生理渗透压对软骨分化和细胞外基质代谢的影响

doi:10.12307/2026.284

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (35): 9143-9150.doi: 10.12307/2026.284

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生理渗透压对软骨分化和细胞外基质代谢的影响

陈奕达，程歆怡，赵环，周熙超，顾巧丽，林潇，施勤

苏州大学附属第一医院骨科，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2025-11-04 修回日期:2026-03-18 出版日期:2026-12-18 发布日期:2026-04-25
通讯作者: 施勤，博士，教授，苏州大学附属第一医院骨科，苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006
作者简介:陈奕达，男，2000年生，甘肃省白银市人，汉族，2025年苏州大学毕业，主要从事骨关节炎研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82172485)，项目负责人：施勤；国家自然科学基金面上项目(32371385)，项目负责人：林潇

Effects of physiological osmotic pressure on chondrocyte differentiation and extracellular matrix metabolism

Chen Yida, Cheng Xinyi, Zhao Huan, Zhou Xichao, Gu Qiaoli, Lin Xiao, Shi Qin

Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Institute of Orthopedics of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2025-11-04 Revised:2026-03-18 Online:2026-12-18 Published:2026-04-25
Contact: Shi Qin, MD, Professor, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Institute of Orthopedics of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Chen Yida, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Institute of Orthopedics of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82172485 (to SQ); National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 32371385 (to LX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生理渗透压：指软骨细胞外基质中溶质微粒(如蛋白聚糖、离子)与水分子相互作用形成的渗透张力，是维持软骨稳态的核心生物力学参数。
细胞外基质代谢：指软骨中胶原(Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型)、蛋白聚糖等大分子的合成与降解动态平衡过程。

背景：力学微环境紊乱与渗透压稳态崩溃共同驱动了骨关节炎产生和进展的恶性循环，持续的渗透压异常不仅破坏软骨细胞的稳态，还会显著抑制骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化能力，从而削弱软骨的再生潜能，加速关节软骨退行性变。
目的：建立病理渗透压诱导模型进行渗透压干预实验，揭示渗透压对骨髓间充质干细胞成软骨分化及对软骨细胞基质代谢的影响，以及关节腔渗透压失衡在骨关节炎发病机制中的作用。
方法：分离培养6-8周龄大鼠骨髓间充质干细胞，培养至第3代。复苏第3代大鼠软骨细胞并扩增培养。通过在培养基中加入NaCl溶液制备生理性或病理性的渗透压调节液，并通过CCK-8检测其生物相容性。在骨髓间充质干细胞成软骨分化诱导培养基中加入不同渗透压调节液干预7 d或14 d。通过番红O染色鉴定软骨标志物糖胺聚糖的分泌情况，使用qRT-PCR检测软骨合成相关基因的表达，检测白细胞介素1β炎症诱导后生理性或病理性渗透压调节液对软骨细胞合成及分解代谢的影响，进一步使用RNA-seq检测生理渗透压组和病理渗透压组的差异表达基因并进行富集分析。
结果与结论：①成功分离并培养了第3代骨髓间充质干细胞，同时成功复苏并扩增了第3代软骨细胞；②CCK-8检测结果显示，制备的病理性和生理性渗透压调节液均具有良好的生物相容性；③番红O染色结果提示，在第7天和第14天时，生理渗透压组的成软骨能力较病理渗透压组显著增强；④qRT-PCR结果进一步表明，与白细胞介素1β组和病理渗透压组比较，生理渗透压组可显著上调软骨合成相关基因聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原α1的表达，同时下调分解代谢相关基因基质金属蛋白酶13和基质金属蛋白酶3；⑤RNA-seq结果显示，在生理渗透压条件下，多个与骨关节炎发病相关的分子和信号通路被明显下调。
https://orcid.org/0009-0005-3097-3705 (陈奕达) ；https://orcid.org/0009-0002-2971-8780 (施勤)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨关节炎, 关节液渗透压, 骨髓间充质干细胞, 成软骨诱导, 软骨细胞, 生理渗透压, 病理渗透压

