脂肪间充质干细胞分别接种于96孔U型板内，细胞密度为3×105/孔，每孔加MSC-T4完全培养基200 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。每天半量更换培养基，直到第3天血管基质成分类器官自组装成型。脂肪间充质干细胞只需12 h即可成球，但为了统一培养时间也半量换液直到3 d。成球后记为第0天，之后可更换成骨诱导培养基或其他培养基，也可继续用MSC-T4完全培养基培养，每天半量更换培养基。
MSC-T4完全培养基培养第14天，取血管基质成分类器官与脂肪间充质干细胞球，拍摄培养大体观后用40 g/L多聚甲醛固定15 min，制作5 μm厚度冰冻切片：①进行苏木精-伊红染色，镜下观察细胞球形态。②细胞骨架染色：用PBS清洗10 min，用5%牛血清白蛋白封闭30 min，滴加小鼠来源微管一抗(1∶200稀释)于37 ℃ 孵育2 h，用PBS冲洗3次，每次5 min；滴加HRP标记的二抗于37 ℃孵育30 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；滴加TSA-520荧光染料(经TSA buffer进行1∶200稀释)避光室温孵育15 min，用用PBS冲洗3次，每次5 min；抗荧光淬灭封固剂封固，置于荧光显微镜下观察并拍摄全景图片。
1.4.4 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体细胞活性检测比较血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球在不同培养时间点的细胞活性，以评估二者的长期生存能力。培养0，7，14，21 d，向细胞培养孔中加入10%Presto Blue试剂，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育1 h，吸取100 μL上清至96孔平板，用酶标仪测定570 nm和600 nm波长处吸光度值，归一化至600 nm波长处吸光度值，评估细胞活性。
1.4.5 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体成骨诱导及茜素红染色通过诱导血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球进行成骨分化，评估二者的成骨分化潜能。血管基质成分和脂肪间充质干细胞培养3 d成球后，开始更换为成骨诱导培养基，每天半量更换培养基，持续诱导14 d。诱导结束后，40 g/L多聚甲醛固定15 min，进行5 μm厚度冰冻切片，用PBS冲洗10 min，滴加茜素红染色液室温孵育10 min，用PBS清洗3遍以去除多余染色液，封固后于显微镜下观察并拍照，使用Image J软件对茜素红平均表达量进行定量分析。
1.4.6 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体成软骨诱导及阿利新蓝染色通过诱导血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球进行成软骨分化，评估二者的成软骨分化潜能。血管基质成分和脂肪间充质干细胞培养3 d成球后，开始更换为成软骨诱导培养基，每天半量更换培养基，持续诱导14 d。诱导结束后，40 g/L多聚甲醛固定15 min，进行5 μm厚度冰冻切片，用PBS冲洗10 min，滴加阿利新蓝染色液室温孵育1 h，用PBS清洗3遍以去除多余染色液，封固后于显微镜下观察并拍照，使用Image J软件对油红O平均表达量进行定量分析。
1.4.7 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体成脂诱导及油红O染色通过诱导血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球进行成脂分化，评估二者的成脂分化潜能。血管基质成分和脂肪间充质干细胞培养3 d成球后，开始更换为成脂诱导培养基，持续诱导14 d。诱导结束后，40 g/L多聚甲醛固定15 min，进行5 μm厚度冰冻切片，用PBS冲洗10 min，滴加油红O染色液室温孵育30 min，用PBS清洗3次洗以去除多余染色液，封固后于显微镜下观察并拍照，使用Image J软件对阿利新蓝平均表达量进行定量分析。
1.4.8 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体免疫荧光染色分析并可视化血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球中关键蛋白的表达和局部化，特别是血管和骨组织标志物。取成骨诱导培养第14天的血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球，40 g/L多聚甲醛固定15 min，进行5 μm厚度冰冻切片，用PBS冲洗3次，每次5 min；用5%牛血清白蛋白封闭 30 min，滴加小鼠来源CD31一抗(1∶200稀释)于37 ℃孵育2 h，用PBS冲洗3次，每次5 min；滴加HRP标记的二抗于37 ℃孵育30 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；滴加TSA-480荧光染料(经TSA buffer进行1∶200稀释)避光室温孵育15 min，用PBS冲洗3次，每次5 min；用EDTA抗原修复液于37 ℃水浴30 min，用PBS冲洗3次，每次5 min，之后重复封闭到抗原修复过程进行每一轮抗原标记，每一轮分别用不同的一抗和荧光染料：兔来源RUNX2(1∶200稀释)一抗对应TSA-520荧光染料，兔来源Ⅰ型胶原(1∶200稀释)一抗对应TSA-570荧光染料，兔来源CD44(1∶200稀释)一抗对应TSA-620荧光染料，兔来源过氧化物酶体增殖物激活受体γ(1∶200稀释)一抗对应TSA-690荧光染料，然后滴加DAPI染色液避光室温孵育10 min，用PBS冲洗3次，每次5 min，抗荧光淬灭封固剂封固，置于多色荧光定量分析仪观察拍摄全景图片。

