非诺贝特干预超氧化物歧化酶2转基因C57BL/6J小鼠的神经保护机制

doi:10.12307/2024.454

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (28): 4547-4552.doi: 10.12307/2024.454

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非诺贝特干预超氧化物歧化酶2转基因C57BL/6J小鼠的神经保护机制

马江磊1，张慧杰2，张晨芳3，杨锡彤1，4，程建杰1，王光明1，4

1大理大学临床医学院，云南省大理白族自治州 671000；烟台毓璜顶医院，2产科，3神经内科，山东省烟台市 264000；4大理大学第一附属医院基因检测中心，云南省大理白族自治州 671000

收稿日期:2023-07-24 接受日期:2023-08-18 出版日期:2024-10-08 发布日期:2023-11-27
通讯作者: 王光明，博士，教授，博士生导师，大理大学临床医学院，云南省大理白族自治州 671000；大理大学第一附属医院基因检测中心，云南省大理白族自治州 671000
作者简介:马江磊，男，1989年生，山东省青岛市人，汉族，大理大学在读硕士，主治医师，主要从事分子诊断的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82160244)，项目负责人：王光明；云南省地方高校联合专项项目(202001BA070001-156)，项目负责人：程建杰；云南省卫计委医学学科带头人项目(D-2017057)，项目负责人：王光明；云南省教育厅科学研究基金项目(2023Y0989)，项目负责人：马江磊；大理大学第一附属医院重点建设项目(大附院发(2021)34号)，项目负责人：王光明

Neuroprotective mechanism by which fenofibrate regulates superoxide dismutase 2 expression in transgenic C57BL/6J mice

Ma Jianglei1, Zhang Huijie2, Zhang Chenfang3, Yang Xitong1, 4, Cheng Jianjie1, Wang Guangming1, 4

1School of Clinical Medicine, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China; 2Department of Obstetrics, 3Department of Neurology, The Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University, Yantai 264000, Shandong Province, China; 4Center of Genetic Testing, The First Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China

Received:2023-07-24 Accepted:2023-08-18 Online:2024-10-08 Published:2023-11-27
Contact: Wang Guangming, MD, Professor, Doctoral supervisor, School of Clinical Medicine, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China; Center of Genetic Testing, The First Affiliated Hospital of Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
About author:Ma Jianglei, Master candidate, Attending physician, School of Clinical Medicine, Dali University, Dali 671000, Yunnan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82160244 (to WGM); Joint Project of Local Colleges and Universities in Yunnan Province, No. 202001BA070001-156 (to CJJ); Medical Discipline Leader Program of Yunnan Provincial Health Planning Commission, No. D-2017057 (to WGM); Yunnan Provincial Department of Education Science Research Fund Project, No. 2023Y0989 (to MJL); Key Construction Disciplines of the First Affiliated Hospital of Dali University, No. (2021)34 (to WGM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脑缺血再灌注损伤：脑内血管阻塞后，由于脑血流突然减少、氧气和能量供应中断，及时应用血管活性药物或进行溶栓、取栓等血运重建治疗后血液重新灌流，导致神经损伤或一系列分子反应，氧化损伤是重要因素之一。
氧化应激损伤：脑缺血再灌注等外界刺激时，机体产生过多的活性氧，当内在的抗氧化潜能不足以中和活性氧，无法保持内源性氧化还原平衡时，就会发生氧化应激，活性氧可通过脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤导致细胞毒性，对组织的结构和功能产生有害影响。

背景：氧化损伤被认为是脑缺血再灌注损伤的重要因素之一，超氧化物歧化酶2是关键的线粒体抗氧化分子，非诺贝特可通过激活的PPARα调节超氧化物歧化酶2的表达。

目的：验证非诺贝特治疗脑缺血再灌注损伤的机制是依赖超氧化物歧化酶2的表达。
方法：用TALENs系统构建超氧化物歧化酶2转基因C57BL/6J小鼠，通过PCR和DNA测序技术鉴定转基因小鼠进行基因分型，免疫印迹法检测超氧化物歧化酶2蛋白在转基因小鼠体内表达情况。将野生型和超氧化物歧化酶2转基因小鼠随机分为4组，野生型对照组(6只)、野生型非诺贝特组(6只)、转基因对照组(超氧化物歧化酶2转基因型)(5只)、转基因非诺贝特组(5只)。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞小鼠模型，90 min后拔出栓线，使脑血流再灌注30 min。使用脑血流监测仪监测局部脑血流；取脑组织切片，使用TTC染色分析各组脑梗死情况。