Abstract: BACKGROUND: The vicious cycle of osteoarthritis initiation and progression is driven by the combined effects of mechanical microenvironment disruption and collapse of osmotic pressure homeostasis. Sustained abnormal osmotic pressure disrupts chondrocyte homeostasis and markedly impairs the ability of bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into chondrocytes. Consequently, this compromises the regenerative capacity of cartilage and accelerates the degeneration of articular cartilage.
OBJECTIVE: To develop a pathological osmotic pressure model for use in osmotic intervention experiments, in order to investigate the effects of osmotic pressure on chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocyte matrix metabolism, and to explore the role of imbalanced osmotic pressure within the joint cavity in the pathogenesis of osteoarthritis.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from 6- to 8-week-old rats and cultured to the third passage. Third-passage rat chondrocytes were revived and performed expansion culture. Physiological or pathological osmotic pressure regulating solutions were prepared by adding NaCl to the culture medium, and their biocompatibility was assessed via cell counting kit-8 assays. Bone marrow mesenchymal stem cells were treated with different osmotic pressure regulating solutions in chondrogenic induction medium for 7 or 14 days. Safranin O staining was used to identify the secretion of glycosaminoglycan (a cartilage marker). qRT-PCR was performed to detect expression of genes related to cartilage synthesis. The effects of physiological or pathological osmotic pressure regulating solution on chondrocyte anabolism and catabolism were further evaluated after interleukin-1β inflammation induction. Furthermore, RNA-seq was employed to identify differentially expressed genes between the physiological and pathological osmotic pressure groups and an enrichment analysis was performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Third-passage bone marrow mesenchymal stem cells were successfully isolated and cultured, and third-passage chondrocytes were successfully revived and expanded. (2) Cell counting kit-8 assay demonstrated that these physiological and pathological osmotic pressure regulating solutions exhibited good biocompatibility. (3) Safranin O staining indicated that the chondrogenic capacity of the physiological osmotic pressure group was significantly enhanced compared to the pathological osmotic pressure group on both day 7 and day 14. (4) qRT-PCR further confirmed that compared with the interleukin 1β group and the pathological osmotic pressure group, the physiological osmotic pressure group could significantly upregulate the expression of cartilage synthesis-related genes aggrecan and collagen type II α1 chain, while downregulating the catabolism-related genes matrix metalloproteinase 13 and matrix metalloproteinase 3. (5) RNA sequencing results revealed that under physiological osmotic conditions, the expression of multiple molecules and signaling pathways associated with osteoarthritis pathogenesis was markedly suppressed.

Key words: osteoarthritis, osmotic pressure of joint fluid, bone marrow mesenchymal stem cells, chondrogenic induction, chondrocytes, physiological osmotic pressure, pathological osmotic pressure

中图分类号:

陈奕达, 程歆怡, 赵环, 周熙超, 顾巧丽, 林潇, 施勤. 生理渗透压对软骨分化和细胞外基质代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9143-9150.

Chen Yida, Cheng Xinyi, Zhao Huan, Zhou Xichao, Gu Qiaoli, Lin Xiao, Shi Qin. Effects of physiological osmotic pressure on chondrocyte differentiation and extracellular matrix metabolism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(35): 9143-9150.

图/表（结果） 10

2.1 渗透压调节液的渗透压测定结果通过冰点渗透压计测得的溶液渗透压值见表2，2号样品渗透压为301 mOsm/kg，与关节液骨关节炎病理渗透压相近，3号样品渗透压为449 mOsm/kg，与关节液生理渗透压相近。

2.2 骨髓间充质干细胞和软骨细胞的鉴定结果
2.2.1 骨髓间充质干细胞的鉴定结果流式细胞术结果显示，第3代骨髓间充质干细胞阳性指标CD29的阳性百分比分别为(98.9±0.02)%，CD90的阳性百分比分别为(98.74±0.06)%；阴性指标CD45的阳性百分比分别为(0.15±0.08)%，CD34的阳性百分比分别为(0.07±0.10)%，均< 5%。该鉴定结果说明提取培养的骨髓间充质干细胞纯度达到90%以上，见图1。

2.2.2 软骨细胞鉴定结果通过甲苯胺蓝染色对大鼠第3代软骨细胞进行鉴定，其形态规则，主要为圆形和椭圆形，细胞核清晰，胞浆丰富，边缘明显，符合正常软骨细胞的典型形态，见图2。

