骨髓间充质干细胞外泌体联合转化生长因子β1对巨噬细胞的作用

doi:10.12307/2026.520

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (7): 1616-1623.doi: 10.12307/2026.520

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骨髓间充质干细胞外泌体联合转化生长因子β1对巨噬细胞的作用

宋浦蓁1，马贺宾1，陈宏广2，章亚东2

1解放军医学院，北京市 100853；2解放军总医院第四医学中心骨科医学部，北京市 100048

收稿日期:2024-12-02 修回日期:2025-03-05 接受日期:2025-03-19 出版日期:2026-03-08 发布日期:2025-08-17
通讯作者: 章亚东，博士，教授，解放军总医院第四医学中心骨科医学部，北京市 100048
作者简介:宋浦蓁，男，1991年生，辽宁省盘锦市人，汉族，解放军医学院在读硕士，主治医师，主要从外泌体、软骨损伤、生物工程材料等方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82072451)，项目负责人：章亚东；北京市科技计划课题经费(Z221100007422014)，项目负责人：章亚东

Effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes combined with transforming growth factor beta 1 on macrophages

Song Puzhen1, Ma Hebin1, Chen Hongguang2, Zhang Yadong2

1Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China; 2Department of Orthopedic Medicine, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China

Received:2024-12-02 Revised:2025-03-05 Accepted:2025-03-19 Online:2026-03-08 Published:2025-08-17
Contact: Zhang Yadong, MD, Professor, Department of Orthopedic Medicine, Fourth Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
About author:Song Puzhen, Master candidate, Attending physician, Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82072451 (to ZYD); Beijing Science and Technology Plan Project Funds, No. Z221100007422014 (to ZYD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

巨噬细胞极化：是指巨噬细胞在不同环境刺激下分化为具有特定功能的2种主要亚型：M1型和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞主要参与促炎反应，释放如白细胞介素6和白细胞介素1β等炎性因子，而M2型巨噬细胞主要参与抗炎和组织修复，释放如白细胞介素10和CD163等抗炎因子。在文章中，巨噬细胞极化是研究核心，通过联合使用骨髓间充质干细胞外泌体和转化生长因子β1，促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化，从而减轻骨关节炎的炎症反应。
骨髓间充质干细胞外泌体：是由骨髓间充质干细胞分泌的一种纳米级囊泡，平均直径约为115 nm，携带多种生物活性分子，如蛋白质、脂质、mRNA和miRNA。在文章中，骨髓间充质干细胞外泌体被巨噬细胞内吞后，显著促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。

摘要
背景：骨关节炎是一种由多因素引起的退行性疾病，研究发现巨噬细胞极化在骨关节炎中起着重要作用，M1型巨噬细胞释放促炎因子，促进骨关节炎的发展，M2型巨噬细胞产生抗炎因子，抑制骨关节炎的发展。
目的：探究骨髓间充质干细胞外泌体联合转化生长因子β1对巨噬细胞极化的影响，探讨治疗骨关节炎的新方法。
方法：采用差速离心法提取骨髓间充质干细胞外泌体，通过透射电镜、粒径分析和Western blot检测相关蛋白表达进行鉴定。使用骨髓间充质干细胞外泌体、转化生长因子β1单独或联合处理巨噬细胞24 h，以未干预巨噬细胞为对照组，运用共聚焦显微镜观察骨髓间充质干细胞外泌体在巨噬细胞内的分布情况，采用RT-PCR、ELISA、Western blot实验评估巨噬细胞极化的效果。

结果与结论：①骨髓间充质干细胞外泌体呈新月形，平均粒径约115 nm，表达特异性蛋白CD63；②与对照组相比，其他组抗炎因子白细胞介素10、CD163表达增多，促炎因子白细胞介素6、白细胞介素1β表达减少，骨髓间充质干细胞外泌体+转化生长因子β1组效果最显著(P < 0.001)。结果表明，骨髓间充质干细胞外泌体与转化生长因子β1的联合应用能更有效地促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。

https://orcid.org/0009-0007-9218-0027(宋浦蓁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨关节炎, 骨髓间充质干细胞外泌体, 转化生长因子β1, 巨噬细胞极化, M1型巨噬细胞, M2型巨噬细胞, 促炎因子, 抗炎因子

