蛇床子素改善高糖环境下骨髓间充质干细胞的成骨分化功能

doi:10.12307/2026.581

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1641-1648.doi: 10.12307/2026.581

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

蛇床子素改善高糖环境下骨髓间充质干细胞的成骨分化功能

李镇宇1，张思明2，柏家祥2，朱晨1，2

1蚌埠医科大学研究生院，安徽省蚌埠市 233030；2中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)关节外科，安徽省合肥市 230001

收稿日期:2024-12-09 修回日期:2025-05-03 接受日期:2025-05-29 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-18
通讯作者: 朱晨，博士，主任医师，蚌埠医科大学研究生院，安徽省蚌埠市 233030；中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)关节外科，安徽省合肥市 230001
作者简介:李镇宇，男，2000年生，安徽省合肥市人，汉族，蚌埠医科大学在读硕士，主要从事骨修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82472463)，项目负责人：朱晨

Osthole improves osteogenic differentiation function of bone marrow mesenchymal stem cells under high-glucose conditions

Li Zhenyu1, Zhang Siming2, Bai Jiaxiang2, Zhu Chen1, 2

1Graduate School of Bengbu Medical University, Bengbu 233030, Anhui Province, China; 2Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital (Anhui Provincial Hospital), University of Science and Technology of China, Hefei 230001, Anhui Province, China

Received:2024-12-09 Revised:2025-05-03 Accepted:2025-05-29 Online:2026-03-08 Published:2025-08-18
Contact: Zhu Chen, MD, Chief physician, Graduate School of Bengbu Medical University, Bengbu 233030, Anhui Province, China; Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital (Anhui Provincial Hospital), University of Science and Technology of China, Hefei 230001, Anhui Province, China
About author:Li Zhenyu, Master candidate, Graduate School of Bengbu Medical University, Bengbu 233030, Anhui Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82472463 (to ZC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨髓间充质干细胞：是一种多能成体干细胞，主要存在于骨髓基质中，这些细胞具有自我更新和多向分化的特性，能分化为骨、软骨、脂肪等组织细胞。骨髓间充质干细胞具有免疫调节功能，可分泌多种生长因子，在组织修复、再生医学和细胞治疗领域具有重要研究价值。
蛇床子素：是一种从蛇床子植物中提取的生物活性化合物，属于倍半萜内酯类成分。蛇床子素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理学特性。

摘要
背景：糖尿病患者的高血糖状态会损害骨髓间充质干细胞的功能，导致骨愈合障碍等并发症。蛇床子素作为一种天然香豆素类化合物，具有促进成骨分化的潜在作用。
目的：探讨蛇床子素对高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化功能的影响。
方法：采用CCK-8方法确定高糖环境影响骨髓间充质干细胞的最适浓度及作用时间，以及蛇床子素的最佳作用浓度和时间；将骨髓间充质干细胞分为4组：空白组仅添加基础培养基培养，对照组添加成骨诱导培养基培养，高糖组在成骨诱导培养基的基础上添加25 mmol/L葡萄糖，蛇床子素组在高糖组的基础上添加80 μg/mL蛇床子素。采用碱性磷酸酶活性检测和茜素红染色定量分析评估骨髓间充质干细胞的成骨分化表型；实时荧光定量PCR和免疫荧光技术检测成骨相关因子的表达变化。

结果与结论：①CCK-8实验确定使用25 mmol/L高糖培养基培养3 d构建体外高糖环境模型，蛇床子素的最佳作用质量浓度为80 μg/mL，最佳作用时间为3 d；②在高糖环境下，蛇床子素显著增强了骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和矿化结节形成能力；③与高糖组相比，蛇床子素组Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素基因表达显著增加(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)；④与高糖组相比，蛇床子素组Runx2和骨钙素蛋白表达显著增加(P < 0.000 1)。结果表明，蛇床子素在高糖环境中可改善骨髓间充质干细胞的成骨分化功能。

https://orcid.org/0000-0002-7774-2219(朱晨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 蛇床子素, 高糖环境, 成骨分化, 糖尿病, 骨愈合

