2.1   实验动物数量分析   42只雌性Wistar大鼠随机分为假手术组和脊髓损伤组，每组21只，均进入结果分析。
2.2   大鼠脊髓损伤模型构建成功   脊髓打击后，出现双后肢抽搐、摆尾，脊髓打击区域出现血肿，大鼠苏醒后双后肢自主运动功能消失。脊髓损伤后7 d，苏木精-伊红染色发现脊髓损伤组大鼠脊髓损伤部位出现大量空洞和组织缺失，脊髓空洞面积与假手术组比较有显著差异；脊髓损伤后即刻大鼠运动功能完全缺失，随着时间的推移，脊髓损伤组大鼠运动功能逐渐部分恢复，脊髓损伤后42 d期间，BBB评分与假手术组比较有显著差异，见图1。



2.3   脊髓损伤后circ0005512的表达增加   为了研究circRNA在脊髓损伤过程中的调控作用，使用高通量测序检测脊髓损伤后脊髓组织中circRNA表达谱的变化。火山图表明脊髓损伤组和假手术组之间circRNA表达有显著差异。差异基因表达分析显示脊髓损伤后有128个下调和142个上调的circRNAs，见图2A。脊髓损伤后7 d，脊髓损伤组织circ0005512表达显著上调，见图2B。细胞实验中，脂多糖处理后小胶质细胞系HAPI细胞中circ0005512的表达也显著上调，见图2C。circ0005512可能在脊髓损伤过程中发挥调控作用。



2.4   脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞焦亡在脊髓损伤的病理生理过程中起重要作用   为了确定circ0005512的上调是否会影响脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞的焦亡，对脊髓损伤组织进行免疫荧光染色，细胞焦亡标志物NLRP3和小胶质细胞/巨噬细胞标志物Iba1进行共染。与假手术组相比，在脊髓损伤后7 d脊髓损伤组小胶质细胞/巨噬细胞的双染荧光信号强度显著增加，见图3。



2.5   脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞发生焦亡   为了进一步确定脊髓损伤后脊髓组织中小胶质细胞/巨噬细胞是否发生焦亡，脊髓损伤后7 d，Western blot检测脊髓组织中焦亡标志基因(NLRP3、GSDMD和Caspase-1)的表达水平。与假手术组相比，焦亡标志基因的表达在脊髓损伤组中明显增加，见图4A。同样，ELISA检测显示脊髓组织中与焦亡相关的促炎细胞因子白细胞介素1β和白细胞介素18水平增加，见图4B。这些结果表明脊髓损伤后脊髓组织中的小胶质细胞/巨噬细胞发生了焦亡。



2.6   体外脂多糖作用的HAPI细胞发生焦亡   脂多糖处理HAPI细胞后，细胞形态学观察显示细胞明显膨胀并变圆，见图5。Real-time PCR结果显示，与未经脂多糖处理组相比，脂多糖处理的HAPI细胞中焦亡相关标志物NLRP3、GSDMD和Caspase-1的mRNA水平显著增加，见图6A。此外，Western blot实验结果显示与未经脂多糖处理组相比，脂多糖处理的HAPI细胞中NLRP3、GSDMD和Caspase-1蛋白水平也明显上调，见图6B。







2.7   circ0005512的基因沉默降低了小胶质细胞/巨噬细胞的焦亡   为了确定circ0005512在小胶质细胞/巨噬细胞焦亡中的调控作用，将脂多糖处理的HAPI细胞转染circ0005512-siRNA。circ0005512-siRNA处理减弱了脂多糖诱导的细胞焦亡，表现为细胞焦亡相关基因NLRP3表达降低，见图7。

