弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡的影响

doi:10.12307/2026.524

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1632-1640.doi: 10.12307/2026.524

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弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡的影响

袁小霜1，杨姁2，杨波2，陈晓旭2，田婷1，王飞清2，李艳菊1，3，刘洋2，杨文秀1，3

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；2贵州中医药大学第一附属医院，贵州省贵阳市 550001；3贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2024-11-15 修回日期:2025-03-05 接受日期:2025-03-19 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-18
通讯作者: 刘洋，博士，教授，贵州中医药大学第一附属医院，贵州省贵阳市 550001；杨文秀，博士，主任医师，贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:袁小霜，女，1999年生，贵州省铜仁市人，土家族，贵州医科大学在读硕士，主要从事间充质干细胞相关性研究。
基金资助:
贵州医科大学附属医院“学科优秀后备人才”基金项目(gyfyxkrc-2023-14)，项目负责人：李艳菊；贵州省科学技术厅项目(黔科合平台人才[2021]博士后站-007)，项目负责人：刘洋

Effect of conditioned medium of diffuse large B-cell lymphoma cells on proliferation and apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells

Yuan Xiaoshuang1, Yang Xu2, Yang Bo2, Chen Xiaoxu2, Tian Ting1, Wang Feiqing2, Li Yanju1, 3, Liu Yang2, Yang Wenxiu1, 3

1Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China

Received:2024-11-15 Revised:2025-03-05 Accepted:2025-03-19 Online:2026-03-08 Published:2025-08-18
Contact: Liu Yang, PhD, Professor, First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001, Guizhou Province, China; Yang Wenxiu, PhD, Chief physician, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Yuan Xiaoshuang, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
“Discipline Outstanding Reserve Talents” Fund Project of Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, No. gyfyxkrc-2023-14 (to LYJ); Project of Science and Technology Department of Guizhou Province, No. [2021] 007 (to LY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液：人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞在生长过程中向培养液中释放多种活性物质，包括生长因子和细胞因子。收集弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞培养基上清液，使用截留分子质量为100 kD的超滤离心管，3 000 r/min离心30 min，经过滤除菌后即得到弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液。
人骨髓间充质干细胞：是一种具有异质性的细胞群，能够自我更新并分化为成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞等多种细胞类型。骨髓间充质干细胞可以根据其所暴露的肿瘤微环境来获得促肿瘤和抗肿瘤表型，从而促进或抑制肿瘤生长。

摘要
背景：骨髓微环境与弥漫性大B细胞淋巴瘤生长、存活和耐药性之间的关系是近些年的研究热点，而弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液对骨髓间充质干细胞的影响未见报道。
目的：探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液对骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响。
方法：采用Ficoll密度梯度离心法从健康供者骨髓血中分离骨髓间充质干细胞，并通过贴壁法进行纯化；使用SU-DHL-2和OCI-LY3两种弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞培养上清液制备条件培养液。按培养基的不同进行细胞分组：对照组骨髓间充质干细胞仅用L-DMEM完全培养液培养，CM-SU-DHL-2组、CM-OCI-LY3组骨髓间充质干细胞用20% SU-DHL-2细胞条件培养液或20% OCI-LY3细胞条件培养液和80% L-DMEM完全培养液培养。通过CCK-8、EDU、结晶紫染色观察骨髓间充质干细胞的增殖情况，划痕实验评估骨髓间充质干细胞的迁移情况，流式细胞术检测骨髓间充质干细胞的细胞周期、凋亡情况，Real-time PCR和Western blot检测骨髓间充质干细胞中P21、P16、Bcl-2、BTK mRNA和蛋白表达水平。