Abstract: BACKGROUND: High-glucose conditions in diabetic patients impair the function of bone marrow mesenchymal stem cells, leading to complications such as impaired bone healing. Osthole, a natural coumarin compound, has potential effects on promoting osteogenic differentiation.
OBJECTIVE: To investigate the effects of osthole on the osteogenic differentiation function of bone marrow mesenchymal stem cells under high-glucose conditions.
METHODS: CCK-8 assay was used to determine the optimal high-glucose concentration and exposure time for bone marrow mesenchymal stem cells, as well as the best osthole concentration and action time. Bone marrow mesenchymal stem cells were divided into four groups: the blank group was cultured with basal medium only; the control group was cultured with osteogenic induction medium; the high glucose group was cultured with 25 mmol/L glucose on the basis of osteogenic induction medium; the osthole group was cultured with 80 μg/mL osthole on the basis of the high glucose group. Alkaline phosphatase activity detection and Alizarin Red staining were used to evaluate the osteogenic phenotype of bone marrow mesenchymal stem cells. Real-time fluorescent quantitative PCR and immunofluorescence techniques were employed to detect changes in osteogenic-related factor expression.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 assay confirmed using 25 mmol/L high-glucose medium for 3 days to construct an in vitro high-glucose environment model, with 80 μg/mL as the optimal osthole concentration and 3 days as the optimal action time. (2) Under high-glucose conditions, osthole significantly enhanced alkaline phosphatase activity and mineralization nodule formation ability. (3) Compared with the high-glucose group, the osthole group showed significantly increased expression of Runx2, alkaline phosphatase, type I collagen, and osteocalcin genes (P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001). (4) Compared with the high-glucose group, the osthole group showed significantly increased Runx2 and osteocalcin protein expression (P < 0.000 1). The results indicate that osthole can improve the osteogenic differentiation function of bone marrow mesenchymal stem cells in high-glucose environments.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, osthole, high-glucose condition, osteogenic differentiation, diabetes, bone healing

中图分类号:

李镇宇, 张思明, 柏家祥, 朱晨. 蛇床子素改善高糖环境下骨髓间充质干细胞的成骨分化功能[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1641-1648.

Li Zhenyu, Zhang Siming, Bai Jiaxiang, Zhu Chen. Osthole improves osteogenic differentiation function of bone marrow mesenchymal stem cells under high-glucose conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1641-1648.

图/表（结果） 2

2.1 葡萄糖作用于骨髓间充质干细胞的最佳浓度与时间
2.1.1 最佳作用浓度 将骨髓间充质干细胞分别加入不同浓度的葡萄糖溶液(5.5，16.5，25，35，50 mmol/L)处理24 h。结果显示，在35，50 mmol/L时，细胞数量显著下降，表明较高浓度葡萄糖具有细胞毒性作用(P < 0.000 1)。因此，25 mmol/L被确定为无细胞毒性的最佳葡萄糖浓度，如图1A所示。
2.1.2 最佳作用时间 将骨髓间充质干细胞加入不同浓度葡萄糖溶液中，分别处理1，3，5 d。结果显示，3 d时细胞增殖有所减少，5 d时减少更为显著(P < 0.000 1)。因此，3 d被选为最佳处理时间，如图1B所示。
2.2 蛇床子素最佳作用质量浓度和时间 在高糖环境下，骨髓间充质干细胞分别加入不同质量浓度的蛇床子素(0，40，80，160，320 μg/mL)进行处理。结果显示，80 μg/mL蛇床子素干预5 d时吸光度值最高，而较高质量浓度(160，320 μg/mL)蛇床子素在干预5 d时吸光度值显著降低，表明具有细胞毒性(P < 0.000 1)，见图2。因此，80 μg/mL被确定为在无毒性情况下促进细胞增殖的蛇床子素最佳质量浓度，5 d是最佳作用时间，将用于后续长期培养实验中。
2.3 碱性磷酸酶染色及活性 碱性磷酸酶染色结果显示，与高糖组相比，蛇床子素组的碱性磷酸酶染色程度显著增强，表明成骨分化能力提高。碱性磷酸酶活性检测进一步证实了这一点，蛇床子素组的碱性磷酸酶活性显著高于高糖组(P < 0.000 1)，见图3。
2.4 茜素红染色及定量分析 茜素红染色显示，矿化结节的形成显著增加。与高糖组相比，蛇床子素组的矿化结节染色程度明显增强，表明蛇床子素促进了成骨分化。茜素红染色定量分析进一步证实了这一结果，蛇床子素组的矿化结节吸光度值显著高于高糖组(P < 0.000 1)，见图4。
2.5 成骨相关基因表达 RT-qPCR检测成骨相关基因的mRNA表达水平，包括Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素，见图5。结果显示，与对照组相比，高糖环境显著抑制了4种基因的表达(P < 0.001)。在高糖环境中添加蛇床子素后，这些基因的表达水平显著上调(P < 0.05，P < 0.01)。

2.6 免疫荧光染色检测Runx2、骨钙素表达 免疫荧光染色结果显示，在高糖环境下，Runx2和骨钙素的表达水平较低，而添加蛇床子素后，Runx2和骨钙素的相对荧光强度显著上升(P < 0.000 1)，见图6。这表明蛇床子素可能通过上调这些成骨相关因子的表达来促进骨髓间充质干细胞向成熟骨细胞分化。