结果与结论：①经PCR和DNA测序分析，成功构建超氧化物歧化酶2+/+转基因小鼠9只。②缺血再灌注后，野生型非诺贝特组较野生型对照组的脑血流部分恢复、脑梗死体积明显缩小(P < 0.001)；转基因非诺贝特组与转基因对照组在脑血流与脑梗死体积方面无显著差异；转基因对照组在脑血流及脑梗死改善方面优于野生型对照组(P < 0.001)；野生型非诺贝特组与转基因对照组和转基因非诺贝特组在脑血流、脑梗死体积上均无显著差异。③结果说明，超氧化物歧化酶2的表达是非诺贝特治疗脑缺血再灌注损伤的机制之一。

https://orcid.org/0000-0002-2770-7597(马江磊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脑缺血再灌注损伤, 非诺贝特, 超氧化物歧化酶2, 氧化应激, 脑梗死, 神经保护

Abstract: BACKGROUND: Oxidative injury is considered to be one of the important factors of cerebral ischemia-reperfusion injury. Superoxide dismutase 2 (SOD2) is a key mitochondrial antioxidant molecule, and fenofibrate can regulate the expression of SOD2 by activating peroxisome proliferator-activated receptor α.
OBJECTIVE: To explore whether the mechanism of fenofibrate in the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury depends on the expression of SOD2.
METHODS: The TALENs system was used to construct SOD2 transgenic mice. The transgenic mice were genotyped by PCR and DNA sequencing techniques. The expression of SOD2 protein in transgenic mice was detected by western blot assay. Wild-type and SOD2 transgenic mice were randomly divided into four groups: wild-type control group (n=6), wild-type fenofibrate group (n=6), SOD2 transgenic control group (n=5) and SOD2 transgenic fenofibrate group (n=5). A mouse model of middle cerebral artery occlusion was prepared using the suture-occlusion method. After 90 minutes of ischemia, the thread was removed to reperfuse cerebral blood flow for 30 minutes. A cerebral blood flow monitor was used to monitor local cerebral blood flow. Brain tissue slices were taken for 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining to analyze the situation of cerebral infarction in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: After PCR and DNA sequencing analysis, nine SOD2+/+ transgenic mice were successfully constructed. After cerebral ischemia-reperfusion, the wild-type fenofibrate group showed partial recovery of cerebral blood flow and significantly reduced cerebral infarction volume compared with the wild-type control group (P < 0.001). There was no significant difference in cerebral blood flow and cerebral infarction volume between the SOD2 transgenic fenofibrate group and the SOD2 transgenic control group. The SOD2 transgenic control was superior to the wild-type control group in terms of improving cerebral blood flow and cerebral infarction (P < 0.001). There were also no significant differences in cerebral blood flow and cerebral infarction volume between the wild-type fenofibrate group and the SOD2 transgenic control group and between the wild-type fenofibrate group and the SOD2 transgenic fenofibrate group. To conclude, the expression of SOD2 is one of the mechanisms of fenofibrate in the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury.

Key words: cerebral ischemia-reperfusion injury, fenofibrate, superoxide dismutase 2, oxidative stress, cerebral infarction, neuroprotection

中图分类号:

马江磊, 张慧杰, 张晨芳, 杨锡彤, 程建杰, 王光明. 非诺贝特干预超氧化物歧化酶2转基因C57BL/6J小鼠的神经保护机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4547-4552.

Ma Jianglei, Zhang Huijie, Zhang Chenfang, Yang Xitong, Cheng Jianjie, Wang Guangming. Neuroprotective mechanism by which fenofibrate regulates superoxide dismutase 2 expression in transgenic C57BL/6J mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(28): 4547-4552.