结果与结论：①与对照组相比，SU-DHL-2和OCI-LY3细胞条件培养液显著促进骨髓间充质干细胞的增殖(P < 0.05)，可能与P21和P16蛋白低表达密切相关(P < 0.05)；②与对照组相比，SU-DHL-2和OCI-LY3细胞条件培养液显著促进骨髓间充质干细胞的迁移(P < 0.05)；③与对照组相比，SU-DHL-2和OCI-LY3细胞条件培养液抑制骨髓间充质干细胞的凋亡(P < 0.05)，可能与Bcl-2、BTK mRNA和蛋白高表达密切相关(P < 0.05)。研究结果表明，弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液可促进骨髓间充质干细胞的增殖并抑制凋亡。

https://orcid.org/0009-0001-2967-6309(袁小霜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 弥漫性大B细胞淋巴瘤, 骨髓间充质干细胞, 条件培养液, 增殖, 凋亡, 工程化干细胞

Abstract: BACKGROUND: The relationship between bone marrow microenvironment with growth, survival, and drug resistance of diffuse large B-cell lymphoma has become a hot topic of research, but the effect of diffuse large B-cell lymphoma cell conditioned medium on bone marrow mesenchymal stem cells has not been reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of cell conditioned medium of diffuse large B-cell lymphoma on proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were extracted from bone marrow blood of healthy donors by Ficoll density gradient centrifugation method and purified by adhesion method. Meanwhile, two kinds of diffuse large B-cell lymphoma cell supernatant (SU-DHL-2 and OCI-LY3) were used to prepare conditional culture medium. The cells were grouped according to different media: human bone marrow mesenchymal stem cells in the control group were cultured with L-DMEM only. The human bone marrow mesenchymal stem cells in the CM-SU-DHL-2 and CM-OCI-LY3 groups were cultured with 20% SU-DHL-2 cell conditioned culture medium or 20% OCI-LY3 cell conditioned culture medium and 80% L-DMEM complete culture medium. The proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells was observed by CCK-8, EDU and crystal violet staining. The migration of bone marrow mesenchymal stem cells was evaluated by scratch method. The cell cycle and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells were detected by flow cytometry. The expression levels of P21, P16, Bcl-2, and BTK mRNA and protein were detected by real-time PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the conditioned medium of SU-DHL-2 and OCI-LY3 cells could significantly promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05), which might be closely related to the low expression of P21 and P16 proteins (P < 0.05). (2) Compared with the control group, the conditioned medium of SU-DHL-2 and OCI-LY3 cells significantly promoted the migration of bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the conditioned medium of SU-DHL-2 and OCI-LY3 cells inhibited the apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05), which might be closely related to the high expression of Bcl-2 and BTK mRNA and protein (P < 0.05). The results showed that the conditioned medium of diffuse large B-cell lymphoma cells could promote the proliferation and inhibit apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: diffuse large B-cell lymphoma, bone marrow mesenchymal stem cell, conditioned medium, proliferation, apoptosis, engineered stem cell

中图分类号:

袁小霜, 杨姁, 杨波, 陈晓旭, 田婷, 王飞清, 李艳菊, 刘洋, 杨文秀. 弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1632-1640.

Yuan Xiaoshuang, Yang Xu, Yang Bo, Chen Xiaoxu, Tian Ting, Wang Feiqing, Li Yanju, Liu Yang, Yang Wenxiu. Effect of conditioned medium of diffuse large B-cell lymphoma cells on proliferation and apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1632-1640.