Abstract: BACKGROUND: Osteoarthritis is a degenerative disease caused by multiple factors. Studies have found that macrophage polarization plays an important role in osteoarthritis. M1 macrophages release pro-inflammatory factors to promote the development of osteoarthritis, while M2 macrophages produce anti-inflammatory factors to inhibit the development of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes combined with transforming growth factor β1 on the polarization of macrophages, and explore a new method for the treatment of osteoarthritis.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes were extracted by differential centrifugal method and identified by transmission electron microscopy, particle size analysis, and western blot assay. Macrophages were treated with bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes, transforming growth factor β1, and bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes + transforming growth factor β1 for 24 hours. The macrophages without intervention were used as the control group. The distribution of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes in macrophages was observed by confocal microscopy. The effect of macrophage polarization was evaluated by reverse transcription-polymerase chain reaction, enzyme-linked immunosorbent assay, and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes were crescent-shaped, with average particle size of about 115 nm. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes expressed the specific protein CD63. (2) Compared with the control group, the expressions of anti-inflammatory factors interleukin-10 and CD163 increased in the other three groups, and the expressions of pro-inflammatory factors interleukin-6 and interleukin-1β decreased, and the effects of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes + transforming growth factor β1 group were the most significant (P < 0.001). The results show that the combination of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes and transforming growth factor β1 more effectively promotes the polarization of M1-type macrophages to M2-type macrophages.

Key words: em cell-derived exosome, transforming growth factor β1, macrophage polarization, M1 macrophage, M2 macrophage, pro-inflammatory factor, anti-inflamm

中图分类号:

宋浦蓁, 马贺宾, 陈宏广, 章亚东. 骨髓间充质干细胞外泌体联合转化生长因子β1对巨噬细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1616-1623.

Song Puzhen, Ma Hebin, Chen Hongguang, Zhang Yadong. Effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes combined with transforming growth factor beta 1 on macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(7): 1616-1623.

图/表（结果） 7

2.1 通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和蛋白质印迹法鉴定纯化的BMSC-Exos 透射电镜显示BMSC-Exos呈“半球”形(图1A)，与外泌体的形态学特征一致。纳米颗粒跟踪分析显示囊泡平均直径为115.8 nm(图1B)，符合文献中描述的典型外泌体粒径范围(30-150 nm)[21]，表明所提取的外泌体粒径集中，且分布均匀。使用Western blot检测BMSC-Exos表面标志物，结果显示外泌体的特征性表面标志物CD63呈阳性表达(图1C)，进一步验证了所提取的囊泡确为外泌体。总体来说，这些结果证实了从骨髓间充质干细胞上清液中成功分离BMSC-Exos。

2.2 BMSC-Exos定位于巨噬细胞内 共聚焦显微镜观察显示被PKH-26染色的BMSC-Exos进入巨噬细胞内(图2)。

2.3 RT-PCR检测RAW264.7巨噬细胞极化的效果 BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素10 mRNA表达水平显著高于对照组、BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.001)(表2，图3A)。BMSC-Exos组和TGF-β1组CD163 mRNA表达水平显著高于对照组(P < 0.01)，同时，BMSC-Exos+TGF-β1组CD163 mRNA表达水平也分别高于BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.01)(图3B)。BMSC-Exos组和TGF-β1组白细胞介素6 mRNA表达水平均低于对照组(P < 0.01)，而BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素6 mRNA表达水平分别低于BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.001)(图3C)。BMSC-Exos组和TGF-β1组白细胞介素1β mRNA表达水平低于对照组(P < 0.01)，BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素1β mRNA表达水平低于对照组和BMSC-Exos组(P < 0.01)(图3D)。

2.4 ELISA检测RAW264.7巨噬细胞极化的效果 BMSC-Exos组和TGF-β1组白细胞介素10水平高于对照组(P < 0.001)，且BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素10水平均高于对照组、BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.001)(表3，图4A)。
BMSC-Exos 组和TGF-β1组CD63水平高于对照组(P < 0.001)。同时，BMSC-Exos+TGF-β1组CD163 水平分别高于对照组、BMSC-Exos 组和TGF-β1组(P < 0.001)(图4B)。BMSC-Exos组和TGF-β1组白细胞介素6水平均低于对照组(P < 0.001)，而BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素6水平也显著低于对照组、BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.001)(图4C)。BMSC-Exos组和TGF-β1组白细胞介素1β水平均低于对照组(P < 0.01)。BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素1β水平低于BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.05)，更显著低于对照组(P < 0.001)(图4D)。