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脊髓损伤是一种毁灭性的神经系统疾病，由于其致病的突发性与严重性，导致致死率和致残率极高，给患者带来严重的精神压力和沉重的经济负担[1-2]。脊髓损伤根据其病理特点分为2个阶段，包括原发性损伤和继发性损伤[3]，原发性损伤是创伤时机械力或压力对神经细胞或胶质细胞本身造成的一种损伤，此损伤是不可逆的，继发性损伤是继原发性损伤后一系列的细胞反应 [4]。继发性损伤不仅仅局限于损伤局部，主要以大量炎症细胞介导的炎症反应为主体，导致各种细胞功能改变，加重了残存神经细胞的死亡，而慢性炎症会严重限制脊髓损伤后的功能恢复[5]。细胞焦亡属于细胞炎症性坏死的一种，是由多种病原体或非感染因素刺激导致的一种固有免疫反应，主要通过炎症小体引起Caspase-1的自切割激活，Caspase-1激活后可切去白细胞介素1β和白细胞介素18的信号肽使其成熟，并通过消皮素D(Gasdermin D，GSDMD)孔道释放至胞外[6]。NLRP3炎性小体由NLRP3支架蛋白、凋亡相关斑点样蛋白和Caspase-1组成，其激活在细胞焦亡中起重要作用[7-8]。已有研究表明，脊髓损伤后的细胞焦亡阻碍了神经功能的恢复，细胞焦亡通路和炎症小体有可能成为脊髓损伤治疗的靶标[9-10]。神经炎症是由免疫细胞调节的，中枢神经系统的常驻免疫细胞——小胶质细胞/巨噬细胞在神经性细胞焦亡过程中起关键作用[11-12]，因此了解脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的分子机制，对于开发新的脊髓损伤治疗方法非常重要。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类不同于线性RNA的特殊的非编码RNA分子，来源于基因的外显子或内含子区域，是近年来在RNA分子生物学领域冉冉升起的一颗新星，通过3′端和5′端反向剪接形成共价键[13-14]。随着先进的测序技术和生物信息学策略的发展，circRNA在病理生理过程中的表达变化已经在多种疾病中被发现[15-16]，已有研究表明其参与中枢神经系统疾病的发生发展过程[17-18]。那么circRNA是否通过调控小胶质细胞/巨噬细胞焦亡参与脊髓损伤的病理生理过程呢？该研究使用RNA测序(RNA-sequencing)进行筛选，使用Real-time PCR进行验证，发现脊髓损伤后circ0005512表达显著上调，免疫荧光、Western blot、Real-
time PCR、ELISA等方法证实脊髓损伤后小胶质细胞发生焦亡，旨在揭示circ0005512在脊髓损伤后调节小胶质细胞/巨噬细胞焦亡中的功能和作用机制，以确定它是否可能成为未来治疗脊髓损伤的新靶点。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   随机分组动物实验和细胞实验，组间比较使用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。
1.2   时间及地点   实验于2022年1月至2023年7月在首都医科大学附属北京潞河医院中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验主要细胞、试剂、器械   HAPI细胞系(RRID：CVCL_0F62)来源于大鼠的小胶质细胞，购自上海鸿顺生物科技公司(中国上海)。白细胞介素1β和白细胞介素18 ELISA试剂盒(中国武汉华美公司)；兔抗鼠的Iba1抗体(日本Wako公司)；山羊抗兔NLRP3、Caspase-1、GSDMD抗体(美国Abcam公司)；重组人的GAPDH抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；偶联Alexa Fluor山羊抗兔的二抗和偶联Alexa Fluor山羊抗鼠的二抗(美国Invitrogen公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗和山羊血清(中国北京中杉金桥生物技术有限公司)；DAPI、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和苏木精-伊红染色试剂盒(中国上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(美国GIBCO公司)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；青霉素-链霉素双抗(美国Thermo Fisher公司)；戊巴比妥钠(美国Merk公司)；脂多糖(美国Sigma公司)；RNAiMAX试剂(美国Thermo Fisher公司)；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(瑞士罗氏公司)；蛋白浓度检测试剂盒(中国上海碧云天公司)；脊髓损伤第3代打击器(美国新泽西州立罗格斯大学)；冰冻切片机(德国徕卡公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；激光共聚焦显微镜(日本尼康公司)；酶标仪(美国Thermo Fisher公司)。
1.3.2   实验动物   成年雌性Wistar大鼠42只，6-8周龄，体质量(220±20) g，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，许可证号SCXK (京) 2021-0011。将大鼠置于恒定环境温度(24 ℃)和湿度(50%)下，光照和黑暗循环12 h，给予必要的水和食物。所有动物实验均经首都医科大学实验伦理委员会批准(批准号：AEEI-2023-005)。
将42只大鼠采用SPSS 23.0产生的随机序列随机分成2 组：假手术组(n=21)和脊髓损伤组(n=21)。两组动物行假手术和脊髓损伤手术后，进行circRNA高通量测序实验(n=3)，苏木精-伊红染色和免疫荧光实验(n=6)，BBB评分(n=6)，Western blot、Real-time PCR和ELISA实验(n=6)。
1.4   实验方法
1.4.1   细胞培养和体外炎症小胶质细胞模型构建   HAPI细胞系在DMEM完全培养基(DMEM基础培养基+体积分数10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素)中，放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱培养。培养24 h后，实验组加入脂多糖(1 000 ng/mL，PBS溶液配置)作用24 h，对照组使用和脂多糖等量体积的PBS溶液作用24 h。实验独立重复至少3次。