图/表（结果） 2

2.1 BMSCs的鉴定结果 如图1A所示，BMSCs呈贴壁生长；成骨诱导后，茜素红染色显示BMSCs中有致密的染色钙盐沉积；成脂诱导后，油红O染色显示BMSCs中形成油滴。如图1B所示，CD11b、CD34、CD14、CD45和HLA-DR在BMSCs中不表达，而CD90、CD105和CD73在BMSCs中高表达。
2.2 CCK-8检测BMSCs的增殖情况 在干预12，24，48 h后，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组BMSCs的吸光度值均显著高于HD-BMSCs组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。
2.3 结晶紫染色法观察BMSCs的形态和数量 干预24 h后，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组的染色细胞数量显著高于HD-BMSCs组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 划痕实验观察BMSCs的迁移情况 干预24 h 后，划痕实验结果显示，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组细胞相对迁移率显著高于HD-BMSCs组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。
2.5 EdU荧光染色观察BMSCs的增殖情况 在干预24 h后，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组的EdU 阳性细胞率显著多于HD-BMSCs组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。
2.6 细胞周期 流式细胞术分析显示，与HD-BMSCs组相比，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组G0/G1期细胞数量显著减少(P < 0.05)，而S期细胞数量则显著增加(P < 0.05)，见图6。
2.7 细胞凋亡率 HD-BMSCs组、CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组的BMSCs总凋亡率分别为(25.17±0.3)%，(8.20±0.55)%，(8.59±0.29)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。
2.8 Western blot检测Bcl-2、BTK、P21、P16蛋白的表达 与HD-BMSCs组相比，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组BMSCs中Bcl-2、BTK蛋白表达升高，P21、P16蛋白表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图8。
2.9 RT-PCR检测Bcl-2、BTK mRNA的表达 与HD-BMSCs组相比，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组BMSCs中Bcl-2、BTK mRNA表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9。