图/表（结果） 5

2.1 SOD2转基因小鼠中SOD2的表达通过PCR和DNA测序技术在筛选的92只幼崽中，9只被鉴定为SOD2+/+，分别编号1-9，见图2。SOD2+/+转基因小鼠按照标准方法饲养繁殖，选取SOD2表达最好的7号、8号和9号小鼠家系以及野生型子代小鼠各2只，进行脑组织SOD2蛋白免疫印迹检测，结果显示3个家系中9号的小鼠脑组织中SOD2的相对蛋白水平最高，见图3，选择9号家系小鼠10只用于下一步实验。

2.2 小鼠脑缺血再灌注损伤后的脑血流量分析野生型组与SOD2+/+转基因组小鼠的治疗后或对照组小鼠中脑部灌流前后的血流及体温变化无统计学意义，见表2。Laser Speckle图像系统结果显示：与野生型对照组相比，野生型非诺贝特组缺血再灌注后恢复部分脑血流较多，脑血流显像明显增强；转基因非诺贝特组与转基因对照组间无显著改善；野生型非诺贝特组与转基因对照组以及转基因非诺贝特组的脑血流均无显著差异，见图4。

2.3 小鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积的变化经TTC染色液后小鼠正常脑组织呈深红色，造模过程小鼠左侧大脑中动脉堵塞，因此出现右侧半球不同程度的白色梗死灶。脑组织切片显示野生型非诺贝特组转基因对照组和转基因非诺贝特组均差异无显著性意义，见图5A。脑梗死体积分析显示：野生型非诺贝特组小鼠脑梗死体积较野生型对照组缩小(P < 0.001)；转基因对照组较野生型对照组脑梗死体积显著缩小；转基因非诺贝特组与转基因对照组相比梗死体积缩小，但差异无显著意义；野生型非诺贝特组与转基因对照组以及转基因非诺贝特组的脑梗死体积差异均无显著意义，见图5B。