参考文献

[1] SCHWARTZ SS, CORKEY BE, R GAVIN J 3RD, et al. Advances and counterpoints in type 2 diabetes. What is ready for translation into real-world practice, ahead of the guidelines. BMC Med. 2024;22(1):356.
[2] ROSE KJ, PETRUT C, L’HEVEDER R, et al. IDF Europe’s position on mobile applications in diabetes. Diabetes Res Clin Pract. 2019;149:39-46.
[3] KUPAI K, KANG HL, PÓSA A,et al. Bone Loss in Diabetes Mellitus: Diaporosis. Int J Mol Sci. 2024;25(13):7269.
[4] RUAN B, DONG J, WEI F, et al. DNMT aberration-incurred GPX4 suppression prompts osteoblast ferroptosis and osteoporosis. Bone Res. 2024;12(1):68.
[5] LIU Y, NISHIURA M, FUJII M, et al. Selective Pyk2 inhibition enhances bone restoration through SCARA5-mediated bone marrow remodeling in ovariectomized mice. Cell Commun Signal. 2024;22(1):561.
[6] HURTADO Y, HERNÁNDEZ OA, DE LEON DPA, et al. Challenges in Delivering Effective Care for Older Persons with Fragility Fractures. Clin Interv Aging. 2024;19:133-140.
[7] MA Y, LIU B, YIN F, et al. Vitamin D level as a predictor of dysmobility syndrome with type 2 diabetes. Sci Rep. 2024;14(1):19792.
[8] IWAMOTO SJ, ROTHMAN MS, T’SJOEN G, et al. Approach to the Patient: Hormonal Therapy in Transgender Adults With Complex Medical Histories. J Clin Endocrinol Metab. 2024;109(2):592-602.
[9] CHEN DQ, WU YX, ZHANG YX, et al. Sarcopenia-associated factors and their bone mineral density levels in middle-aged and elderly male type 2 diabetes patients. World J Diabetes. 2024;15(12):2285-2292.
[10] ALSAHHAF A, ALSHIDDI IF, ALSHAGROUD RS, et al. Clinical and radiographic indices around narrow diameter implants placed in different glycemic-level patients. Clin Implant Dent Relat Res. 2019; 21(4):621-626.
[11] THAKKAR UG, TRIVEDI HL, VANIKAR AV, et al. Insulin-secreting adipose-derived mesenchymal stromal cells with bone marrow-derived hematopoietic stem cells from autologous and allogenic sources for type 1 diabetes mellitus. Cytotherapy. 2015;17(7):940-947.
[12] LI H, SHENGKE Z, WEI G, et al. Microangiopathy in myocardial ischemia with non-obstructive coronary artery disease: A case series. Asian J Surg. 2024;47(12):5284-5285.
[13] LI Z, ZHANG B, SHANG J, et al. Diabetic and nondiabetic BMSC-derived exosomes affect bone regeneration via regulating miR-17-5p/SMAD7 axis. Int Immunopharmacol. 2023;125(Pt B):111190.
[14] AMATO CM, XU X, YAO HH. An extragenital cell population contributes to urethra closure during mouse penis development. Sci Adv. 2024; 10(49):eadp0673.
[15] ZHANG Q, ZUO H, YU S, et al. RUNX2 collaborates with EGR1 to regulate osteogenic differentiation by modulating the Htra1 enhancer. J Cell Physiol. 2020;235(11):8601-8612.
[16] WU L, XU T, LI S, et al. Sequential activation of osteogenic microenvironment via composite peptide-modified microfluidic microspheres for promoting bone regeneration. Biomaterials. 2025; 316:122974.
[17] SU G, ZHANG D, LI T, et al. Annexin A5 derived from matrix vesicles protects against osteoporotic bone loss via mineralization. Bone Res. 2023;11(1):60.
[18] TRZASKOWSKA M, VIVCHARENKO V, BENKO A, et al. Biocompatible nanocomposite hydroxyapatite-based granules with increased specific surface area and bioresorbability for bone regenerative medicine applications. Sci Rep. 2024;14(1):28137.
[19] 罗文豪,冯乐,黄海霞,等.高糖微环境下糖原合酶激酶3β抑制剂Tideglusib干预大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化[J].中国组织工程研究,2023,27(19):2968-2974.