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引言

弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是全球最常见的非霍奇金淋巴瘤，以侵袭性而闻名，占每年新发非霍奇金淋巴瘤病例的40%[1-2]。在中国，DLBCL的发生率呈逐年上升趋势，主要影响中老年人群，且发病率随年龄增加而增高[3-4]。尽管近年来DLBCL的治疗方案有了显著进展，包括基于R-CHOP的一线治疗(利妥昔单抗联合环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)，部分患者可以获得长期缓解。然而，仍有约40%的患者无法通过现有治疗方案实现完全治愈，复发和耐药成为患者面临的主要挑战[5-6]。DLBCL的转移不仅与染色体改变、细胞周期和凋亡通路分子改变有关，还取决于特定的骨髓微环境。越来越多的研究证实，骨髓微环境中的黏附分子、趋化因子和细胞因子在淋巴瘤生长、转移、化疗耐药和生存中起关键作用[7-13]。间充质干细胞是一组异质性成纤维细胞样祖细胞，主要来源于骨髓[14]。研究证实骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)与恶性肿瘤B细胞之间的动态相互作用在骨髓微环境转变为肿瘤支持性生态位的过程中扮演了关键角色[15-16]。研究发现，BMSCs不仅能够调节免疫反应，还可在一定条件下分泌促炎或抗炎因子，塑造肿瘤微环境[17]，促进肿瘤细胞的生长和迁移[15]。同时，肿瘤细胞在生长过程中也可能通过分泌特定的细胞因子或释放外泌体，诱导BMSCs的功能变化，进而影响肿瘤的增殖及侵袭能力[18-19]。
目前骨髓微环境中的BMSCs与恶性肿瘤细胞之间的相互作用已成为学术界研究的焦点。然而，现有研究主要侧重于BMSCs对肿瘤发生和发展的影响，对于肿瘤如何影响BMSCs增殖和分化机制的研究则相对较少。该实验探讨DLBCL细胞条件培养液对BMSCs增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响，从而解析DLBCL与BMSCs的作用关系。这一研究不仅为DLBCL的治疗提供了新的靶点，也为骨髓微环境在恶性肿瘤中的作用提供了更为系统的认识，有助于开发针对肿瘤微环境的靶向治疗策略，从而提高DLBCL的治疗效果。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年9月至2024年9月在贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 骨髓样本 骨髓样本由贵州医科大学附属医院血液科提供，样本采集自7名健康体检者，其中男性3名，女性4名，年龄20-30岁，未患有感染性疾病或自身免疫性疾病，并且都已签署知情同意书。研究方案经贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准，伦理审查编号：2023伦理审查第(507)号。
1.3.2 实验细胞 实验中使用的细胞株包括SU-DHL-2和OCI-LY3，均由贵州医科大学附属医院病理科实验室提供。
1.3.3 实验试剂和仪器
实验试剂：人外周血淋巴细胞分离液(索莱宝，中国，货号：P8610)；胰蛋白酶(索莱宝，中国，货号：T1300)；PBS(Biosharp，中国，货号：BL2214A)；RPMI 1640培养基、L-DMEM培养基、H-DMEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；细胞周期检测试剂盒(索莱宝，中国，货号：CA1510)；凋亡试剂盒(索莱宝，中国，货号：CA1020)；EdU试剂(索莱宝，中国，货号：CA1170)；CCK-8试剂盒(索莱宝，中国，货号：CA1210)；BCA检测试剂盒(索莱宝，中国，货号：PC0020)；结晶紫(索莱宝，中国，货号：C8410)；TriQuick Reagent总RNA提取试剂(碧云天，中国，货号：R0017S)；油红O染色试剂盒(碧云天，中国，货号：C0157S)；茜素红S染色液(碧云天，中国，货号：C0138)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天，中国，货号：P0012A)；Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)、Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox)(翌圣生物，中国)；引物(生工，中国)；鼠抗人CD105-PE、CD73-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD34-FITC、CD90-FITC、HLA-DR-FITC单克隆抗体、同型对照抗体IgG-FITC和IgG-PE作为阴性对照(BD 公司)；羊抗兔IgG二抗、羊抗鼠IgG二抗、GAPDH抗体(博士德生物公司，货号：BM3874)；P21抗体(博士德生物公司，货号：BM3990)；P16抗体(碧云天，中国，货号：AF1069)；Bcl-2抗体(碧云天，中国，货号：AB116)；BTK抗体(博士德生物公司，货号：BM4570)；实验仪器：0.22 μm过滤器(Millipore，美国)；倒置荧光显微镜(尼康，日本)；实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad，美国)；酶标仪(Bio-Tek公司，美国)；流式细胞仪(BD，美国)。
1.4 方法
1.4.1 BMSCs培养通过Ficoll密度梯度离心法提取BMSCs，并用贴壁法进行纯化，选取第3-5代细胞用于实验。
1.4. 流式细胞仪检测BMSCs表面标志物 选择第3代BMSCs，用0.25%胰蛋白酶消化后，1 000 r/min离心5 min，去除上清液，调节细胞数至2×105个，然后将细胞悬液转移至Eppendorf管中，分别加入以下抗体：CD105-PE、CD90-PE、CD45-PE、CD34-FITC、CD14-FITC、CD73-PE、CD11b-PE、HLA-DR-FITC，孵育30 min，弃去上清液，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原，以IgG同源抗体作为阴性对照[20]。
1.4.3 成骨诱导分化 将第3代BMSCs以1×1010 L-1的细胞浓度接种至12孔培养板中，每孔2 μL，培养24 h后将培养基更换为成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、0.01%地塞米松、50 mmol/L维生素C以及1%β-甘油磷酸钠的H-DMEM培养基)，每3 d更换1次培养基，诱导21 d后进行茜素红染色，显微镜观察钙化结节的形成情况。

1.4.4 成脂诱导分化 将第3代BMSCs以1×1010 L-1的细胞浓度接种到12孔培养板中，每孔2 μL，培养24 h后将培养基更换为成脂诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、1 μg/mL胰岛素、0.001 mol/L地塞米松、0.001 mol/L罗格列酮和0.5 mmol/L甲基黄的H-DMEM培养基)，每3 d更换1次培养基，诱导15 d进行油红O染色，显微镜下观察脂滴形成情况。

