骨关节炎核心基因的生物信息学鉴定

doi:10.12307/2025.117

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物信息学：是综合多个学科技能知识的交叉学科，如生物学、应用数学、统计学及信息工程等。主要通过基因测序作为数据源，根据基因表达或者蛋白之间的相互关系，通过计算机开发不同的软件和数学多维度算法进行数据的统计，从而获得有用的生物数据。
加权基因共表达网络分析：是一种系统生物学分析的方法，主要用于分析微阵列或者基因表达之间的联系，首先根据基因表达进行网格化，然后根据不同基因节点的联系程度进行归类基因集模块化，并将特定的基因模块与临床相关性联系，寻求模块与临床最大的相关性，或者探索模块内与临床相关的核心基因。

摘要
背景：目前骨关节炎成为影响老年人生活质量的主要疾病，治疗效果欠佳，临床治疗措施主要集中在阻止疾病的进程，同时骨关节炎的发病机制尚不完全清楚。为了探索骨关节炎的主要发病机制和基因编码调控的相关机制，进行生物信息学分析。
目的：通过基因表达谱筛选出在骨关节炎中起主要作用的核心差异基因。
方法：从基因表达综合数据库(GEO)下载数据集：GSE114007、GSE117999和GSE129147，利用R软件筛选出GSE114007和GSE117999数据合集的差异基因，将差异基因进行加权基因共表达网络分析，选择和骨关节炎最相关的模块基因并进行蛋白互作分析，利用cytocape软件筛选出候选核心基因，随后将候选核心基因进行最小绝对收缩和选择算子回归(LASSO回归)和COX分析，鉴定出在骨关节炎中起关键作用的核心基因，利用外部数据集GSE129147验证核心基因的准确性。
结果与结论：①共鉴定出477个差异基因，加权基因共表达网络分析获得265个和骨关节炎相关的差异基因，共鉴定8个候选核心基因，LASSO回归分析最终获得了一个具有核心价值的差异基因ASPM并进行了外部验证；②提示通过生物信息学筛选出基因ASPM表达异常在骨关节炎中起到关键核心作用。

关键词: 骨关节炎, 差异表达基因, 核心差异基因, 生物信息学, LASSO回归分析

Abstract: BACKGROUND: At present, osteoarthritis has become a major disease affecting the quality of life of the elderly, and the therapeutic effect is poor, often focusing on preventing the disease process, and the pathogenesis of osteoarthritis is still not fully understood. Bioinformatics analysis was carried out to explore the main pathogenesis of osteoarthritis and related mechanisms of gene coding regulation.
OBJECTIVE: To screen core differential genes with a major role in osteoarthritis by gene expression profiling.
METHODS: Datasets were downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO): GSE114007, GSE117999, and GSE129147. Differential genes in the GSE114007 and GSE117999 data collections were screened using R software, performing differential genes to weighted gene co-expression network analysis. The module genes most relevant to osteoarthritis were selected to perform protein interaction analysis. Candidate core genes were selected using the cytocape software. The candidate core genes were subsequently subjected to least absolute shrinkage and selection operator regression and COX analysis to identify the core genes with a key role in osteoarthritis. The accuracy of the core genes was validated using an external dataset, GSE129147.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A total of 477 differential genes were identified, 265 differential genes associated with osteoarthritis were obtained by weighted gene co-expression network analysis, and 8 candidate core genes were identified. The least absolute shrinkage and selection operator regression analysis finally yielded a differential gene ASPM with core value that was externally validated. (2) It is concluded that abnormal gene ASPM expression screened by bioinformatics plays a key central role in osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, differentially expressed gene, core differentially expressed gene, bioinformatics, LASSO regression analysis

中图分类号:

朱雪坤, 刘恒, 冯晖, 高云龙, 文磊, 蔡筱松, 赵奔, 仲敏. 骨关节炎核心基因的生物信息学鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(3): 637-644.

Zhu Xuekun, Liu Heng, Feng Hui, Gao Yunlong, Wen Lei, Cai Xiaosong, Zhao Ben, Zhong Min. Identification of core genes of osteoarthritis by bioinformatics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(3): 637-644.