2.5 Western blot检测RAW264.7巨噬细胞极化的效果 各组均有白细胞介素10、CD163、白细胞介素6和白细胞介素1β蛋白表达(图5A)。其中，BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素10蛋白表达量比对照组、BMSC-Exos组和TGF-β1组显著增多(P < 0.001)(图5B)。
与对照组相比，BMSC-Exos组、TGF-β1组和BMSC-Exos+TGF-β1组CD163蛋白表达量均增多(P < 0.001)，且BMSC-Exos+TGF-β1组CD163蛋白表达量高于BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.001)(图5C)。BMSC-Exos组和TGF-β1组白细胞介素6蛋白表达量低于对照组(P < 0.001)，BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素6蛋白表达量分别低于对照组、BMSC-Exos组和TGF-β1组(P < 0.001)(图5D)。BMSC-Exos+TGF-β1组白细胞介素1β蛋白表达量显著低于对照组、BMSC-Exos组和TGF-β1组(图5E)。

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引言

骨关节炎是一种由多种因素引起的退行性关节疾病，主要病理特征包括关节软骨的进行性退化、软骨下骨重塑、骨赘形成以及滑膜炎症，这些病理变化不仅引发患者关节疼痛、僵硬和活动受限，更显著降低患者的生活质量[1]。随着人口老龄化进程的加速，骨关节炎的发病率逐年上升，目前已经成为全球范围内导致中老年人群残疾的主要原因之一[2]。近年来的研究显示，炎症反应在骨关节炎的发生和发展中起着至关重要的作用[3]。
在骨关节炎的炎症微环境中，免疫细胞尤其是巨噬细胞发挥了关键作用[4]。巨噬细胞是一种多功能的免疫细胞，能够通过分泌细胞因子、趋化因子和生长因子参与免疫调节、组织修复以及病理损伤[5]。根据活化状态的不同，巨噬细胞可以极化为M1型(促炎型)或M2型(抗炎型)。M1型巨噬细胞通过分泌促炎因子(如白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α)增强局部炎症反应，并加速关节软骨的降解[6]；而M2型巨噬细胞通过分泌抗炎因子(如白细胞介素10、CD163)和修复因子促进炎症的消退及组织修复[7]。因此，调控巨噬细胞的极化方向，促进M1型向M2型的转变，是改善骨关节炎微环境的重要策略[8]。
近年来，细胞外泌体在骨关节炎的治疗研究中受到了广泛关注[9]。外泌体是一种由细胞分泌的小型囊泡，富含蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等生物活性分子，能够通过与靶细胞相互作用调控靶细胞的功能[10]。骨髓间充质干细胞外泌体(bone marrow mesenchymal stem cell exosomes，BMSC-Exos)具有多种抗炎和组织修复作用[11-12]。研究表明，BMSC-Exos能够抑制M1型巨噬细胞分泌促炎因子，同时促进M2型巨噬细胞极化，从而减轻炎症反应，改善骨关节炎的病理进程[13-15]。此外，BMSC-Exos中的miRNA和蛋白质被认为是发挥作用的主要递质[16]。
通过调控NF-κB和STAT等炎症信号通路，BMSC-Exos能够显著降低关节滑膜和软骨中的炎症因子水平[17-19]。除了BMSC-Exos外，转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)也因免疫调节作用而成为骨关节炎治疗研究的热点之一。TGF-β1是一种多功能的细胞因子，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及炎症调控等生物学过程[20]。在骨关节炎相关研究中，TGF-β1能够促进M1型巨噬细胞向M2型极化，同时抑制促炎因子的释放，从而发挥抗炎和保护软骨的作用[21-23]。此外，TGF-β1还能够通过激活Smad信号通路，促进软骨细胞的增殖和基质合成，为骨关节炎的治疗提供了潜在的分子靶点[24-25]。
尽管BMSC-Exos和TGF-β1在促进巨噬细胞极化方面各自显示出了显著的疗效[26-28]，但关于两者联合应用的研究仍较为匮乏。已有研究显示，BMSC-Exos和TGF-β1可能通过协同作用显著增强M1型巨噬细胞向M2型极化的效率，从而更高效地改善炎症微环境[29-30]。因此，深入探讨BMSC-Exos与TGF-β1联合应用在巨噬细胞极化和骨关节炎治疗中的作用，对于进一步开发基于巨噬细胞调控的骨关节炎治疗策略具有重要意义。
基于上述背景，该研究旨在评估BMSC-Exos与TGF-β1联合应用对巨噬细胞极化的影响，并探讨二者在改善骨关节炎微环境中的潜在作用，为骨关节炎的治疗提供新的理论依据和实践参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验。
1.2 时间及地点 实验于2023年6月至2024年12月在解放军总医院第四医学中心骨科研究所完成。