1.4.2   大鼠脊髓损伤模型的制备   大鼠脊髓损伤手术按照作者之前的研究进行[17-18]。使用1.5%-2%的异氟烷和氧气麻醉动物，剪开背部手术部位并用碘液消毒，中线进行切口暴露出T10椎板，随后切除T10椎板，清晰地暴露出脊髓。将直径为3 mm的冲击器(10 g)从25 mm的高度迅速投放到脊髓背表面，造成大鼠脊髓冲击损伤。然后用无菌缝合线缝合切口，并用电热毯包裹大鼠使其恢复知觉，术后连续7 d每天排尿2次。假手术组只是切开椎板，不进行脊髓打击。

1.4.3   组织采集   大鼠行假手术和脊髓损伤手术后7 d，采集损伤部位脊髓组织。对于生物化学和分子生物学实验，使用3%戊巴比妥钠以40 mg/kg的剂量通过腹腔注射诱导大鼠深度麻醉，随后灌入生理盐水，待灌洗完毕，取以损伤部位为中心长约1 cm的脊髓组织，迅速冷冻在液氮中。对于免疫组织化学实验和免疫荧光实验，大鼠同样使用戊巴比妥钠进行麻醉，然后用生理盐水溶液灌洗，随后用40 g/L多聚甲醛溶液进行固定，取出脊髓组织样本后，置于40 g/L多聚甲醛中，在4 ℃下保存[19]。
1.4.4   高通量测序及差异表达circRNA筛选   随机取假手术组和脊髓损伤组大鼠各3只，脊髓组织研磨成浆液，采用TRizol 法从脊髓组织中提取RNA，分析样本的纯度和完整性，检测合格后进行文库构建和测序分析，此过程由北京安诺优达基因科技公司进行。按照试剂盒说明书使用NEBNext® Ultra™Directional RNA文库试剂盒构建测序文库。构建好的文库用Agilent2100 Bioanalyzer进行质量检测。在Illumina测序仪(HiSeqTM2500)上进行测序。使用CIRI(circRNA identifier)辨别和定量circRNA，使用DEGseq (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DEGseq.html) 和DESeq(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html)来进行假手术组和脊髓损伤组的差异表达分析。根据差异表达倍数> 2和P ≤ 0.05 的标准来辨别差异表达的circRNA，然后根据circRNA的差异表达绘制火山图。
1.4.5   运动功能评估   造模后第1，7，14，21，28，35，42天，根据文献进行功能学BBB评分[20]，使用双人双盲法进行评估，由对实验分组不知情的人完成，每人在不受干扰的情况下观察两组大鼠下肢的活动情况，每只大鼠每次的观察时间在5 min以上。
1.4.6   苏木精-伊红染色和免疫荧光实验   按照作者之前的方法进行实验[19，21]。将脊髓组织浸泡在40 g/L多聚甲醛溶液中，用30%蔗糖溶液脱水处理，随后使用冰冻切片机制备冰冻切片，切片厚20 μm，按照厂家说明书进行苏木精-伊红染色，使用共聚焦显微镜拍摄明场图像，由没有进行分组操作的实验人员使用Image J软件(V.1.8.0.112)测量空洞面积。在免疫荧光实验中，切片孵育NLRP3和Iba1抗体，然后用磷酸盐缓冲液洗涤切片，并与山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG孵育，之后用含Tween20的磷酸盐缓冲溶液洗涤切片，用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育1 min，再次用磷酸盐缓冲液洗涤，最后盖上载玻片，共聚焦显微镜拍摄图像。使用Image J软件对3个随机选择的区域进行细胞计数。每个切片重复分析3次。
1.4.7   Western blot 检测   在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中提取脊髓组织和HAPI细胞的蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，然后转移到PVDF膜上，用TBST稀释的5%奶粉进行封闭，加入NLRP3、Caspase-1、GAPDH和GSDMD一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，洗涤后加入二抗(1∶5 000)，24 ℃孵育1 h。所有蛋白条带通过增强型化学发光检测系统进行检测。GAPDH作为管家基因，使用Image J测量每条带的相对灰度值。