图/表（结果） 7

2.1 差异基因的筛选 数据合集包含28个正常软骨组织样本和30个骨关节炎软骨组织样本。根据条件设置P < 0.05，0.585<logFC或者logFC< -0.585，共筛选出477个差异基因，其中上调基因230个，下调基因247个(图1)。
2.2 加权基因共表达网络的构建和模块识别 为了进一步探索差异基因与骨关节炎的相关性，将差异基因与骨关节炎进行相关性分析。使用R软件WGCNA包pickSoftThreshold函自动数选取β最佳软阈值(图2A，B)，建立了一种高效的共表达模块基因，并将表达模式相似的基因聚类(图2C)，使用Pearson相关系数计算模块与骨关节炎之间的关联，并在热图中显示模块与疾病的相关性(图2D)，获得了差异基因谱中的3个模块，其中模块“MEturquoise”与骨关节炎最相关(r=0.62，P < 0.001)，此模块共聚集265个显著差异基因，并选择此模块进一步分析。

2.3 模块差异基因功能富集分析 为了更好地了解候选模块差异基因相关的生物过程和信号通路，利用公共DAVID数据库或者R软件进行了基因本体和KEGG分析。表1-3显示了富集模块差异基因在基因本体分析中生物学过程、细胞成分和分子功能的主要功能富集分析结果，结果显示差异基因在生物学过程中主要富集在RNA聚合酶Ⅱ的多项调控、细胞信号转导如核因子κB信号通路、MAPK信号通路的功能调控、炎症反应、细胞增殖和转录调控、细胞内蛋白质的运输、干细胞分化等多项生物学过程中，在细胞成分功能中富集有细胞外基质、Bcl-3/核因子κB2复合体、质膜的整体成分、细胞质等多项细胞成分发挥作用，在分子功能中富集有蛋白质结合、RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端序列特异性DNA结合、金属离子结合、细胞黏附分子结合等。而KEGG富集结果为神经活性配体-受体相互作用和一些氨基酸的代谢，而富集在FOXO信号通路上的P值> 0.05，差异并无统计学意义，见表4。

2.4 蛋白-蛋白互作网络的构建和候选核心基因的筛选 利用在线STRING数据库构建蛋白互作网络(图3A)，并使用cytoscape软件进行蛋白互作网络可视化，并利用 Cytohubba插件MCC算法鉴定前8个候选基因，分别为ASPM、ANLN、ECT2、TOP2A、CENPF、
EZH2、CASC5、CIT基因(图3B)。
2.5 核心基因的检验和验证 通过LASSO回归分析和lambda值分析(图4A，B)，在这些候选基因中筛选出差异基因ASPM与骨关节炎最为显著相关，随后对差异基因ASPM与骨关节炎相关性模型绘制ROC曲线图，结果显示GSE114007 ROC的曲线下面积值为0.967(图4C)，GSE114007 ROC的曲线下面积值为0.730(图4D)，并且外部数据集GSE129147验证了差异基因ASPM与骨关节炎显著相关的准确性，结果显示曲线下面积值为0.889(图4E)，从而得出差异基因ASPM表达与骨关节炎显著相关。