[20] DONG S, ZHAO T, WU W, et al. Sandblasted/Acid-Etched Titanium Surface Modified with Calcium Phytate Enhances Bone Regeneration in a High-Glucose Microenvironment by Regulating Reactive Oxygen Species and Cell Senescence. ACS Biomater Sci Eng. 2023;9(8): 4720-4734.
[21] SUN M, SUN M, ZHANG J. Osthole: an overview of its sources, biological activities, and modification development. Med Chem Res. 2021;30(10):1767-1794.
[22] JIN ZX, LIAO XY, DA WW, et al. Osthole enhances the bone mass of senile osteoporosis and stimulates the expression of osteoprotegerin by activating β-catenin signaling. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):154.
[23] ZHANG ZR, LEUNG WN, LI G, et al. Osthole Enhances Osteogenesis in Osteoblasts by Elevating Transcription Factor Osterix via cAMP/CREB Signaling In Vitro and In Vivo. Nutrients. 2017;9(6):588.
[24] 谭文彬,李佳,刘明玉,等.糖尿病及降糖药物对骨代谢及骨折影响的相关研究进展[J].解放军医学院学报,2024,45(1):44-48.
[25] 朱玲,朱恩江,孙曙光,等.PI3K/Akt 信号通路与糖尿病性骨质疏松相关性研究进展[J].临床医学进展,2023,13(2):2437-2443.
[26] LANZOLLA G, SABINI E, BEIGEL K, et al. Pharmacological inhibition of HIF2 protects against bone loss in an experimental model of estrogen deficiency. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(49):e2416004121.
[27] 武淑俊.糖尿病并发症的发病机制及治疗研究进展[J].中国处方药,2021,19(11):69-70.
[28] SHENG N, XING F, WANG J, et al. Recent progress in bone-repair strategies in diabetic conditions. Mater Today Bio. 2023;23:100835.
[29] SI Y, WANG C, GUO Y, et al. Prevalence of Osteoporosis in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus in the Chinese Mainland: A Systematic Review and Meta-Analysis. Iran J Public Health. 2019;48(7):1203-1214.
[30] 刘天柱,尉晓蔚,刘阁,等.骨髓间质干细胞的成骨诱导作用及其机制的研究进展[J].中华骨科杂志,2021,41(4):262-270.
[31] WU J, LI X, NIE H, et al. Phytic acid promotes high glucose-mediated bone marrow mesenchymal stem cells osteogenesis via modulating circEIF4B that sponges miR-186-5p and complexes with IGF2BP3. Biochem Pharmacol. 2024;222:116118.
[32] 贾伟平.对我国糖尿病并发症防治的战略思考[J].中华糖尿病杂志,2019,11(8):505-507.
[33] SHANG Q, LIU W, LESLIE F, et al. Nano-formulated delivery of active ingredients from traditional Chinese herbal medicines for cancer immunotherapy. Acta Pharm Sin B. 2024;14(4):1525-1541.
[34] WENG N, LV S, CHEN H, et al. Osthole induces accumulation of impaired autophagosome against pancreatic cancer cells. Sci Rep. 2024;14(1):30163.
[35] 文静静,徐婷,崔宇赫,等.蛇床子素的药理作用及其分子机制研究进展[J].国际医学与数据杂志,2023,7(8):1-5.
[36] WANG L, YANG H, ZHANG C, et al. A blood glucose fluctuation-responsive delivery system promotes bone regeneration and the repair function of Smpd3-reprogrammed BMSC-derived exosomes. Int J Oral Sci. 2024;16(1):65.
[37] QU B, ZENG Z, YANG H, et al. Resveratrol reversed rosiglitazone administration induced bone loss in rats with type 2 diabetes mellitus. Biomed Pharmacother. 2024;178:117208.
[38] ZHAO D, TU C, ZHANG L, et al. Activation of connexin hemichannels enhances mechanosensitivity and anabolism in disused and aged bone. JCI Insight. 2024;9(23):e177557.
[39] WANG Z, DENG W, TANG K, et al. Isoginkgetin Inhibits RANKL-induced Osteoclastogenesis and Alleviates Bone Loss. Biochem Pharmacol. 2025;231:116673.
[40] NAPOLI N, CHANDRAN M, PIERROZ DD, et al. Mechanisms of diabetes mellitus-induced bone fragility. Nat Rev Endocrinol. 2017;13(4): 208-219.
[41] RUSH E, BRANDI ML, KHAN A, et al. Proposed diagnostic criteria for the diagnosis of hypophosphatasia in children and adolescents: results from the HPP International Working Group. Osteoporos Int. 2024;35(1):1-10.