1.4.8   Real-time PCR检测   采用TRizol 法从HAPI细胞中提取总RNA，然后将1 μg总RNA合成cDNA。在定量PCR系统ABI7500中进行实时PCR反应，条件如下：95 ℃保持5 min，然后进行40个周期，每个周期包括95 ℃保持15 s和60 ℃保持30 s。目标基因的表达水平与管家基因β-actin的表达水平进行归一化处理。使用2‐ΔΔCT方法计算目标基因的相对表达水平[22]。Circ0005512、β-actin、NLRP3、GSDMD和Caspase-1的引物列于表1中。

1.4.9   ELISA检测   脊髓样本在预冷的RIPA裂解缓冲液中裂解，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，去除不溶物。使用Bradford试剂盒检测蛋白质浓度。根据厂家说明书，使用ELISA方法测量细胞因子白细胞介素18和白细胞介素1β水平，每个蛋白检测进行6次重复实验。
1.4.10   使用合成的circ0005512-siRNA进行体外转染   Circ0005512-siRNA由吉玛基因合成。将HAPI细胞以1.5×105个/孔的密度在含有1.5 mL无抗生素的标准培养基的6孔板中培养，直到达到40%-60%融合。然后根据厂家的方案，在每个孔中加入80 nmol/L的circ0005512-Con或circ0005512-siRNA，并加入4 μL RNAiMAX试剂。转染后24 h，使用脂多糖(1 000 ng/mL)作用24 h，收集细胞，检测细胞焦亡标志物NLRP3的表达。
   circ0005512表达的沉默序列：sense：5’-GCA UCC CAA CUC AAU GUC ATT-3’，antisense：5’ -UGA CAU UGA GUU GGG AUG CTT-3’ ；阴性对照序列：sense：5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’，antisense：5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’。
1.5   主要观察指标   ①大鼠脊髓组织病理形态、BBB行为学评分；②脊髓组织的差异circRNA筛选结果；③验证circ0005512在脊髓组织和小胶质细胞模型中的表达；④免疫荧光检测NLRP3在脊髓组织中的表达；⑤Western blot检测NLRP3、GSDMD、Caspase-1在脊髓组织和HAPI细胞中的表达；⑥ELISA检测白细胞介素1β和白细胞介素18在脊髓组织中的表达；⑦Real-time PCR检测NLRP3、GSDMD和Caspase-1在HAPI细胞模型中的表达；⑧circ0005512-siRNA转染实验检测circ0005512对NLRP3表达的影响。
1.6   统计学分析   使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。动物实验每组至少包括6只动物，在体外研究中每组至少重复3次以满足统计学需求。评估者对动物或药物处理条件是不知情的。
    两组间差异采用双尾 t 检验，多组间差异采用单因素方差分析(ANOVA)。BBB评分采用双因素方差分析。统计显著性差异设定为P < 0.05。数据以均值±标准误表示。文章统计学方法已经首都医科大学附属北京潞河医院生物统计专家审核。