参考文献

[1] AJOOLABADY A, WANG S, KROEMER G, et al. Targeting autophagy in ischemic stroke: From molecular mechanisms to clinical therapeutics. Pharmacol Ther. 2021;225:107848.
[2] YUAN Q, YUAN Y, ZHENG Y, et al. Anti-cerebral ischemia reperfusion injury of polysaccharides: A review of the mechanisms. Biomed Pharmacother. 2021;137:111303.
[3] SU X T, WANG L, MA SM, et al. Mechanisms of Acupuncture in the Regulation of Oxidative Stress in Treating Ischemic Stroke. Oxid Med Cell Longev. 2020;2020:7875396.
[4] ZHU G, WANG X, CHEN L, et al. Crosstalk Between the Oxidative Stress and Glia Cells After Stroke: From Mechanism to Therapies. Front Immunol. 2022;13:852416.
[5] KOWALCZYK P, SULEJCZAK D, KLECZKOWSKA P, et al. Mitochondrial Oxidative Stress-A Causative Factor and Therapeutic Target in Many Diseases. Int J Mol Sci. 2021;22(24):13384.
[6] YOO J, JEONG IK, AHN KJ, et al. Fenofibrate, a PPARalpha agonist, reduces hepatic fat accumulation through the upregulation of TFEB-mediated lipophagy. Metabolism. 2021;120:154798.
[7] GUO X, DANG W, LI N, et al. PPAR-alpha Agonist Fenofibrate Ameliorates Sjogren Syndrome-Like Dacryoadenitis by Modulating Th1/Th17 and Treg Cell Responses in NOD Mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2022;63(6):12.
[8] JIN L, HUA H, JI Y, et al. Anti-inflammatory role of fenofibrate in treating diseases. Biomol Biomed. 2023;23(3):376-391.
[9] SHEHATA A HF, AHMED A-S F, ABDELREHIM A B, et al. The impact of single and combined PPAR-α and PPAR-γ activation on the neurological outcomes following cerebral ischemia reperfusion. Life Sci. 2020;252:117679.
[10] 杨锡彤, 秦燕, 杜小珊, 等. PPARα调控SOD2表达的机制研究[J].大理大学学报,2018,3(2):27-31.
[11] BULLOCK JJ, MEHTA SL, LIN Y, et al. Hyperglycemia-enhanced ischemic brain damage in mutant manganese SOD mice is associated with suppression of HIF-1alpha. Neurosci Lett. 2009;456(2):89-92.
[12] LI M, TANG H, LI Z, et al. Emerging Treatment Strategies for Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury. Neuroscience. 2022;507:112-124.
[13] LIU M, SUN X, CHEN B, et al. Insights into Manganese Superoxide Dismutase and Human Diseases. Int J Mol Sci. 2022;23(24):15893.
[14] SCHIEBER M, CHANDEL NS. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 2014;24(10):R453-462.
[15] KLAFKE JZ, DA SILVA MA, ROSSATO MF, et al. Acute and chronic nociceptive phases observed in a rat hind paw ischemia/reperfusion model depend on different mechanisms. Pflugers Arch. 2016;468(2): 229-241.
[16] LIU Y, ZHANG L, LIANG J. Activation of the Nrf2 defense pathway contributes to neuroprotective effects of phloretin on oxidative stress injury after cerebral ischemia/reperfusion in rats. J Neurol Sci. 2015; 351(1-2):88-92.
[17] ZHAO B, JIANG X. hsa-miR-518-5p/hsa-miR-3135b Regulates the REL/SOD2 Pathway in Ischemic Cerebral Infarction. Front Neurol. 2022;13:852013.
[18] YANG X, LI X, ZHONG C, et al. Circular RNA circPHKA2 Relieves OGD-Induced Human Brain Microvascular Endothelial Cell Injuries through Competitively Binding miR-574-5p to Modulate SOD2. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:3823122.
[19] TOWNSEND K, LAFFAN J, HAYMAN G. Carboxymethylcellulose excipient allergy: a case report. J Med Case Rep.2021;15(1): 565.
[20] MONTAIGNE D, BUTRUILLE L, STAELS B. PPAR control of metabolism and cardiovascular functions. Nat Rev Cardiol. 2021;18(12): 809-823.
[21] TAHRI-JOUTEY M, ANDREOLETTI P, SURAPUREDDI S, et al. Mechanisms Mediating the Regulation of Peroxisomal Fatty Acid Beta-Oxidation by PPARalpha. Int J Mol Sci. 2021;22(16):8969.
[22] LEE D, TOMITA Y, NEGISHI K, et al. Pemafibrate, a potent selective peroxisome proliferator-activated receptor α modulator, a promising novel treatment for ischemic retinopathy? Neural Regen Res. 2023; 18(7):1495-1496.
[23] MANDALA A, CHEN W J, ARMSTRONG A, et al. PPARalpha agonist fenofibrate attenuates iron-induced liver injury in mice by modulating the Sirt3 and beta-catenin signaling. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2021;321(4):G262-G269.
[24] ZHAO J, WANG G, HAN K, et al. Mitochondrial PKM2 deacetylation by procyanidin B2-induced SIRT3 upregulation alleviates lung ischemia/reperfusion injury. Cell Death Dis. 2022;13(7):594.
[25] BESSON VC, CHEN XR, PLOTKINE M, et al. Fenofibrate, a peroxisome proliferator-activated receptor alpha agonist, exerts neuroprotective effects in traumatic brain injury. Neurosci Lett. 2005;388(1):7-12.
[26] LIU Q, ZHANG X, CHENG R, et al. Salutary effect of fenofibrate on type 1 diabetic retinopathy via inhibiting oxidative stress-mediated Wnt/beta-catenin pathway activation. Cell Tissue Res. 2019;376(2):165-177.
[27] MO Z, ZENG Z, LIU Y, et al. Activation of Wnt/Beta-Catenin Signaling Pathway as a Promising Therapeutic Candidate for Cerebral Ischemia/Reperfusion Injury. Front Pharmacol. 2022;13:914537.
[28] SHI S, WANG M, LIU X, et al. Scalp Electroacupuncture Promotes Angiogenesis after Stroke in Rats by Activation of Wnt/beta-Catenin Signal Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022: 1649605.
[29] WANG LP, PAN J, LI Y, et al. Oligodendrocyte precursor cell transplantation promotes angiogenesis and remyelination via Wnt/beta-catenin pathway in a mouse model of middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 2022;42(5):757-770.
[30] QIU CW, LIU ZY, ZHANG FL, et al. Post-stroke gastrodin treatment ameliorates ischemic injury and increases neurogenesis and restores the Wnt/beta-Catenin signaling in focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 2019;1712:7-15.
[31] SONG F, MAO YJ, HU Y, et al. Acacetin attenuates diabetes-induced cardiomyopathy by inhibiting oxidative stress and energy metabolism via PPAR-alpha/AMPK pathway. Eur J Pharmacol. 2022;922:174916.
[32] LI LX, YIN LH, GAO M, et al. MiR-23a-5p exacerbates intestinal ischemia-reperfusion injury by promoting oxidative stress via targeting PPAR alpha. Biochem Pharmacol. 2020;180:114194.