1.3 材料 兔骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞去外泌体完全培养基购自美国赛业生物科技有限公司；TGF-β1购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京博奥森生物科技公司；高糖DMEM细胞培养基购自武汉博士德生物工程有限公司；胎牛血清购自上海逍鹏生物科技有限公司；RAW264.7巨噬细胞、RNA/蛋白提取试剂盒、SYBR Green Real-time PCR试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司；Trizol、反转录试剂盒购自美国
Thermo Scientific公司；外泌体提取试剂盒、β-actin蛋白marker、兔抗CD63单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、ECL化学发光试剂盒购自上海翌圣生物科技股份有限公司；ELISA试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；ELISA试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；抗白细胞介素10、抗CD163、抗白细胞介素6、抗白细胞介素1β购自HUABIO公司；β-actin购自ABCLonaL公司；抗兔二抗、抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSC-Exos的提取 将骨髓间充质干细胞从-80 ℃冰箱取出复苏，培养并传代至第3代，观察培养瓶中第3代骨髓间充质干细胞铺满瓶壁70%-80%时，更换培养基为骨髓间充质干细胞去外泌体完全培养基(含体积分数10%胎牛血清)，恒温培养箱孵育24 h，提取培养基上清15 mL，3 000×g离心10 min，向上清液中加入外泌体提取试剂，4 ℃冰箱中静置2 h，然后在4 ℃、10 000×g离心60 min，去除上清液，收集底部沉淀，1 mL PBS吹打底部沉淀，于4 ℃、12 000×g 离心2 min，吸取上清液，获得BMSC-Exos。
1.4.2 BMSC-Exos的透射电镜观察 将滤纸置于培养皿内，铜网置于滤纸上，取10 μL BMSC-Exos溶液滴于铜网上，室温孵育10 min，用无菌蒸馏水冲洗2次，吸水纸吸干多余液体，吸取2%醋酸双氧铀染液10 μL滴于铜网上染色10 min，用滤纸将染液吸干，将铜网放置在透射电镜(日立HT7700，日本)下观察。
1.4.3 BMSC-Exos的纳米颗粒跟踪分析 将BMSC-Exos用PBS稀释至1×107粒子/mL-1×109粒子/mL，采用激光光源照射纳米颗粒悬浮液，并对纳米颗粒的散射光进行检测，通过统计散射颗粒的数量来计算纳米颗粒浓度，即用粒子矩阵ZetaView PMX 110在405 nm发射光下测定外泌体浓度、大小及质量。
1.4.4 BMSC-Exos的BCA蛋白浓度检测 首先按照说明书配制蛋白标准品，并绘制标准曲线，然后对待测样品进行稀释处理，分别取1，2，4 µL样品加入96孔板中，用PBS补至每孔体积达到20 µL，每孔加入200 µL BCA工作液，将板置于37 ℃静置孵育30 min，孵育完成后，使用酶标仪(Thermo Multiskan FC型，美国)在570 nm波长处测定各孔的吸光度值。根据绘制的标准曲线，计算出BMSC-Exos蛋白的浓度，并记录实验结果。
1.4.5 BMSC-Exos的Western blot检测 将外泌体与裂解液按照1∶1比例混合后，在冰上裂解10 min，然后将样品置于离心机中，4 ℃、12 000×g离心5 min，取上清液，在其中加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，将混合液在100 ℃的沸水浴中加热5 min，随后在室温下冷却。冷却后，将β-actin蛋白marker和蛋白质样品上样至SDS-PAGE凝胶电泳仪电泳40 min，得到蛋白质样品条带胶，将胶上的蛋白条带转至PVDF膜上，将膜置于25 mL封闭缓冲液中室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次15 min。封闭后，将膜置于10 mL一抗CD63(1∶1 000)稀释缓冲液在4 ℃摇床上孵育过夜，TBST清洗膜3次以去除一抗残留，每次15 min，将膜置于10 mL HRP标记的二抗(1∶10 000)稀释缓冲液中，在摇床上室温孵育2 h，TBST洗涤3次，每次15 min，最后使用ECL化学发光试剂盒进行显影，使用β-actin蛋白条带作为内参，通过Western blot成像分析仪(Tanon 4800Multi，中国)进行成像分析。
1.4.6 免疫荧光实验检测BMSC-Exos在巨噬细胞内定位 向装有1 mL BMSC-Exos溶液的2 mL离心管中加入10 μL PKH-26试剂，搅拌机摇晃2 min，取出离心管，4 ℃、10 000×g离心60 min，去除上清液，收集底部沉淀，1 mL PBS吹打离心沉淀物，获得染色BMSC-Exos，加入高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)配制成染色BMSC-Exos高糖培养基。将巨噬细胞接种至6孔板中，加入高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)2.5 mL培养24 h，将培养基更换为染色BMSC-Exos高糖培养基培养24 h，去除培养基，PBS冲洗2次，加入鬼笔环肽试剂染色30 min，PBS冲洗2次，用细胞固定液常温固定30 min，PBS冲洗2次，滴入DAPI试剂染色10 min，PBS冲洗2次，最后用共聚焦显微镜(Lei，SP8 Gsted 3X，德国)观察。