2.3 渗透压调节液的生物相容性检测 CCK-8检测显示，大鼠骨髓间充质干细胞和软骨细胞接种培养1，3，5 d后均能够正常增殖，PBS组、病理渗透压组和生理渗透压组的增殖活性均未产生显著变化。这些结果证明渗透压调节液具有良好的生物相容性，见图3。

2.4 渗透压调节液对骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响
2.4.1 番红O染色检测将渗透压调节液与骨髓间充质干细胞在成软骨诱导培养基中共培养，观察其促进骨髓间充质干细胞增殖和软骨分化的能力。7 d时，应用番红O染色检测细胞的形态学变化和软骨基质的分泌。与病理渗透压组相比，生理渗透压组具有显著的促进骨髓间充质干细胞软骨分化的能力。骨髓间充质干细胞逐渐失去其特有的纤维结构，并开始形成单层簇状。成软骨诱导分化干预14 d，可见骨髓间充质干细胞成软骨现象越加明显，与PBS组及病理渗透压组相比，生理渗透压组的番红O染色强度显著增强，表明细胞在分泌糖胺聚糖，在向软骨细胞分化，见图4。

2.4.2 qRT-PCR检测采用qRT-PCR检测骨髓间充质干细胞与渗透压调节液在成软骨分化诱导培养基中共培养7 d和14 d后的软骨合成代谢相关基因的表达情况(聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原α1)。其中，生理渗透压组展现最强的促软骨分化效果。与PBS组相比，7 d 生理渗透压组的聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原α1表达量分别是PBS组的1.77倍、3.02倍，在14 d其表达量分别是PBS组的2.48倍和4.34倍，见图5。

2.5 渗透压调节液对软骨细胞代谢的影响白细胞介素1β是骨关节炎的关键炎症细胞因子，被用于模拟炎症环境。采用qRT-PCR检测细胞外基质分解代谢相关基因表达水平，评估软骨细胞的分解代谢情况。结果显示，与白细胞介素1β组和病理渗透压组比较，生理渗透压组能够显著提高聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原α1的表达，降低基质金属蛋白酶13和基质金属蛋白酶3的表达，从而促进软骨细胞合成代谢，抑制软骨细胞分解代谢，见图6，7。
2.6 渗透压调节液对白细胞介素1β干预的软骨细胞转录组测序的差异表达基因分析
2.6.1 差异表达基因分析为了进一步探索恢复生理渗透压对软骨细胞影响的作用机制，将软骨细胞与10 ng/mL的白细胞介素1β和生理渗透压调节液(生理渗透压组)孵育，病理渗透压组加入相同体积的白细胞介素1β和PBS，孵育48 h，采用RNA-seq
分析2组样本之间上调和下调的差异表达基因。火山图显示，与病理渗透压组相比生理渗透压组中表达上调的基因有309个，下调的基因有210个，见图8。
2.6.2 富集分析
(1) GO富集分析：结果显示，2组细胞的差异表达基因分布于多个细胞外基质相关行为，见图9A。

(2) KEGG富集分析：结果显示，在缺氧诱导因子1信号通路，钙信号通路，Hippo信号通路，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路等多个与骨关节炎明确有关的信号通路中存在着差异表达基因的富集，见图9B。
(3)基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)：研究表明，钙信号通路、Hippo信号通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路及缺氧诱导因子1信号通路的激活均能不同程度促进骨关节炎的进展[38-41]。基因集富集分析显示，与病理渗透压组相比，生理渗透压组中以上4条信号通路均受到抑制，见图10。