引言

在世界范围内，脑卒中仍然是导致死亡和残疾的主要原因之一，其中85%以上是缺血性脑卒中[1]。脑内血管阻塞后，由于脑血流突然减少、氧气和能量供应中断，导致不可逆的神经元损伤，从而引起正常神经功能受损及脑组织梗死。然而，目前仍缺乏有效的方法来改善脑卒中后的功能恢复。及时应用血管活性药物或进行溶栓、取栓等血运重建治疗是缺血性卒中早期的主要治疗方法。
脑缺血再灌注诱导一系列生化和细胞反应，产生过多的活性氧[2]，由活性氧过量产生引起的氧化应激在缺血性卒中脑损伤的基本病理进展中起着重要作用[3]。当内在的抗氧化潜能不足以中和活性氧，而无法保持内源性氧化还原平衡时，就会发生氧化应激。活性氧可通过脂质、蛋白质和核酸的氧化损伤导致细胞毒性，对脑组织的结构和功能产生有害影响[4]。
临床前研究证实，抗氧化应激损伤是急性脑卒中的可行性治疗靶点，可以减少脑梗死面积，改善实验性脑卒中小鼠模型的神经功能[5]。非诺贝特是过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)激动剂，除调节血脂作用外，还发现其具有抗炎、抗氧化和免疫调节等作用[6-8]。通过上调PPARα的mRNA表达、减轻脂质过氧化损伤对急性脑缺血/再灌注损伤发挥保护作用[9]。
课题组前期研究发现，非诺贝特处理C57BL/6小鼠的脑微血管和脑微血管内皮细胞中，其PPARα和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)2的表达均升高，非诺贝特可通过激活的PPARα与SOD2基因启动子上游的PPRE结合以调节SOD2的表达[10]。SOD2是关键的线粒体抗氧化酶，是细胞内抗氧化系统的重要组成部分，通过清除线粒体过多氧自由基维持细胞氧化/抗氧化平衡。此外，SOD2在脑缺血/再灌注损伤防护中也发挥重要作用[11]。因此，为进一步了解非诺贝特在治疗小鼠脑缺血再灌注损伤中是否依赖于SOD2的表达，该项研究通过构建SOD2转基因小鼠，利用小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，探究非诺贝特治疗脑缺血再灌注损伤的SOD2基因表达机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较使用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年4月至2021年6月在大理大学下关校区动物实验中心及大理大学第一附属医院基因检测中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物从湖南长沙斯莱克景达实验动物有限公司购买12只6-8周龄的野生型雄性C57BL/6J小鼠，以及通过转基因构建的SOD2+/+转基因小鼠10只，体质量为20-25 g。在大理大学动物中心标准喂养，室内温度保持在20-25 ℃，饲养1周后用于实验。
该研究方案经大理大学第一附属医院伦理委员会批准(伦理号：DFY20190401001)，实验过程符合相关动物实验伦理要求。
1.3.2 实验药品和试剂非诺贝特(finofibrate，Sigma公司，美国，货号：H31021556)；羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC，Sigma公司，美国，货号：C4888-500G)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色液购自上海源叶生物公司，使用前用生理盐水配制成浓度为2%的TTC染色液；引物合成委托赛业(广州)生物科技有限公司加工；蛋白质提取试剂盒(货号：DA1102)、蛋白质浓度检测试剂盒(货号：DA0104)、羊抗鼠SOD2 IgG(货号：MD2142)、羊抗兔β-actin IgG(货号：MD2141)、兔抗SOD2(货号：MD912053)以及兔抗β-actin(货号：MD912055)均购自Anngen公司；DNA提取试剂盒(货号：9765)和PCR试剂盒(货号：YZYMT-014)购自Invitrogen公司。
1.3.3 实验仪器实验室超净工作台(型号：BSC-1500，济南鑫贝西生物技术有限公司)；台式高速低温离心机(型号：KOBUTA-3520H，日本KUBOTA公司)；PCR仪(型号：SLAN-96S，上海宏石医疗科技有限公司)；脑血流监测仪(BD公司)；栓线购自北京西浓生物有限公司；异氟烷购自广东深圳瑞沃德科技公司。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组及处理小鼠随机分为野生型CMC对照组(野生型对照组)6只、野生型非诺贝特治疗组(野生型非诺贝特组)6只、SOD2转基因CMC对照组(转基因对照组)5只和SOD2转基因非诺贝特治疗组(转基因非诺贝特组)5只：CMC处理用5%的CMC混悬液10 mL/kg；非诺贝特溶解于CMC中制成浓度为10 μg/mL混悬液30 mg/kg。通过灌胃给药，CMC和非诺贝特均为每天早8点给药1次，连续7 d，最后一次给药后1 h内进行MCAO手术。