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引言

高发病率的骨关节炎影响患者的生活质量，并且治疗效果欠佳[1-3]。目前研究认为骨关节炎的发病诱因和多种因素有关，包括代谢性疾病、肥胖、年龄、炎症、过量或者超负荷关节运动以及关节不稳等[4]，最近也有研究表明骨关节炎也和性别、遗传或者关节的解剖结构相关[5]；无论哪种因素导致的骨关节炎，最终导致关节软骨退变，继发性骨质及滑膜增生[2]。而在这些病理变化中，软骨的病理变化在骨关节炎的进展中起到重要作用[6]。
软骨是覆盖于关节表面的无血管和神经的白色组织[7]，其重要作用是分散关节的承受力和缓冲关节冲击力以及减少关节之间的摩擦；而软骨中主要包含软骨细胞和细胞外基质；细胞外基质占软骨成分的90%以上，主要由蛋白多糖和胶原纤维构成，也是关节软骨分散应力的基础成分[8]。软骨细胞是目前鉴定出存在于软骨中唯一的细胞类型，软骨的退变首先是软骨微环境发生改变，而软骨细胞在维持软骨细胞外蛋白基质合成和代谢平衡性中起到重要的作用，从而促进维持软骨微环境的稳定性[9-10]。内环境的破坏导致软骨的病理变化[11]，而病理变化机制并完全不清楚；基因组学对分子特征的研究更加进一步推动了骨关节炎病理变化的研究[10]，高通量测序的快速发展加速了基因组学的认知，并且在疾病的分子诊断、预后的预测、靶向药物的治疗等方面取得了很好的前景[12-13]，同时高通量测序RNA转录谱的研究，已经揭示了类风湿关节炎的关键基因、基因功能和靶向基因治疗等多个方面[14-15]，这有助于早期识别关节炎的诊断与疗效以及辨别临床决策。
生物信息学是多学科交叉的学科，是多个学科知识的综合运用，从而探索疾病微环境中的蛋白与蛋白、基因与基因或者蛋白与基因之间的相互作用，分析出有利于疾病研究的核心基因，这在肿瘤中已经获得多项研究成果[16-17]。如能筛选出骨关节炎的关键基因，有助于提高骨关节炎的临床疗效[18]。为了探讨骨关节炎的分子机制，寻找可能的核心基因，此次实验通过从美国国立生物技术信息中心基因表达综合数据库中下载骨关节炎和正常软骨的基因表达相关的数据，并计算出差异表达的基因；随后将差异表达基因进行加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)，筛选出和骨关节炎最相关的差异表达基因模块，并根据这些模块中差异表达基因的功能和相互联系，分析出潜在的关键基因，并通过最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)回归和COX分析获得骨关节炎的核心基因。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计 骨关节炎核心基因的生物信息学鉴定实验，组间均数比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2022年3月在陆军第七十一集团军医院骨科完成。
1.3 方法
1.3.1 数据来源与处理首先从美国国立生物技术信息中心网站GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载骨关节炎和正常软骨组织的相关基因表达数据GSE114007、GSE117999和GSE129147数据集[19-20]。GSE114007数据集是基于GPL11154平台基因测序，包含18个正常软骨组织和20个骨关节炎软骨组织的基因表达数据。其次GSE117999数据集是基于 GPL20844平台基因测序，包含10个正常软骨组织和10个骨关节炎软骨组织的基因表达数据；最后GSE129147数据集基于 GPL15207平台基因测序，包含9个正常软骨组织和10个骨关节炎软骨组织的基因表达数据。首先通过perl软件将GSE114007和GSE117999两个数据集合并，为了减少两组数据集之间的批次效应和筛选差异基因的误差，通过R软件的normalize Between Arrays函数将合并后的数据进行归一化处理，同时使用R软件limma包分析正常样本和骨关节炎样本的差异表达基因，设置0.585<logFC或者logFC<-0.585为筛选差异的值域，P < 0.05为差异显著性，将差异表达基因予以火山图展现。