1.4.9 血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球体体外成骨相关基因表达检测定量分析血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球在成骨和成血管过程中的关键基因表达。取成骨诱导培养第14天的血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球，按照RNA提取试剂盒说明书提取样本总RNA，按照反转录试剂盒方法，采用20 μL体系进行反转录，将反转录所得cDNA进行qRT-PCR扩增，扩增反应条件为：95 ℃预变性30 s， 95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重复40个循环，检测RUNX2、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原、Sp7转录因子、CD31、血管内皮生长因子的mRNA表达，以同一样本GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt 方法计算各基因相对表达量。实验中使用的引物序列见表2。

1.5 主要观察指标血管基质成分类器官和脂肪间充质干细胞球的细胞成分、结构特征、细胞活性以及成骨、成软骨、成脂能力。
1.6 统计学分析所有实验均至少重复3次。采用GraphPad Prism 10.0进行统计分析并绘图，所得计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过中国人民解放军总医院统计学专家审核。

讨论

类器官是由体外3D培养祖细胞衍生的多种组织特异性细胞类型构成的“微型”器官。根据LANCASTER和KNOBLICH的定义，类器官需满足3个条件：包含多种器官特异性细胞类型，能够模拟器官的特定功能，并且它的细胞组成在空间上须与原器官相似[28-29]。已成功开发的类器官包括模拟肠道、肝脏、心脏和大脑的微型器官[30-33]，这些组织类器官被广泛用于研究细胞行为、探索组织生物学动力学以及开发新药[34-35]。随着类器官应用的拓展，它的组成和构建技术也在不断进步，然而，类器官的生长常因为培养时间延长和组织块体积过大导致细胞坏死或未能完全成熟，这限制了再现组织结构的大规模特征以及基于类器官治疗方法的发展[36]。最新的组织工程方法通过整合血管系统来维持细胞活性和功能，其中通常将内皮细胞纳入类器官被认为是重要的步骤，不仅能更好地模拟相关的天然组织生物学，还可能作为植入和灌注的前体[24，37]。此次实验采用3D培养自组装技术和天然血管基质成分在体外构建复杂的血管基质成分血管化成骨类器官，分析其细胞结构和活性，并研究了血管基质成分血管化成骨类器官的分化能力及相关成骨和血管形成基因的表达。
球体或类器官形式的细胞3D培养已被广泛认为是单层培养与天然组织之间的桥梁[25]。在3D培养中，不同细胞通过细胞连接、微囊泡交换以及与细胞外基质的多级互动获得新的功能性，这些互动共同调节它们的集体行为并恢复原始的细胞表型和功能活性[38]。前人研究已经证明球体内的不同细胞间连接和细胞-基质互动促进了局部微环境的形成，这有助于适当的细胞分化[39-40]。此次实验使用包含脂肪间充质干细胞和内皮细胞的血管基质成分构建3D类器官，流式细胞分析揭示血管基质成分中内皮细胞含量为(6.04±2.95)%，而初代培养脂肪间充质干细胞中内皮细胞的含量极低。组织学和细胞骨架染色结果显示，血管基质成分血管化成骨类器官中的细胞排列更加有序且复杂，细胞外基质更为丰富，细胞骨架呈现更伸展的形态，表明血管基质成分中不同细胞类型的共培养为细胞提供了优化的生长微环境。Presto Blue细胞活性实验进一步显示，血管基质成分血管化成骨类器官的细胞活性在培养21 d后仍在上升，而单一脂肪间充质干细胞球体虽然在第7天显示较高活性(这也可能由于其较高的干细胞比例)，但在长期维持细胞活性方面表现出局限性。