引言

作为一种严重的代谢性疾病，糖尿病已在全球范围内流行，其主要特征是血糖调控紊乱导致的持续性高血糖状态，这种疾病会引起多器官功能障碍，包括心血管系统、神经系统、肾脏和骨骼系统等。根据国际糖尿病联合会(IDF)的统计，全球有超过4.6亿人受到糖尿病的影响[1-2]。糖尿病引起的持续性高血糖不仅破坏系统性代谢平衡，还会影响骨组织的正常生理功能，导致骨量减少、骨微结构破坏等一系列骨代谢异常[3-4]，这种代谢异常主要通过影响骨髓间充质干细胞的生物学功能来实现，特别是抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞谱系分化[5]。糖尿病性骨质疏松的发病机制较为复杂。高血糖环境不仅直接损害骨组织代谢平衡，还通过多种途径影响骨重建过程[6-8]。长期高血糖会促进晚期糖基化终末产物在骨组织中堆积，导致骨基质蛋白功能异常[9-10]；同时微血管病变影响骨组织血供和营养，而胰岛素水平变化也会扰乱骨代谢调节网络[11-12]，在这种复杂的病理环境下，骨髓间充质干细胞的功能受到显著抑制，这可能是糖尿病患者易发生骨质疏松、骨折愈合延迟等并发症的重要原因[13]。
骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的间充质干细胞，在骨组织形成中发挥核心作用。在正常生理条件下，骨髓间充质干细胞通过有序的成骨分化过程维持骨组织的更新与重建[14]。转录因子Runx2作为成骨分化的主要调控因子，能够促进碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等早期成骨标志物的表达[15-16]，并在后期诱导骨钙素等成熟成骨标志物的表达，最终实现骨基质的合成和矿化[17-18]。然而，高糖微环境显著影响这一分化过程，导致成骨相关基因表达异常，最终表现为成骨分化能力显著下降[19-20]。
蛇床子素(Osthole)是一种香豆素类天然小分子化合物，因其独特的生物学活性而备受关注[21-22]。已有研究证实，蛇床子素在多种细胞类型中均表现出显著的生物学效应[23]，特别是在骨代谢方面，蛇床子素表现出促进成骨分化的作用，可通过上调成骨相关基因的表达来促进骨基质的合成和矿化[24]，这些为蛇床子素在高糖环境下保护骨髓间充质干细胞成骨功能提供了一定的理论基础。
目前，针对糖尿病相关骨代谢异常的干预策略仍存在诸多挑战[25]。除了传统的血糖控制外，如何维持骨组织的正常代谢平衡仍是研究的重点[26]。蛇床子素作为一种具有多重生物学活性的天然小分子化合物[27]，若能证实它在高糖环境下可促进骨髓间充质干细胞成骨分化，不仅有助于深化对糖尿病相关骨代谢异常的认识，还可能为相关疾病的治疗提供新的思路。
该研究拟通过体外实验系统探究蛇床子素对高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。首先通过细胞活力实验确定高糖环境和蛇床子素的最适浓度及作用时间窗；其次采用碱性磷酸酶活性和茜素红染色定量分析评估骨髓间充质干细胞的成骨分化表型；最后通过实时荧光定量PCR和免疫荧光技术检测Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素等成骨相关因子的表达变化，以期系统评价蛇床子素对高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.3.1 实验细胞 骨髓间充质干细胞购买于IMMOCELL，源自健康成年大鼠。选择第3-6代细胞进行实验。
1.3.2 实验仪器 二氧化碳培养箱(Thermo)；超净工作台( Boxun)；显微照相系统(OLYMPUS)；酶标仪、反转录仪(BIO-RAD)；PCR仪(TaKaRa)。
1.3.3 药品与试剂 蛇床子素(碧云天生物科技有限公司，50 mg/瓶)；α-MEM培养基(Hyclone)；CCK-8
(碧云天生物科技有限公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天生物科技有限公司)；成骨细胞矿化结节染色试剂盒(茜素红S法)；总RNA提取试剂盒(Spakejade)；反转录试剂盒(TaKaRa)；PCR引物(Thermo Fish)；成骨诱导培养基(iCell)；免疫荧光染色抗体(Abcam)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 将骨髓间充质干细胞分为4组：空白组仅添加基础培养基培养，对照组添加成骨诱导培养基培养，高糖组在成骨诱导培养基的基础上添加25 mmol/L葡萄糖，蛇床子素组在高糖组的基础上添加80 μg/mL蛇床子素。