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引言

骨关节炎作为全球致残率最高的退行性骨关节病，已成为威胁中老年群体健康的核心公共卫生挑战[1-2]，其病理特征主要表现为关节软骨进行性退变、软骨下骨硬化及滑膜炎症反应，最终引发关节功能丧失[3]。尽管传统观点将骨关节炎归因于机械磨损或自然老化[4-5]，但近年研究揭示其发病机制涉及力学、化学及生物学因素的复杂交互网络，其中渗透压稳态的破坏在这一过程中扮演着关键角色。
骨关节炎的病理进程本质上是力学微环境紊乱与渗透压稳态崩溃共同驱动的恶性循环[6]。正常关节液的渗透压维持在(404±57) mOsm/kg范围内[7]，这一特性由细胞外基质中蛋白聚糖的固定电荷密度决定[8]。生理状态下，固定电荷密度通过Donnan效应吸引Na+等离子形成渗透压梯度，使软骨含水量达70%-80%，赋予其优异的抗压与能量耗散能力[9]。然而，当异常力学负荷作用于软骨时，细胞外基质中的透明质酸分子因剪切力发生解聚，导致滑液黏度下降和渗透压降低，这种低渗环境通过离子通道(如PIEZO1、TRPV4等)激活软骨细胞体积调节反应，迫使细胞摄入过量水分以维持渗透平衡，进而引发胞内钙超载和铁死亡[10-11]。
力学特性异常与渗透压变化的病理耦合效应在骨关节炎进展中尤为显著。关节正常功能依赖于均匀的生物力学负荷分布，但长期姿势不当或创伤可导致局部压力异常[12-13]，改变渗透压环境并削弱滑液润滑特性，直接加剧软骨损伤[14]。体外实验证实，超负荷静态压力通过整合素β1-FAK通路异常激活，促使软骨细胞分泌基质金属蛋白酶13并抑制SOX9转录活性，形成“力学过载→渗透压下降→细胞外基质降解→力学缓冲能力丧失”的正反馈环路[15-16]。此外，低渗环境会削弱滑液的边界润滑效应，并刺激滑膜细胞分泌白细胞介素6和前列腺素E2[17]，这些炎性递质通过激活TRPV1增强疼痛信号传导，形成力学-化学-痛觉交互影响的复杂病理网络[18]。
渗透压对软骨细胞代谢的调控具有多维度特征[9，18]。当渗透压从生理值约450 mOsm/kg降至约300 mOsm/kg时，TonEBP/NFAT5通路启动渗透保护反应，上调渗透压调节基因表达[19]。然而，持续低渗环境会导致线粒体膜电位下降和活性氧积累，最终引发软骨细胞合成功能衰竭[20-21]。在此背景下，骨髓间充质干细胞因其多向分化潜能成为软骨修复的关键候选细胞[22-24]。间充质干细胞广泛分布于膝关节滑膜、关节腔及软骨浅层，临床前研究表明间充质干细胞可通过分化为功能性软骨细胞促进组织再生[25-26]。例如，异源间充质干细胞联合自体软骨源细胞移植可显著改善关节软骨形态[27]，而同种异体间充质干细胞关节腔注射能提升半月板体积并缓解疼痛[28]。
骨髓间充质干细胞的软骨分化效率高度依赖于机械刺激与力学环境信号的协同作用[29-30]。研究表明，动态力学刺激通过激活FAK-MAPK与磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号轴驱动SOX9与Ⅱ型胶原α1(collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1)表达[13]，而FAK磷酸化与TonEBP核转位的交叉对话能够使得软骨再生的效率显著提高：FAK通过募集mTORC2复合体增强TonEBP转录活性，而TonEBP反过来上调整合素β1表达，形成力学感知的正反馈循环[31]。这种双信号协同作用为优化通过骨髓间充质干细胞成软骨分化实现软骨再生的策略提供了基础。现有研究表明，TonEBP是明确与渗透压力相关的蛋白[32]。尽管已有研究指出渗透压变化在软骨细胞代谢紊乱、细胞应激及死亡过程中具有重要作用，但相关研究多集中于细胞水平的应答机制，缺乏从整体关节微环境层面出发的系统性干预思路[33-35]。尤其是在骨关节炎复杂病程中，渗透压稳态失衡往往被视为结果性变化，其在疾病进展中的驱动角色尚未被充分重视。因此，渗透压不仅是病理反应的标志，更可能是介入骨关节炎进程的重要调控靶点，恢复关节腔生理渗透压对骨关节炎治疗具有重要意义。此次研究通过制备渗透压调节液，探索其在大鼠间充质干细胞成软骨分化和软骨基质代谢中的作用机制，旨在为渗透压导向的骨关节炎非药物干预策略提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2023年11月至2024年11月在苏州大学骨科研究所内完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级6-8周龄雌性SD大鼠6只，体质量(259.0±4.2) g，出生72 h雌性SD大鼠，均购自苏州昭衍动物公司，许可证号：20230009018393，20230009009316。饲养条件与课题组之前的研究一致[36]，所有SD大鼠均饲养在苏州大学实验动物中心无病原体的环境中，保证大鼠能够自由获取所需饮食，22-24 ℃恒温，50%-60%湿度，12 h光照/12 h黑暗交替循环。所有动物实验遵循苏州大学实验管理条例规定并得到苏州大学动物实验伦理委员会的批准(SUDA20231023A04)，严格遵守实验室动物护理和使用的指导方针。