1.4.7 RT-PCR检测BMSC-Exos联合TGF-β1对RAW264.7巨噬细胞极化的影响[31] 将RAW264.7巨噬细胞以5×105/孔密度接种于6孔板中，设置4组，每组样品设3个重复孔，使用常规高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养24 h，分别更换培养基为高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)、含100 μg/mL BMSC-Exos的高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)、含10 ng/mL TGF-β1的高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)、含100 μg/mL BMSC-Exos+10 ng/mL TGF-β1的高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清)，将6孔板放入37 ℃恒温培养箱中孵育24 h，采用Trizol法提取每孔RAW264.7巨噬细胞中的RNA，并通过分光光度计(KAIAO K5600，中国)测定RNA的纯度和浓度。使用反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录，按照试剂说明书以及预实验中确定的反应时间和温度进行RT-PCR反应。在95 ℃下预变性2 min后，进行40个循环反应：95 ℃变性15 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法分析待测基因的mRNA相对表达水平。实验至少重复3次并记录结果。引物序列见表1。

1.4.8 ELISA实验检测BMSC-Exos联合TGF-β1对RAW264.7巨噬细胞极化的影响[32] 分组与干预方法同1.4.7。将试剂盒中的原倍标准品按照稀释比例在EP管中进行稀释。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，在酶标包被板上空白孔内加入标准品50 μL，待测样品孔先加40 μL样品稀释液，再加待测样品10 μL，使用封板膜封板后37 ℃温育30 min，用蒸馏水30倍稀释浓缩洗涤液，揭掉封板膜，弃去液体，甩干后每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去液体，洗涤5次后拍干，向每孔加入酶标试剂50 μL (空白孔不加)，37 ℃温育30 min，弃去液体后甩干，每孔加满洗涤液静置30 s后弃去，重复5次后拍干，向每孔加50 μL终止液。以空白孔调零，450 nm波长下测量各孔的吸光度值，代入标准曲线计算结果。
1.4.9 Western blot检测BMSC-Exos联合TGF-β1对RAW264.7巨噬细胞极化的影响 分组与干预方法同1.4.7。按照 BCA 法蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，并绘制标准曲线，利用回归方程计算样品中的蛋白浓度。根据待测样品配制相应浓度的SDS-PAGE凝胶，而后加入聚丙烯酰胺凝胶孔中，转入电泳槽，80 V恒压电泳40 min，剥离聚丙烯酰胺凝胶，保留分离胶，置于PVDF膜上，并夹上滤纸和海绵，制备三明治结构，插入电转槽，加入电转液，200 mA恒流电转2 h，取出PVDF膜，TBST溶液洗涤3次后置于5%脱脂奶粉中，室温下封闭1 h。取出PVDF膜，TBST溶液洗涤3次，转入配置好的一抗[白细胞介素6(1∶1 000)；CD163(1∶500)；白细胞介素10(1∶1 000)；白细胞介素1β(1∶1 000)；β-actin (1∶10 000)]稀释缓冲液中，水平摇床上旋转摇晃，孵育过夜，TBST溶液洗涤3次，加入二抗(1∶5 000)溶液，室温孵育1.5 h，TBST溶液洗涤3次，沥干膜上洗涤液，将膜平铺在显影板上，滴加配好的ECL反应液，放入化学发光成像仪拍照。
1.5 主要观察指标 ①抗炎因子白细胞介素10和CD163的mRNA和蛋白表达水平；②促炎因子白细胞介素6和白细胞介素1β的mRNA和蛋白表达水平；③共聚焦显微镜观察BMSC-Exos在巨噬细胞内的分布情况；④细胞极化状态的变化。