1.3.2 WGCNA共表达分析和模块识别 WGCNA是一种多维度分析生物学方法，越来越多地用于微阵列样本基因之间的关联模式分析[21-22]。此算法首先假定基因服从无尺度分布，依据基因在不同样品中的表达情况，计算任意2个基因间的相关关系从而定义基因共表达相关矩阵、基因之间的连接函数，并建立基因的系统聚类树，将高度相关的基因聚类构成模块，根据模块内核心基因的特性和样本的临床特性分析两者之间的相关性[23]。基于WGCNA计算方法，通过研究学者建立的R软件 WGCNA包分析出与骨关节炎高度相关的差异基因的模块。首先根据人的运行函数确定是否存在显著异常值并运用“good SampleGenes”函数检测数据的完整性，使用pickSoftThreshold R函数建立软阈值(β)，根据R语言运行的代码函数选择和验证最佳软阈值，将矩阵数据转化为邻接矩阵，然后进行聚类，用以找到基于拓扑重叠的模块。之后通过计算模块中的基因特征，并将相似特征基因的模块合并生成聚类图。随后基于样本临床特征、基因表达与模块特征基因，计算基因显著性和模块隶属度以评估模块与临床特征之间的关系，使用Heatmap R包绘制相关性热图，设置P < 0.05为差异显著性。
1.3.3 差异基因功能富集分析 David(http://david.ncifcrf.gov)是一个免费的公共在线生物信息数据库，用于分析基因生物功能分析，如基因本体分析，其主要包括基因的细胞成分、分子功能和生物学过程[24]。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是一个实用的数据库资源，探索基因富集信号通路和功能分析，可以通过R语言中的BioConductor包和ClusterProfiler包更简洁数据分析[25]；此次实验使用DAVID数据库和R语言的“ClusterProfiler”包分别进行与骨关节炎最相关模块的差异基因的基因本体功能和KEGG通路富集分析，设置P < 0.05为差异显著性。
1.3.4 蛋白互作网络建设与候选核心基因分析 STRING数据库(https://cn.string-db.org/)是用于分析已知蛋白或者预测蛋白相互作用的在线数据库；通过STRING数据库构建与骨关节炎最相关模块差异基因的蛋白互作网络，并用Cytoscape软件将STRING数据库运行后的数据可视化，通过Cytoscape的cytoHUbba插件探索出网络模块中候选的核心基因。
1.3.5 核心基因筛选与模型建立为了探索以上候选基因和骨关节炎的临床相关性，使用R软件Glmnet包进行候选的核心基因LASSO回归分析，筛选出与骨关节炎最显著相关的核心基因。绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，利用R中的pROC包计算ROC曲线的曲线下面积(曲线下面积值大于0.7认为有较好的准确性)，用以分析所得基因与骨关节炎的相关性，并通过其他基因数据集GSE129147进行所得基因的验证，用以提高所得关键基因与骨关节炎显著相关的准确率。
1.4 主要观察指标 通过R软件初步筛选具有统计学意义的差异基因，进一步进行加权网络分析，获得骨关节炎相关的差异基因，并先后进行蛋白互作网络分析和LASSO回归分析，同时满足两种运算分析的相关基因认为是骨关节炎的关键基因。
1.5 统计学分析 此次实验数据处理和绘图采用perl软件R软件(4.1.2版本)，利用在线STRING数据库构建蛋白互作网络，并使用cytoscape软件进行蛋白互作网络可视化；计量资料采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