1.3.2 实验试剂和仪器胰酶、胎牛血清、PBS(Hyclone，美国)；DMEM/F12培养基(ThermoFisher Scientific，美国)；反转录试剂、qRT-PCR试剂盒(Takara，日本)；抗坏血酸、地塞米松、转化生长因子β(Sigma，美国)；戊巴比妥钠(麦克林，中国)；40 g/L多聚甲醛(Biosharp，中国)；光学显微镜(Leica，德国)；倒置荧光显微镜(ZeissAxiovert，德国)；全波长酶标仪(BioTek，美国)；培养皿、培养孔板(Corning，美国)；CO2细胞培养箱、生物超净台(ThermoFisher Scientific，美国)；高速离心机(Eppendorf，德国)；Nanodrop 2000光谱仪(ThermoFisher Scientific，美国)；4 ℃冰箱(无锡松下冷机有限公司，中国)；-80 ℃电冰箱(青岛海尔股份有限公司，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 渗透压调节液的配制及测定称取5.844 g NaCl(Macklin，上海)溶解于100 mL蒸馏水中，配置浓度为1 mol/L的NaCl溶液，充分搅拌溶解后使用0.22 μm滤网过滤。向DMEM/F-12培养基中添加NaCl溶液，每10 mL体系加入0.15 mL NaCl溶液，即制成病理渗透压组渗透压调节液；生理渗透压组的渗透压调节液在10 mL体系中加入0.9 mL NaCl溶液，其他步骤同上。取2组调节液及DMEM/F-12培养基于冰点渗透压计下测定渗透压。测定前使用去离子水作为质控标准品，其渗透压测定值为 -1 mOsm/kg，用于校准仪器。
1.4.2 细胞的提取和培养
(1)骨髓间充质干细胞提取和培养：实验方法参考课题组已发表文献[36]，具体步骤如下：采用过量3%戊巴比妥钠腹腔注射处死6-8周龄雌性SD大鼠，用5 mL注射器冲出股骨和胫骨内骨髓，将冲出的骨髓吹散，培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM/F-12培养基中，每3 d换1次培养基，待细胞融合度达到95%时进行细胞传代，传代时细胞用0.25%不含EDTA的胰酶在37 ℃消化30 s，用DMEM/F-12完全培养基终止消化，300×g离心10 min，随后将细胞均匀分至3个10 cm2培养皿中即为第1代骨髓间充质干细胞，按此方法继续传代至第3代进行后续实验。
(2)软骨细胞提取和培养：出生72 h雌性SD大鼠麻醉后分离关节软骨，并经课题组建立的标准化流程分离纯化[37]，细胞经含体积分数10%胎牛血清、10%二甲基亚砜的冻存液处理后，保存于液氮气相。复苏时采用37 ℃水浴快速解冻，离心去除冻存液后重悬于完全培养基，培养至第3代进行后续实验。
1.4.3 流式细胞术鉴定按照前述方法提取出的6-8周龄雌性SD大鼠骨髓间充质干细胞传至第3代，进行鉴定。取9×106个骨髓间充质干细胞，300×g离心10 min，弃去上清后加入PBS均匀吹打细胞，洗去细胞表面残留培养基，再次离心，离心结束后去除上清制成单细胞悬液。每个EP管加入1×106个细胞，将配制好的CD45、CD34、CD29、CD90抗体加至上述含细胞的1.5 mL EP管中，置于4 ℃条件下避光孵育30 min，孵育结束后，每管加入500 μL含胎牛血清的PBS，均匀吹打，300×g离心10 min，去除上清，再向每管样品中加入400 μL PBS重悬，重悬结束所有样品上机检测。
1.4.4 甲苯胺蓝染色鉴定取第3代软骨细胞，经40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS漂洗3次后，加入0.1%甲苯胺蓝染液，室温染色30 min。PBS漂洗后置于显微镜下成像。
1.4.5 生物相容性的鉴定采用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8，CCK-8)检测不同渗透压调节液对细胞活力的影响。将细胞以1×108 L-1浓度接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液。37 ℃、体积分数5% CO2条件下预培养24 h至完全贴壁后，弃去原培养基并用PBS清洗，分别加入渗透压调节液及10 μL CCK-8试剂，继续培养1，3或5 d后避光转移上清至新的96孔板，于酶标仪测定450 nm处吸光度值，定量分析细胞活性。
1.4.6 成软骨诱导及番红O染色将骨髓间充质干细胞与渗透压调节液在成软骨诱导培养基(Procell，中国)中孵育7 d或14 d，依据不同的干预分为PBS组、病理渗透压组和生理渗透压组。用40 g/L多聚甲醛固定细胞，并用0.1%的番红O染色，再用PBS洗涤。最后，在显微镜下观察并拍照。
1.4.7 qRT-PCR检测
(1)按1.4.6同样方法进行成软骨诱导和干预7 d或14 d，用qRT-PCR检测骨髓间充质干细胞与不同渗透压调节液共培养后的软骨合成代谢相关基因[聚蛋白聚糖(aggrecan，Acan)、Ⅱ型胶原α1]表达情况。