1.4.2 SOD2转基因小鼠的构建利用TALENs系统构建SOD2转基因小鼠，首先在质粒pRP(Exp)-CMV的位点处插入SOD2的全长cDNA，构建SOD2重组质粒，见图1。SOD2基因位于小鼠的第17号染色体，选择第2外显子作为靶点，质粒线性化后，将体外转录产生的TALEN mRNAs注射到小鼠的受精卵中，移植到假孕母鼠子宫内，小鼠出生后采用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术鉴定基因分型。挑取SOD2阳性的F0代进行繁殖，对子代小鼠再进行PCR和DNA测序分析鉴定基因分型。

1.4.3 小鼠的基因分型鉴定取小鼠的尾部组织2-5 mm，根据组织DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA，按照插入目的基因序列共设计2对引物，第1对引物为SOD2基因引物，产物大小为252 bp，第2对引物为β-actin引物，产物大小为413 bp，引物序列见表1。PCR扩增体系为25 μL：ddH2O 8 μL、Premix Taq12.5 μL、DNA 2.1 μL、SOD2基因上下游引物各0.8 μL以及β-actin引物上下游各0.4 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性30 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，38个循环，最后72 ℃再延伸5 min。根据PCR电泳结果，得到SOD2基因分型。PCR后得到252 bp大小的产物，纯化扩增进行DNA测序分析。使用5’-CCG GCC ATC ACC ACT TTG TA-3’引物进行DNA测序，野生型DNA被用作平行测序的阴性对照，筛选SOD2纯合子(+/+)做后续研究。

1.4.4 免疫印迹法检测小鼠的SOD2表达选择SOD2表达最显著的SOD2+/+转基因小鼠的3个家系各2只，取小鼠脑组织做SOD2蛋白免疫印迹检测。根据蛋白质提取试剂盒说明提取总蛋白，测定蛋白质浓度后，配置8%的SDS-PAGE凝胶，以15 μg的蛋白量上样80 V恒压电泳。用Bio-Rad公司半干转移系统转到PVDF膜上，加入1%的脱脂奶粉室温孵育30 min。PVDF膜与SOD2(1∶1 000)和β-actin(1∶2 000)一抗4 ℃下孵育一晚。TBST漂洗3次×10 min后，加入二抗(1∶3 000)室温孵育60 min，TBST漂洗3次×10 min后，使用蛋白免疫印迹检测系统扫描，用Image J软件进行分析。以对照组SOD2和β-actin灰度值比值为1作对照，其他组灰度值比值代表了SOD2蛋白表达的相对值。评价3个家系的SOD2蛋白表达情况后，选择表达最优的家系做后续MCAO实验。
1.4.5 小鼠缺血再灌注损伤模型将体积分数3%异氟烷吸入麻醉后的小鼠取仰卧位固定，使用加热垫维持小鼠直肠温度为(37±1) ℃。对颈部皮肤常规消毒处理，去毛，纵向切开一个1.5 cm的切口。颈部正中切开，分离出左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，随后对左侧颈外动脉进行结扎，在颈总动脉近心端用尼龙线结扎，然后夹闭左侧颈内动脉，在颈总动脉远端开一小口，缓慢插入线栓使其通过左侧颈内动脉，堵塞左侧大脑中动脉，并松开动脉夹。90 min后拔出线栓，进行再灌注。30 min后吸入过量CO2处死小鼠后，用生理盐水灌注脑组织，取脑放入脑膜中。手术全程使用脑血流监测仪对左耳后缺血区颅骨表面的脑血流进行监测，做好记录并用Laser Speckle图像系统采集脑血流图像。