脊髓损伤作为一种严重的神经系统疾病，严重影响了人们的生存质量，但是目前还没有有效的治疗方法[23-24]。作者所在团队之前的研究表明，褪黑素和利鲁唑通过调节小胶质细胞/巨噬细胞从M1向M2的极化状态，可以促进脊髓损伤后运动功能恢复[19，21]。因此该研究主要关注脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞的调节作用。有很多证据表明中枢神经系统疾病中小胶质细胞/巨噬细胞发生焦亡[25-28]。课题组也发现利鲁唑通过抑制小胶质细胞中NLRP3炎性小体的活化改善了脊髓损伤大鼠的运动功能[29]。目前的研究表明脊髓损伤后7 d检测到了明显的脊髓空洞，后肢运动功能有明显障碍。Western blot实验检测发现脊髓组织中焦亡相关的标志物(NLRP3、GSDMD和Caspase-1)明显上调，ELISA实验检测发现与焦亡相关的炎症因子白细胞介素18和白细胞介素1β也明显上调。双免疫荧光染色实验也证明小胶质细胞/巨噬细胞中焦亡标志物NLRP3的荧光信号明显增强。另外，在脂多糖诱导的小胶质细胞/巨噬细胞的体外模型中，Real-time PCR和Western blot实验检测也证实细胞焦亡标志物(NLRP3、GSDMD、Caspase-1)明显上调。总之，该研究在体内和体外均证实脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞发生了焦亡。
对脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的机制进一步进行了探索。最近的研究证据表明，circRNA在许多神经系统疾病的发生和进展中起重要的调控作用[30-32]。已有研究发现circDYM可以改善小鼠的抑郁行为，暗示其在情绪调节方面具有潜在的治疗效果[33]。CircRNASCMH1参与了缺血性脑卒中的病理生理过程，在该疾病中具有重要的生物学作用[34]。另有研究显示circIgfbp2通过靶向创伤性脑损伤后线粒体功能障碍和氧化应激诱导的突触功能障碍，影响了神经可塑性，并与创伤性脑损伤的焦虑情绪有关[18]。另外，脊髓损伤后circRNA的异常表达与其病理生理过程相关。已有研究表明脊髓损伤后circ006573高表达，抑制其表达可以改善脊髓损伤大鼠的运动功能，而且脊髓组织中CD31、CD34和VEGF-A的表达显著升高，表明circ006573可能参与了脊髓损伤后的血管再生和功能恢复[35]。另有研究表明circPrkcsh通过JNK/p38-MAPK信号通路促进小胶质细胞向M1极化[36]。CHEN等[37]的研究则发现circPrkcsh可抑制脊髓损伤后的炎症反应。就目前的研究而言，circRNA对脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的调节还有待深入研究。该研究结果显示，脊髓损伤后的第7天，circRNA表达谱呈现显著变化。经过Real-time PCR实验验证，体内脊髓损伤区域以及体外脂多糖处理的HAPI细胞模型中circ0005512的表达明显上调。为了确定circ0005512是否可以调节小胶质细胞/巨噬细胞的焦亡，在脂多糖处理过的HAPI细胞中下调circ0005512的表达，结果显示与焦亡相关的重要标志物NLRP3表达显著下调，说明circ0005512会促进脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞的焦亡与脊髓损伤的病理生理过程。Circ0005512是否通过影响细胞的其他通路和生理功能而促进脊髓损伤病理生理进程，例如是否会影响小胶质细胞/巨噬细胞的极化状态，这是后面还要进行深入研究的内容。另外，高通量测序还筛选到了其他的差异表达circRNA，这些差异的circRNA会不会对细胞焦亡有调控作用，另外是否与circ0005512有协同作用，共同调控脊髓损伤的病理生理过程，这都有待于进一步进行深入探讨。
综上所述，该研究发现脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞发生了焦亡，同时circ0005512表达上调。Circ0005512通过促进脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞焦亡参与脊髓损伤的病理生理过程，circ0005512可能是脊髓损伤治疗的新靶点，但其作用机制还有待进一步深入研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

CircRNA：环状RNA，是一种不同于线性RNA的非编码RNA，分子首尾相连形成环状结构，正由于这一特性，使其更好地抵御核酸内切酶的切割，半衰期更长，更稳定，更适合作为疾病的标志物，目前已发现circRNA在多种疾病中发挥作用。
细胞焦亡：属于细胞炎症性坏死的一种，是由多种病原体或非感染因素刺激导致的一种固有免疫反应。研究表明，细胞焦亡广泛发生于中枢神经系统疾病，可影响疾病的发生发展过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脊髓损伤由于其致病的突发性与严重性，导致其致死率和致残率极高。慢性炎症是导致继发性脊髓损伤的重要因素。细胞焦亡是细胞炎症性坏死的一种，而小胶质细胞/巨噬细胞在细胞焦亡中起着重要作用。本研究构建大鼠脊髓损伤模型和小胶质细胞炎症模型，均发现脊髓损伤后细胞焦亡标志物明显上调。同时由于circRNA在多种神经系统疾病中发挥重要作用，本文对脊髓损伤后脊髓组织中的circRNA进行了二代测序，发现circ0005512表达上调，敲低其表达后细胞焦亡标志物表达下调，因此circ0005512有可能成为脊髓损伤治疗的靶标。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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