脂肪间充质干细胞与内皮细胞的相互作用已在多项研究中得到证实。2019年，MULLER等[41]在Matrigel植入模型中展示了脂肪间充质干细胞如何通过旁分泌作用和促进心脏祖细胞的内皮分化来刺激体内血管样结构的形成和稳定。2023年，ESCUDERO等[25]指出内皮细胞为脂肪间充质干细胞提供了生态位，由于它们源于血管周围/内皮层，这种密切的联系使得干细胞能够有效获取营养、氧气和生长因子等必需物质。骨组织的高度血管化对于骨骼的发育、再生和重塑至关重要，因为这些过程需要氧气和营养物的运输。2019年，YAN等[13]通过将聚己内酯支架与人脐静脉内皮细胞及骨髓间充质干细胞共培养，有效增强了体内的骨再生和血管化。此次实验采用天然血管基质成分中的内皮细胞储备进行类器官的血管化，这种方法相对于引入其他来源的内皮细胞，可以避免自体移植时的免疫排斥问题。体外三系分化结果表明，相比于脂肪间充质干细胞球体，血管基质成分血管化成骨类器官在成骨、成脂、成软骨分化能力上表现更佳，表明血管基质成分中的脂肪间充质干细胞拥有更好的干性和分化潜能。通过不同抗原的共定位分析发现，血管基质成分血管化成骨类器官中的内皮细胞能够形成结构完整的类毛细血管网络，成骨标志物的表达也主要集中在内皮细胞周围；此外，qRT-PCR检测结果显示，血管基质成分血管化成骨类器官在成骨和血管生成相关基因的表达水平普遍高于脂肪间充质干细胞球，这与前人的研究结论一致[42-43]。这些发现进一步证实了血管基质成分血管化成骨类器官在组织结构和功能上的优越性，突出了其在血管网络和骨生成能力方面的潜能。
综上所述，此次研究采用3D培养自组装技术，利用天然血管基质成分成功构建了具有天然组织微观结构和高细胞活性的血管化成骨类器官，相比传统的脂肪间充质干细胞球体，这些类器官在成骨和血管生成上表现出显著优势，特别是在治疗大段骨缺损、骨坏死和骨不连等难治性骨科疾病方面展现出巨大的应用潜力，这一成果不仅展示了3D自组装技术在模拟复杂生物过程中的潜力，也为未来在这些临床难题中的实际应用奠定了坚实的技术基础。然而该实验也存在一些局限性，要全面理解并应用这一技术，仍需深入研究血管基质成分中不同细胞组分之间的相互作用及其促进分化的具体机制；此外，为了进一步验证这些血管化类器官的实际应用效果，还需要在体内模型中进行测试，特别是其在促进骨组织损伤修复方面的能力；此次实验没有研究不同细胞培养密度对实验结果的影响，以及不同培养基成分和培养时间的影响，这将在后续的研究中进一步探索优化；另外，在接下来的实验中要充分考虑到不同个体中血管基质成分细胞异质性高导致的结果不一致等问题，扩大样本量并严格控变量，增加实验结果的可靠性。通过这些综合评估和优化，该研究旨在推动体外类器官构建技术的进一步发展，为再生医学领域带来创新和实际价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

3D培养血管基质成分自组装复杂结构血管化成骨类器官

Three-dimensional culture of stromal vascular fraction self-assembles into complex vascularized osteogenic organoids

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