1.4.2 细胞培养 使用含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的α-MEM培养基作为基础培养基，灭菌处理后分装保存于4 ℃冰箱中。将冷冻的骨髓间充质干细胞迅速解冻，离心去除二甲基亚砜后重悬于新鲜培养基中，调整细胞浓度至1×108 L-1，接种于适当大小的培养瓶或培养板中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。细胞在贴壁生长至80%-90%融合时进行传代，传代时用胰蛋白酶消化细胞，基础培养基中和后离心重悬，重新接种至新的培养瓶中继续培养。在细胞达到对数生长期时，使用含10%二甲基亚砜的培养基将细胞重悬，分装至冷冻管中，标记后放入-80 ℃冰箱中冷冻保存。
1.4.3 药物配制 首先称取适量的蛇床子素粉末，溶解于无菌的二甲基亚砜中，配制成1 mg/mL的母液。随后，根据实验需要，将母液用培养基稀释至所需的工作浓度，最佳作用质量浓度范围为40-320 μg/mL。
为避免二甲基亚砜对细胞的毒性作用，确保最终培养基中二甲基亚砜的终浓度不超过0.1%。配制好的蛇床子素工作溶液应在4 ℃避光保存，并在24 h内使用，以确保药物的活性和稳定性。
1.4.4 细胞增殖检测 ①将骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每孔接种3 500个细胞。为筛选高糖环境下的最佳作用浓度，分别加入5.5 mmol/L (正常葡萄糖浓度)和16.5，25，35，50 mmol/L葡萄糖溶液，刺激24 h。②将骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每孔接种3 500个细胞。为筛选高糖环境下的最佳作用时间，加入25 mmol/L葡萄糖溶液，刺激1，3，5 d。③将骨髓间充质干细胞接种于96孔板中，每孔接种3 500个细胞。为确定蛇床子素的最佳作用质量浓度和最佳作用时间，在加入25 mmol/L葡萄糖溶液的基础上，分别用40，80，160，320 μg/mL蛇床子素处理细胞，刺激1，3，5 d，每孔加入10 μL CCK-8试剂及90 μL α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内孵育1 h，使用酶标仪在450 nm处检测各孔的吸光度值，以评估细胞增殖情况。
1.4.5 碱性磷酸酶染色及活性检测 将骨髓间充质干细胞以3×104/孔密度接种于24孔板中，在细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁，根据分组进行相应干预，在第3天时统一换液，高糖组和蛇床子素组不再添加25 mmol/L葡萄糖，在第5天时统一换液，蛇床子素组不再添加80 μg/mL蛇床子素，之后每2 d换液1次，第7天时进行碱性磷酸酶染色。使用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，然后用PBS洗涤3次，每次5 min，根据碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行染色，室温孵育30 min，用PBS洗涤细胞，在显微镜下观察和拍照记录碱性磷酸酶染色结果。在培养结束后，使用细胞裂解液处理细胞，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，以标准化碱性磷酸酶活性。根据碱性磷酸酶活性试剂盒说明书进行检测，在96孔板中加入样品和底物溶液，37 ℃孵育30 min，加入终止液停止反应，在405 nm处使用酶标仪测定吸光度值。通过比较各组碱性磷酸酶活性，评估蛇床子素在高糖环境下对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。
1.4.6 茜素红染色及定量分析 将骨髓间充质干细胞以3×104/孔密度接种于24孔板中，在细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁，根据分组进行相应干预，在第3天时统一换液，高糖组和蛇床子素组不再添加25 mmol/L葡萄糖，在第5天时统一换液，蛇床子素组不再添加80 μg/mL蛇床子素，之后每2 d换液1次，第21天时进行茜素红染色，用体积分数75%乙醇固定细胞10 min，然后用去离子水洗涤3次，使用2%茜素红S溶液(pH 4.2)染色，室温下孵育20 min，染色后用去离子水彻底洗涤细胞，直至背景无色，用显微镜观察并拍照记录矿化结节的形成。为定量分析茜素红染色的矿化结节，将染色后的细胞加入0.5 mL 5%十二烷基硫酸钠溶液中，在室温下孵育30 min以溶解染料。将溶解的染料转移至96孔板中，每孔150 μL，在405 nm处使用酶标仪测定吸光度值。通过标准曲线计算茜素红染色的定量结果，以评估蛇床子素在高糖环境下对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。