1.4.5 SU-DHL-2和OCI-LY3细胞条件培养液的制备 SU-DHL-2和OCI-LY3细胞在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，细胞融合达到80%时收集上清液，用截留分子质量为100 kD的超滤离心管以3 000 r/min离心30 min，使用0.22 μm滤膜过滤，去除细胞杂质，将上清液在-80 ℃储存备用。将SU-DHL-2或OCI-LY3细胞上清液与含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基按1∶4体积比稀释作为SU-DHL-2细胞条件培养液(CM-SU-DHL-2)和OCI-LY3细胞条件培养液(CM-OCI-LY3)。
1.4.6 细胞分组 使用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基培养的健康供者来源骨髓间充质干细胞(healthy donor bone mesenchymal stem cells，HD-BMSCs)作为对照组，使用SU-DHL-2细胞条件培养液(CM-SU-DHL-2)和OCI-LY3细胞条件培养液(CM-OCI-LY3)培养的BMSCs为实验组。
1.4.7 CCK-8检测细胞增殖情况 将第3代BMSCs以5×102/孔密度接种于96孔板中，每组设置4个重复孔，根据实验设计使用不同的培养基培养12，24，48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在孵箱中继续培养3 h，使用酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光度值。
1.4.8 结晶紫染色观察细胞形态 将第3代BMSCs以2×104/孔密度接种于24孔板中，根据实验分组更换不同的培养基培养24 h，用结晶紫染色30 min，显微镜下观察。
1.4.9 EdU/Hoechst33258荧光双染法检测细胞增殖情况 将第3代BMSCs以2×104/孔密度接种于6 孔板中，用含体积分数1%胎牛血清的L-DMEM培养基培养12 h以同步化细胞周期。待细胞贴壁后，去除旧的培养基，根据实验分组更换不同的培养基培养24 h，加入1 000∶1比例稀释的EdU标记液孵育24 h，倒置荧光显微镜下观察。实验重复3次。计数100倍视野下的细胞，EdU细胞阳性率 =(红色荧光细胞数/蓝色荧光细胞数)×100%。
1.4.10 划痕实验 第3代BMSCs以1×105/孔密度接种于6孔板中，当细胞融合度达到95%时，使用10 μL移液器枪头垂直于培养板，在细胞表面划出一条直线，然后用PBS冲洗细胞3次，弃去被刮出的细胞，根据实验分组更换不同的培养基培养24 h后观察划痕愈合情况，实验重复3次，使用Image J软件分析细胞相对迁移率。细胞相对迁移率=(初始划痕宽度-24 h后划痕宽度)/初始划痕宽度×100%。
1.4.11 细胞周期检测 将第3代BMSCs以1×105密度接种于T25培养瓶中，当细胞融合度达到80%时用胰蛋白酶消化，在4 ℃下用体积分数70%乙醇固定12 h，在37 ℃下与RNase A孵育30 min，然后在避光条件下用PI染色30 min，上流式细胞仪检测细胞周期，使用Modfit LT 5.0软件分析细胞周期。
1.4.12 细胞凋亡检测 根据细胞凋亡检测试剂盒说明检测细胞凋亡情况。将第3代BMSCs以1×105密度接种于T25培养瓶中，当细胞融合度达到80%时用胰蛋白酶消化收集细胞，PBS冲洗2次，然后将样品与5 μL膜联蛋白V-FITC/PI在避光条件下孵育15 min，上流式细胞仪检测。

1.4.13 Real-time PCR检测Bcl-2、BTK mRNA表达 将第3代BMSCs以1×105密度接种于T25培养瓶中，当细胞融合度达到80%时，使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。根据制造商的方案，使用gDNA digester plus试剂盒将分离的RNA合成cDNA，使用Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix在20 μL反应体积中进行RT-PCR。热循环条件为：在95 ℃下初始变性30 s，然后在95 ℃下进行40次变性循环，每次持续5 s，然后在60 ℃下退火/延伸30 s。通过2-ΔΔCt 方法计算mRNA的相对表达，并用β-actin进行归一化，引物序列如表1所示。