(2)以1×109 L-1的细胞浓度接种软骨细胞于6孔板中，每孔加入2 mL细胞悬液。待细胞贴壁后，分别进行以下4种处理：PBS组加入与其他处理组等体积的PBS溶液，作为阴性对照组；白细胞介素1β组在每10 mL培养液中加入100 ng白细胞介素1β，PBS补足体积以与其他组保持一致，模拟炎症环境；病理渗透压组在白细胞介素1β刺激基础上，额外加入0.15 mL 5 mol/L NaCl溶液，用以调节培养液渗透压至病理水平(约300 mOsm/kg)；生理渗透压组在白细胞介素1β刺激基础上，加入0.9 mL 5 mol/L NaCl溶液，将培养液渗透压调节至生理水平(约450 mOsm/kg)。经过48 h孵育时间，并检测软骨细胞合成和分解代谢相关基因(Acan、Ⅱ型胶原α1、基质金属蛋白酶13和基质金属蛋白酶3)。引物序列表1。

1.4.8 RNA-seq检测在24孔板中培养软骨细胞，细胞密度为2.5×104个/cm2，生理渗透压组加入10 ng/mL的白细胞介素1β和生理渗透压调节液，病理渗透压组加入相同体积的白细胞介素1β和PBS，孵育48 h。去除培养基，PBS清洗1次。加入1 mL Trizol裂解细胞，并外送测序公司(上海欧易生物)进行RNA-seq分析。分析两组样本之间上调和下调的差异表达基因，使用欧易云平台(https://cloud.oebiotech.com)进行绘图及分析，再对差异表达基因进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析。
1.5 主要观察指标 ①渗透压调节液的渗透压测定结果及生物相容性；②骨髓间充质干细胞和软骨细胞鉴定结果；③渗透压调节液对骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响；④渗透压调节液对软骨细胞代谢的影响；⑤渗透压调节液对白细胞介素1β干预的软骨细胞转录组测序的差异表达基因分析结果。
1.6 统计学分析所有数据在进行统计分析前，均使用Shapiro-Wilk检验对正态分布进行检验，使用Levene检验评估方差齐性。满足正态分布且方差齐性的数据采用参数检验，不满足的则采用非参数检验。采用 SPSS 13.0 软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001分别表示差异的显著水平。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