1.4.7 成骨相关基因表达检测(RT-qPCR) 将骨髓间充质干细胞以5×104/孔密度接种于6孔板中，在细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁，根据分组进行相应干预，在第3天时统一换液，高糖组和蛇床子素组不再添加25 mmol/L葡萄糖，在第5天时统一换液，蛇床子素组不再添加80 μg/mL蛇床子素，之后每2 d换液1次，第7天时进行基因表达检测，使用TRIzol试剂按照制造商的说明提取细胞总RNA。RNA浓度通过NanoDrop ND-1000分光光度计进行定量，RNA质量通过A260/A280比值进行确定。使用高容量cDNA反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix在ABI One-step检测系统上进行qPCR反应。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt方法标准化并定量相对基因表达水平。每个基因扩增反应独立重复3次，基因引物序列见表1。

1.4.8 免疫荧光检测 将骨髓间充质干细胞以5×104/孔密度接种于6孔板中，在细胞培养箱中培养24 h待细胞贴壁，根据分组进行相应干预，在第3天时统一换液，高糖组和蛇床子素组不再添加25 mmol/L
葡萄糖，在第5天时统一换液，蛇床子素组不再添加80 μg/mL蛇床子素，之后每2 d换液1次，第7天时进行免疫荧光检测。用PBS(pH 7.4)冲洗培养好的细胞爬片3次，每次3 min；加入40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS冲洗3次，每次5 min；加入0.1% Triton X-100室温透膜15 min，PBS冲洗3次，每次5 min；用含体积分数5%山羊血清的PBS室温封闭1 h；吸除封闭液后加入按适当比例稀释的兔抗Runx2一抗(1∶200)和小鼠抗骨钙素一抗(1∶200)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min；避光条件下加入Alexa Fluor 488标记的羊抗兔二抗(1∶500)和Alexa Fluor 594标记的羊抗鼠二抗(1∶500)，室温避光孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min；加入DAPI染液(1∶1 000)室温避光染色5 min，PBS冲洗3次，每次5 min；最后用防荧光淬灭封片剂封固，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。每组设3个平行样本，设置仅加二抗的阴性对照，拍照时保持显微镜参数设置一致，使用Image J软件随机选取3个视野对荧光强度进行半定量分析。
1.5 主要观察指标 ①细胞活力；②碱性磷酸酶活性；③矿化结节形成情况；④成骨相关基因Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素mRNA表达；⑤成骨相关蛋白Runx2、骨钙素表达。
1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 9.0软件对实验数据进行统计学分析。定量数据以x±s表示，采用Mann-Whitney U检验比较组间差异，并进行正态性检验以确定数据分布情况，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过安徽省立医院生物统计学专家审核。

讨论

糖尿病作为一种全球性慢性代谢疾病，其并发症严重威胁患者的生活质量[28]。近年来，随着糖尿病发病率的持续上升，其相关骨科并发症日益受到关注[29]。研究表明，40%-60%的糖尿病患者会出现不同程度的骨质疾病，包括骨质疏松、骨折愈合延迟等[30]。骨髓间充质干细胞作为骨组织修复和再生的关键细胞群，其功能状态直接影响着骨组织的健康[31]。然而，糖尿病患者体内持续的高糖环境会显著抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化，导致骨组织修复能力下降[32]。虽然目前临床上已经开发出多种促进骨组织修复的治疗策略，但这些方法在糖尿病患者中的效果往往不尽如人意。传统的生长因子治疗虽然能促进骨愈合，但在高糖环境下其作用明显减弱，且存在安全性隐患[33]。因此，寻找能够在高糖环境下有效改善骨髓间充质干细胞功能的治疗药物具有重要的临床意义。为了研究骨髓间充质干细胞在糖尿病患者体内高糖环境下的状态，此次研究通过高糖培养基模拟体内高糖环境，并且25 mmol/L葡萄糖被确定为无细胞毒性的最佳浓度。
近年来，从中药中筛选活性成分用于疾病治疗已成为新药研发的重要策略之一[34]。蛇床子素作为一种天然香豆素类化合物，已被证实具有多种药理活性[35]。虽然已有研究报道了蛇床子素在常规培养条件下促进细胞增殖和分化的作用[36]，但它在糖尿病这一特殊病理环境下对骨髓间充质干细胞的影响尚未可知，这一研究空白亟待填补[37]。通过CCK-8实验发现80 μg/mL蛇床子素能最大限度地提高骨髓间充质干细胞的增殖活性且无明显细胞毒性。将80 μg/mL蛇床子素加入高糖环境中，碱性磷酸酶活性和茜素红染色矿化结节数量相较于高糖组有明显提升，说明蛇床子素组骨髓间充质干细胞成骨分化能力增强。RT-qPCR结果和免疫荧光染色结果从基因层面上验证了这一点，与高糖组相比，蛇床子素处理显著上调了多个成骨相关基因的表达。
基于上述研究结果，首次在高糖环境下系统地验证了蛇床子素对骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用。蛇床子素组的碱性磷酸酶活性和矿化结节形成均显著高于高糖组，这种差异可能与蛇床子素独特的分子作用机制有关。此外，蛇床子素显著上调了多个成骨相关基因的表达，这种多靶点的调控特性可能是其在高糖环境下仍能维持良好效果的关键。
尽管该研究证实了蛇床子素在高糖环境下对骨髓间充质干细胞的积极影响，但仍存在一些局限性：一是未建立糖尿病动物模型，缺乏体内验证；二是实验中使用的骨髓间充质干细胞来源问题也值得关注。该研究选用的是健康供体来源细胞，而有研究发现长期暴露于糖尿病环境下的骨髓间充质干细胞可能已经发生了某些不可逆的表型改变[38]，这种差异可能导致低估了临床应用中可能遇到的挑战；三是对蛇床子素作用机制的探讨还不够深入，该研究主要关注了成骨分化这一方面，但骨组织的健康维持实际上是一个更复杂的平衡过程[39]。骨吸收和骨形成的动态平衡在糖尿病患者中往往发生紊乱[40]。蛇床子素对破骨细胞活性的影响以及在整体骨重塑过程中的作用仍需要进一步探索。后续的研究将重点注意这些内容。
该研究以蛇床子素为切入点，深入探讨了高糖环境对骨髓间充质干细胞成骨分化功能的影响。研究发现，在高糖条件下，蛇床子素能有效缓解骨髓间充质干细胞成骨分化障碍，这不仅揭示了蛇床子素在调节骨代谢过程中的重要作用，也为糖尿病骨质疏松的早期干预开辟了新的思路。当前研究表明，糖尿病患者骨质疏松的发生往往在早期阶段就已悄然开始，但传统的诊断标准往往难以及时捕捉这一微妙变化[41]。该研究通过深入分析高糖环境对骨髓间充质干细胞的分子调控机制，为精准识别和干预骨代谢异常提供了更细致的视角。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