讨论

骨关节炎是常见的临床慢性疼痛疾病，随着人类寿命的延长，骨关节炎成为影响老人生活质量的主要疾病[24]。既往人们认为骨关节炎主要与肥胖、年龄、过度运动或者创伤有关[25]，然而具体发病机制尚不清楚，分析骨关节炎的潜在发病机制更有利于疾病的诊断和治疗[26]。随着计算机技术和基因测序技术的快速发展，加快了基因组学的发展，可以更好地定义疾病生物学，同时更有利于探索许多疾病的治疗靶点[27]。
李华安博士于1978年提出生物信息学后，人们逐渐意识到生物信息学的重要性，同时基因二代测序的成熟加速了生物信息学的研究[28]。数据挖掘可以在基因测序大数据中二次开发，筛选出有意义的信息，探索疾病微环境改变机制[29]。此外，大数据的分析与实验相结合推动了疾病的科学研究[30]。计算机的多项软件开发为生物信息学的研究提供了很大的帮助，如perl和R语言等多项软件或者代码的开发和运用[31]。WGCNA为通过计算机应用的加权相关网络分析的计算方法[23]，可用于聚集高度相关基因的模块，并且将模块和临床特征相关联，用于更好地探索基因与临床的相关性。此次实验为了提高差异基因的显著性并得到更可靠的实验结果，在2个数据集合并后的数据合集中筛选正常组和疾病组之间的差异表达基因，为了提高差异基因的显著性，设置差异值在1.5倍以上(|logFC|> 0.585，P < 0.05)，随后将显著差异基因用于WGCNA加权基因共表达网络分析，聚类出和骨关节炎显著相关的模块，并将显著模块的差异基因用于基因功能分析，从基因本体富集结果可以得出，显著模块的差异基因主要富集在RNA聚合酶Ⅱ的多项调控、细胞的信号转导如核因子κB信号通路、MAPK信号通路的功能调控、炎症反应、细胞增殖和转录调控、细胞内蛋白质的运输、干细胞分化、细胞外基质、Bcl3/核因子κB2复合体、质膜的整体成分、细胞质、金属离子结合、细胞黏附分子结合等多项功能上，在这些功能中RNA聚合酶Ⅱ、细胞增殖和转录调控、细胞内蛋白质的运输、干细胞分化等影响软骨细胞的代谢作
用[32]，RNA聚合酶通过调控DNA的转录来影响细胞凋亡和细胞增
殖[33-34]，而炎症反应是骨关节炎软骨细胞最典型的表现，过多的炎症反应影响软骨细胞的增殖代谢；同时细胞内蛋白质的运输、干细胞分化也调控着软骨细胞的正常代谢。细胞外基质是软骨的主要组成部分，其纤维结构可增加软骨的弹性，可以分散软骨的机械压力和瞬间扭矩力，从而避免软骨的损伤。而核因子κB信号通路、MAPK信号通路和Wnt信号通路在骨关节炎的骨骼、软骨和滑膜组织代谢中发挥直接作用[35-37]，多项研究显示通过抑制核因子κB信号通过可以改变骨关节炎的炎症反应并降低炎症因子对软骨细胞的影响，从而保护软骨细胞[38-39]。MAPK信号通路可协调核因子κB信号通路的活性，从而影响骨关节炎炎症的表达[40]，同时MAPK家族相关基因的过表达可能促进了骨关节炎的炎症进展[41]。Wnt信号通路可以通过自身wnt家族的相关蛋白影响着骨关节炎的进展，过表达的Wnt10A可加速细胞的凋亡[41]，同时Wnt5Bh和Wnt5A在许多疾病中影响细胞的分化、增殖、迁移和凋亡[42]。虽然在KEGG分析中能富集到FOXO信号通路，但并无统计学意义，FOXO信号通路在骨关节炎中鲜有报道，而FOXO信号通路可以通过细胞磷酸化影响骨骼肌的萎缩[43]。虽然FOXO信号通路在此次分析中无显著的表现，这有可能和聚集较少的差异基因有关。
细胞中大多数细胞功能是通过由蛋白质-蛋白质相互作用介导的，如细胞信号转导、细胞增殖和转录调控、细胞内蛋白质的运输、干细胞分化等功能[44]。蛋白互作网络是通过已经验证的蛋白与蛋白之间的作用或者临近节点的相互影响，将已知蛋白的相互作用可视化，并且可视化的网络节点代表蛋白与蛋白或者蛋白与基因之间的相互联系，并且根据网络相互联系程度、聚集系数和介数等多维数据分析筛选出主要价值节点的蛋白或者基因[45-46]。而STRING公共数据库为蛋白互作网络提供了方便的平台，免费供研究员使用[47-48]。作者应用STRING数据库筛选出8个潜在的核心基因，为使此次实验更加准确，使用LASSO回归和COX分析进一步筛选更可靠的与疾病相关的核心基因[48]。LASSO 回归是最小绝对收缩和选择算子回归的简称，是一种同时用于特征选择和正则化的方法，以提高统计模型的准确性和正则化，适用于高维数、强相关性、小样本的生存数据[49-50]。此次实验通过蛋白互作网络探索出8个候选的核心基因，随后将8个基因用于LASSO回归分析，寻求最佳的核心基因，并用ROC曲线探索最佳核心基因ASPM区分正常患者和骨关节炎患者的准确性，一般曲线下面积值大于0.7认为有较好的准确性[51]，此次实验无论是实验组还是外部数据集验证组，ASPM基因的曲线下面积值均大于0.7，提示具有较好的准确性。
人们通常认为只有症状性骨关节炎才具有临床相关性，然而，考虑关节组织代谢生物标志物的基因组学疾病分类系统使得超越主要基于体征和症状的诊断成为可能，并提供了在解剖或临床症状异常之前识别以分子紊乱为特征的疾病阶段，使得骨关节炎可能更容易逆转，或至少减缓以限制病理后遗症。此次研究通过信息生物学鉴定出骨关节的核心基因ASPM，此基因是人类和黑果蝇同源的基因，并且已被证明在多个胎儿组织和几乎所有转化的人类细胞系中表达，并且ASPM基因影响纺锤体的有丝分
裂[50，52]；ASPM与Cdk2/Cyclin E复合物之间的相互作用通过调节其泛素化、磷酸化和定位到细胞核中来调节细胞周期蛋白活性[50]；另外，有研究报道ASPM通过运动驱动的运输或微管拉扯进行定位，从而在调节细胞周期过程中起到重要作用[53]；ASPM基因的突变可引起常染色体隐性的原发性小头畸形的疾病[54]，ASPM基因共有477氨基酸和288外显子组成，通过调控细胞的有丝分裂从而影响细胞增殖等细胞功能。目前ASPM基因的异常表达也在多种肿瘤中报道，和多种肿瘤的预后相关，在肝癌中ASPM基因表达影响患者的预后[54]，在肺腺癌中ASPM的基因表达是临床预后的独立风险因素[55]，而ASPM基因在骨关节炎中的异常表达鲜有报道，这为研究骨关节炎的发病机制打开了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程