此次研究通过恢复关节液生理渗透压，揭示了其对骨髓间充质干细胞成软骨分化的显著促进作用。实验数据显示，生理渗透压条件下14 d骨髓间充质干细胞形成的类软骨簇状结构中，蛋白聚糖表达量较病理渗透压组提升67.20%，这一现象与力学-渗透压协同调控机制密切相关，推测其促进软骨再生的机制为渗透压恢复通过激活整合素β1-FAK-ERK机械转导通路，增强骨髓间充质干细胞对力学刺激的响应效率，并促进YAP/TAZ核转位，模拟天然软骨的力学信号传导过程[42-43]。其中，TonEBP/NFAT5通路可能在此过程中发挥核心调控作用，其激活不仅增强细胞对高渗环境的适应性，还通过与FAK磷酸化的交叉对话优化力学信号转导效率[31，44]。
在骨关节炎病理背景下，力学过载与渗透压下降形成的恶性循环是软骨退变的关键驱动因素。异常机械负荷导致透明质酸解聚和滑液黏度降低，低渗环境进一步削弱软骨的力学缓冲能力[45-47]。这一发现为传统治疗困境提供了新的突破口：现有阶梯化治疗策略(如非类固醇类抗炎药物、透明质酸补充剂或糖皮质激素注射)仅针对缓解下游炎症，而手术修复产生的纤维软骨因Ⅰ型胶原占比过高导致压缩承载能力显著低于透明软骨[48-50]。与之相比，恢复关节腔渗透压通过干预上游机制，将骨髓间充质干细胞成软骨分化标志物聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原α1的表达提升了2.48倍和4.34倍。
在白细胞介素1β诱导的炎症微环境中，渗透压调节液通过恢复生理渗透压改善了生化环境，实现细胞外基质代谢的动态平衡。qRT-PCR结果及RNA-seq结果显示，生理渗透压组显著上调软骨细胞的合成代谢，抑制其分解代谢。这种“合成-分解”双调控效应可能源于渗透压对关键信号节点的多重干预：渗透压干预通过整合素β1-FAK-ERK通路抑制基质金属蛋白酶13等分解代谢酶的活性[42，51-52]；同时抑制核因子κB核转位，阻断基质金属蛋白酶转录激活[53]。此外，恢复关节腔生理渗透压还可降低NLRP3炎症小体组装效率，减少白细胞介素1β释放[54-55]，形成力学-化学协同的抗炎微环境。
此次研究的临床应用潜力体现在多模态干预体系的构建：作为全新的非药物干预手段，可以通过生物材料的应用进一步维持局部渗透压稳态，并通过生物材料的特性模拟天然软骨力学梯度，结合智能化给药系统，以调节关节腔渗透压为基础的生物材料体系可实现在关节活动期动态释放渗透压调节分子，突破静态培养环境局限，不仅促进骨髓间充质干细胞成软骨分化，还能够促进细胞外基质的合成代谢，抑制其分解代谢[56-57]。综上，恢复关节腔生理渗透压通过多维度调控力学-生化微环境平衡，为骨关节炎治疗提供了非药物疗法的创新策略。目前，基于渗透压调节的多模态干预体系在骨关节炎治疗中的相关研究尚处于起步阶段，相关文献报道较为有限。通过文献检索，未发现已有研究系统性地结合渗透压调节与多模态干预策略进行骨关节炎治疗的案例。因此，此次研究提出通过恢复关节腔渗透压稳态作为干预手段，结合生物材料模拟软骨力学梯度，建立全新的非药物治疗策略。这不仅填补了该领域的研究空白，也为未来构建更加高效的多模态干预体系提供了理论基础和实验依据。期待后续研究能在此基础上进一步拓展，实现临床应用的转化。
该研究仍存在很多不足之处：①尚未完善通过恢复生理关节液渗透压促进骨髓间充质干细胞成软骨分化的分子机制研究；②恢复生理关节液渗透压在体外发挥了稳定的促骨髓间充质干细胞成软骨分化的效果，该治疗效果需要进一步在体内验证，但体内环境存在理化环境复杂、关节液渗透压难以维持的困难，需要设计相关生物材料为其提供缓释载体，将会在后续实验中进一步补充说明。
结论：此次研究系统探讨了渗透压在骨关节炎病理过程中的关键作用，揭示了低渗透压环境对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响。通过恢复生理渗透压，显著促进了软骨相关基因(如聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原α1)的表达，显示出改善关节微环境的潜力。研究结果为骨关节炎的非药物治疗策略提供了新的思路，特别是在多模态干预体系构建和生物材料应用方面具有重要的临床转化价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

生理渗透压对软骨分化和细胞外基质代谢的影响

Effects of physiological osmotic pressure on chondrocyte differentiation and extracellular matrix metabolism

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