蛇床子素改善高糖环境下骨髓间充质干细胞的成骨分化功能

Osthole improves osteogenic differentiation function of bone marrow mesenchymal stem cells under high-glucose conditions

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	高艳果, 郭旭, 李晓晗, 陈仕琦, 朱海涛, 黄良永, 叶方, 卢伟, 王启斌, 郑涛, 陈黎. 糖尿病皮肤创面模型小鼠正交实验优选“红黄白”凝胶的处方配比[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1921-1928.
[2]	潘之怡, 黄嘉雯, 薛文君, 徐建达. MXene柔性电子传感器的优势及在糖尿病足创面监测中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 2023-2032.
[3]	吴妍廷, 李宇, 廖金凤. 氧化镁纳米粒调控成骨与血管生成相关基因表达促进骨缺损愈合[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1885-1895.
[4]	蒋星海, 宋玉林, 李德津, 邵建敏, 徐军志, 刘华凯, 吴应国, 沈岳辉, 冯思诚. 血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞构建血管化两亲性肽凝胶模块[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1903-1911.
[5]	胡雄科, 刘少华, 谭谦, 刘昆, 朱光辉. 紫草素干预骨髓间充质干细胞改善老年小鼠股骨的微结构[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1609-1615.
[6]	宋浦蓁, 马贺宾, 陈宏广, 章亚东. 骨髓间充质干细胞外泌体联合转化生长因子β1对巨噬细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1616-1623.
[7]	袁小霜, 杨姁, 杨波, 陈晓旭, 田婷, 王飞清, 李艳菊, 刘洋, 杨文秀. 弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞条件培养液对人骨髓间充质干细胞增殖、凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1632-1640.
[8]	韩念荣, 黄异飞, 艾克热木·吾斯曼, 刘岩路, 胡炜. 高糖微环境中程序性细胞死亡受体1抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1649-1657.
[9]	金东升, 赵张红, 朱子银, 张森, 孙祖延, 邓江. 淫羊藿苷缓释微球三维支架对兔骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1658-1668.
[10]	邹玉莲, 陈朝沛, 黄海霞, 兰玉燕, 刘敏, 黄婷. 白藜芦醇在炎症微环境下促进骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1669-1678.
[11]	吕晓凡, 黄懿, 丁留成. 糖尿病膀胱病的线粒体机制与干预治疗[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1508-1515.
[12]	潘鸿飞, 庄圳冰, 徐白云, 杨章阳, 林恺瑞, 詹冰晴, 蓝靖涵, 高恒, 张南波, 林家煜. 不同浓度金诺芬抑制M1型巨噬细胞功能及修复糖尿病小鼠伤口的价值[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1390-1397.
[13]	彭志伟, 陈雷, 佟磊. 木犀草素促进糖尿病小鼠创面愈合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1398-1406.
[14]	文凡, 向阳, 朱欢, 庹艳芳, 李锋. 运动干预改善2型糖尿病患者的微血管功能[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(5): 1225-1235.
[15]	温小龙, 翁锡全, 冯瑶, 曹文燕, 刘玉倩, 王海涛, . 炎症对2型糖尿病患者血清抗菌多肽及铁代谢相关参数影响的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(5): 1294-1301.