1.4.6 TTC染色分析脑梗死体积将脑膜中的脑组织冠状面均匀地切成5片，每片厚约2 mm。将切好的脑组织薄片置于2%的TTC染色液中，37 ℃避光水浴染色30 min，期间翻动脑片充分接触溶液。最后进行扫描并MCID图像系统分析脑坏死的体积。

1.5 主要观察指标 ①PCR反应中SOD2 mRNA的表达；②免疫印迹检测中SOD2蛋白的表达；③小鼠体温变化；④小鼠脑局部血流变化；⑤小鼠脑梗死切片TTC染色显示脑梗死面积以及MCID图像分析脑梗死体积变化。
1.6 统计学分析用GraphPad Prism 9.5.1软件分析脑梗死体积，所有数据均以x±s表示，组间比较使用单因素方差分析法，P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经通过大理大学生物统计学专家审核。

讨论

氧化损伤被认为是脑缺血再灌注损伤的重要机制之一[12]，脑缺血再灌注损伤后机体产生大量的活性氧，活性氧引起膜脂质过氧化反应，导致机体发生病理性损伤，因此，抗氧化损伤对缺血灌注损伤具有一定的获益。SOD是一类抗氧化酶，在减少氧化应激和维持细胞内和细胞外氧化/抗氧化平衡中起关键作用[13]。目前，在哺乳动物细胞中发现了3种SOD亚型，分别是铜锌超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD，SOD1)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD，SOD2)和细胞外超氧化物歧化酶(EcSOD，SOD3)[14]。SOD2是体内对抗活性氧过多的主要抗氧化酶，能清除氧自由基，起到保护机体免受氧化损伤的作用，其活力的高低能够反映机体清除氧自由基能力和抗氧化能力[15-16]。Zhao等[17]在MACO小鼠模型的脑血管单核细胞中发现SOD2以及其调控因子REL表达显著升高(P < 0.05)，REL主要参与神经递质活性和氧化磷酸化。通过构建miRNA-TF-mRNA相互作用网络，表明hsa-miR-518-5p/hsa-miR-3135b调节REL/SOD2途径影响缺血性脑梗死。另一项缺血性脑卒中的研究发现，circPHKA2通过与miR-574-5p相互作用上调SOD2的表达起到神经血管保护作用[18]。CMC是植物多糖纤维素的衍生物，通过碱催化反应合成，由于其具有高黏度和溶解度以及低毒，被广泛应用于多种药品、食品和饮料中[19]。此次研究以SOD2为靶基因，通过显微注射技术建立了SOD2转基因小鼠，PCR和DNA测序技术筛选出SOD2+/+型小鼠，通过将SOD2+/+型小鼠和野生型小鼠建立MACO模型，发现SOD2+/+转基因对照组在脑缺血再灌注损伤后的脑内血流部分恢复好且梗死体积显著小于野生型对照组，表明SOD2对脑缺血再灌注后脑损伤具有保护作用。
非诺贝特对缺血再灌注脑损伤有明显保护作用，能激活PPARα，PPARα是PPAR家族核受体的3种亚型之一，可参与多种生理过程，如脂蛋白、脂质代谢和葡萄糖稳态的调节[20-22]。最近的观察表明PPARα激动剂可以抑制NF-κβ活性，最后产生抗氧化应激和抑制中枢神经系统炎症反应作用[10]。在小鼠肝损伤模型的研究中，发现非诺贝特可通过下调PPARα-Sirt3-Wnt信号传导而减轻肝脏中过量的铁积累而导致纤维化[23]。Sirt3是一种NAD+依赖的脱乙酰酶，可以通过使Wnt/β-连环蛋白信号通路正常化来预防缺血再灌注损伤[24]。此外，非诺贝特对创伤性脑损伤也有明显的保护作用，由于创伤性脑损伤引起神经炎症反应，PPARα激动剂被证明可以减少创伤引起的炎症性疾病，并显示非诺贝特治疗大脑侧面液体撞击所致的创伤模型大鼠在创伤早期(24 h内)和后期(7 d后)
可以减轻由脑创伤引起的神经功能障碍和脑水肿，表明PPARα的激活可能是一种新的、有前途的脑损伤治疗策略[25]。此次研究发现野生型小鼠经非诺贝特治疗后的脑梗死体积及脑血流较对照组都有显著改善，这与上述的研究结果相同。