1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计分析。对多组数据进行单因素方差分析(ANOVA)，并通过独立样本t检验进行两两组间比较。以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过解放军总医院专家审核。

讨论

骨关节炎作为一种由多因素引发的退行性疾病，其中炎症微环境在病理进程中起着至关重要的作用。近年来，巨噬细胞极化被广泛认为是调控骨关节炎炎症状态的核心机制之一。该研究以巨噬细胞极化为研究切入点，探讨了BMSC-Exos与TGF-β1的单独及联合作用，为骨关节炎的治疗提供了新的可能性。
巨噬细胞是免疫系统中的重要效应细胞，广泛参与免疫调节和炎症反应[33]。它们不仅能够通过吞噬作用清除病原体和细胞碎片，还能通过分泌多种细胞因子调控炎症微环境[34]。根据活化状态，巨噬细胞可分为M1型(经典活化型)和M2型(替代活化型)。M1型巨噬细胞通常在受到病原体或炎症刺激(如脂多糖或干扰素γ)后被激活，参与免疫防御和炎症反应的初期阶段[35]，释放白细胞介素6和白细胞介素1β等促炎因子，从而加剧炎症反应[36-37]；相反，M2型巨噬细胞在炎症后期或组织修复阶段活跃，通过分泌白细胞介素10和CD163等抗炎因子，抑制炎症并促进组织修复[38-39]。M1与M2型巨噬细胞的动态平衡对于维持炎症的适度反应和组织损伤的修复至关重要[40]。因此，调控巨噬细胞的极化方向被认为是改善炎症相关疾病，尤其是骨关节炎的重要治疗策略。
实验结果显示，与对照组相比，BMSC-Exos和TGF-β1的单独应用均显著提高了抗炎因子(白细胞介素10、CD163)的表达，同时抑制了促炎因子(白细胞介素6、白细胞介素1β)的表达。这一结果与已有文献报道一致，例如：PANG等[30]研究表明，BMSC-Exos可通过调控NF-κB信号通路有效降低炎症水平，TGF-β1通过激活Smad信号通路显著抑制促炎因子分泌。该研究进一步发现，当两者联合使用时，对M1型巨噬细胞向M2型极化的促进效果显著增强。这种作用结果可能归因于两者通过不同的信号通路调控炎症反应，从而在分子水平实现了对炎症的多重抑制。
BMSC-Exos与TGF-β1联合治疗的优越性为骨关节炎的精准治疗提供了新的可能性。一方面，外泌体因纳米级的颗粒特性和高效的靶向性，在药物递送系统中具有广阔的应用前景；另一方面，TGF-β1的免疫调控特性使它成为理想的抗炎治疗候选分子。该研究为开发基于巨噬细胞极化的联合疗法奠定了理论基础。然而，需注意的是，外泌体的大规模制备、TGF-β1的安全性及长期应用的不良反应仍需进一步评估[41-42]。
尽管该研究揭示了BMSC-Exos与TGF-β1联合应用在巨噬细胞极化中的效果更佳，但仍存在一定局限性。例如，具体的分子信号通路尚未明确，实验对象局限于体外研究，缺乏体内实验数据的支持。未来研究可重点探索两者协同作用的具体机制，并通过动物模型验证治疗效果，进一步推动基础研究向临床应用的转化。
该研究评估了BMSC-Exos与TGF-β1联合应用在巨噬细胞极化中的作用，并证实二者协同效果显著优于单独应用，为骨关节炎等炎症性疾病的治疗提供了新的研究思路。未来，随着对机制的深入解析和临床研究的推进，BMSC-Exos与TGF-β1的联合应用有望成为治疗骨关节炎的重要策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞外泌体联合转化生长因子β1对巨噬细胞的作用

Effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes combined with transforming growth factor beta 1 on macrophages

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