1.4.14 Western blot法检测P21、P16、Bcl-2、BTK蛋白表达 将第3代BMSCs以1×105密度接种于T25培养瓶中，当细胞融合度达到80%时，用RIPA缓冲液裂解细胞，使用BCA检测试剂盒测定蛋白质浓度。按照制造商的方案，使用市售的细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒从细胞裂解物中分离核蛋白。将等量的蛋白质裂解物与上样缓冲液煮沸，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳1.5 h，采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，用快速封闭液在室温下封闭30 min，然后在4 ℃下孵育P21、P16、Bcl-2、BTK一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶3 000)过夜，使用对一抗种类具有特异性的HRP偶联二抗(1∶5 000)室温摇床孵育2 h，使用ECL试剂显色，用Image J进行分析条带灰度值。
1.5 主要观察指标 不同培养基培养条件下BMSCs的增殖、迁移能力、细胞周期分布以及细胞凋亡情况，不同培养基培养条件下BMSCs中Bcl-2、BTK mRNA表达以及P21、P16、Bcl-2、BTK蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，GraphPad Prism 8用于制作统计图表，组间差异比较采用t检验方法。P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经得到了贵州医科大学统计学专家的审核确认。

讨论

DLBCL是一种侵袭性强的弥漫性恶性淋巴系统疾病，其特征为B细胞在淋巴组织内的快速增殖，导致组织结构损伤及功能丧失[21-23]。近10年以来，随着新药和药物组合的问世，DLBCL患者的生存率显著提升，生存时间得到延长。然而，约40%的患者仍存在复发或难治性情况[24]，而骨髓受累已被确认为DLBCL不良预后的重要因素之一[25-27]。BMSCs是骨髓内具有异质性的细胞群，能够自我更新并分化为成骨、脂肪及软骨等多种细胞类型[28-29]，通过改变骨髓微环境来维持生存，进而影响淋巴瘤细胞的生长、扩散与转移[30]。研究显示，B细胞急性淋巴细胞白血病的外泌体作为生长因子，能通过多种信号途径促进BMSCs增殖，最终导致急性淋巴细胞白血病的高发病率与高死亡率[31]。相关研究也报道，多发性骨髓瘤外泌体分泌的细胞因子和趋化因子可促进BMSCs的增殖[32-33]。多发性骨髓瘤还可以通过抑制microRNA的表达促进BMSCs的迁移[34]。该研究结果显示，DLBCL细胞条件培养液能促进BMSCs的增殖和迁移。
P16和P21是细胞周期的负性调节因子，在DLBCL中具有阻碍细胞周期进程和诱导凋亡的功能[35-36]。Western blot结果显示，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组BMSCs中P16和P21蛋白表达显著降低，这表明DLBCL细胞条件培养液可能通过抑制P16和P21的表达，从而促进BMSCs的增殖。
Bcl-2是线粒体凋亡途径的关键调节因子，首次在 t (14；18)(q32；q21)滤泡性淋巴瘤被发现参与染色体易位[37]，在多种癌症中过表达，并与耐药性密切相关[38]。BTK是一种激酶，在致癌信号传导中起关键作用，对各种B细胞恶性肿瘤白血病细胞的存活至关重要[39-40]。Real-time PCR和Western blot结果显示，CM-SU-DHL-2组和CM-OCI-LY3组BMSCs中Bcl-2和BTK蛋白表达水平显著升高。上述结果表明，DLBCL细胞条件培养基可能通过上调Bcl-2和BTK的表达抑制BMSCs的凋亡。
综上所述，在体外条件下，DLBCL细胞条件培养基可能通过下调P16和P21的表达促进人BMSCs的增殖和迁移，同时通过上调Bcl-2和BTK的表达抑制人BMSCs的凋亡，为揭示肿瘤微环境动态变化提供了实验依据，同时为DLBCL治疗策略的开发以及BMSCs的临床应用提供了理论支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡的影响

Effect of conditioned medium of diffuse large B-cell lymphoma cells on proliferation and apoptosis of human bone marrow mesenchymal stem cells

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