课题组前期研究发现，非诺贝特可通过激活的PPARα调节SOD2的表达，提示非诺贝特治疗脑缺血再灌注损伤可能依赖于SOD2的表达[10]。此次研究发现在野生型非诺贝特组和转基因对照组的脑血流及脑梗死体积显著好于野生型对照组，转基因对照组较野生型对照组显著好转，而野生型非诺贝特组与转基因对照组以及转基因非诺贝特组在再灌注后的脑血流及脑梗死体积方面均无显著差异，这一结果推断非诺贝特可以通过依赖于SOD2基因表达起到神经保护的作用。此次研究发现，在转基因非诺贝特组的脑梗死体积略小于转基因对照组，考虑是由于在SOD2高表达对脑缺血再灌注后脑损伤保护机制中，还存在其他因素的影响，即SOD2的表达是非诺贝特治疗脑缺血再灌注损伤的机制之一。一项研究发现，在高血糖环境下会增加活性氧的产生，导致Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活，Wnt/β-连环蛋白信号的激活导致SOD1和SOD2的下调，加重糖尿病视网膜氧化损伤[26]。非诺贝特具有减少Nox介导活性氧产生的作用，抑制Wnt/β-连环蛋白信号激活以减弱SOD的下调，从而促进糖尿病视网膜中活性氧分解。Wnt/β-连环蛋白信号通路也与神经系统疾病密切相关。先前的研究表明，激活Wnt信号可以促进神经再生以加强局灶性缺血性损伤后的功能恢复[27-28]，
阻断Wnt信号会抑制大鼠神经母细胞的增殖和分化[29]。此外，Wnt信号还具有保护β-连环蛋白免受降解，促进神经再生的作用[30]。最近的一项研究发现，阿曲素可通过促进PPARα/AMPK信号通路，以降低SOD2来对抗高糖诱导的细胞损伤、凋亡和氧化应激[31]。LI等[32]发现通过激活PPARα/FOXO3α/PGC-1α路径，协同调节SOD2基因的表达水平，从而增强机体抗氧化能力，减轻肠道缺血再灌注损伤。通过上述研究的发现，推断非诺贝特改善脑缺血/再灌注损伤可能通过阻断一种或几种信号通路传导，增加SOD2表达来协调氧化应激反应，但这一推论有待于进一步探索。
综上所述，此次研究通过构建SOD2+/+转基因和野生型MACO小鼠模型，发现转基因组较野生型小鼠在脑血流及脑梗死体积上均有显著好转，而野生型非诺贝特组与转基因对照组以及转基因非诺贝特组的再缺血灌注后的脑血流及脑梗死体积指标均无显著差异，推测非诺贝特通过依赖SOD2表达使脑缺血再灌注损伤后氧化损伤减轻，改善脑血流，并使脑梗死体积减小，从而起到神经保护作用，这一结果为脑缺血再灌注损伤的临床治疗提供一定的理论依据。然而，研究还存在不足之处，目前仅从小鼠模型中得出结论，缺乏细胞实验以及分子水平上的证据支持，后续将进行更深入的研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

非诺贝特干预超氧化物歧化酶2转基因C57BL/6J小鼠的神经保护机制

Neuroprotective mechanism by which fenofibrate regulates superoxide dismutase 2 expression in transgenic C57BL/6J mice

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[1]	杨毅峰, 叶楠, 王琳, 郭帅成, 黄健. 右美托咪定抗缺血再灌注损伤的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1464-1469.
[2]	娄国, 张艳, 付常喜. 内皮型一氧化氮合酶在运动预适应改善心肌缺血-再灌注损伤中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1283-1288.
[3]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[4]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.
[5]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 负载丹酚酸B甲基丙烯酰化明胶水凝胶对椎间盘退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 380-386.
[6]	钱龙杰, 苏文利, 朱文献, 王毅鑫. 沉默信息调节因子1激活剂SRT1720减轻大鼠急性颅脑损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4447-4454.
[7]	周明瀚, 张慧, 郑先波, 徐无忌. 不同氧浓度下髓核细胞中PI3K/Akt/HIF-1α信号通路表达对延缓椎间盘退变的意义[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4491-4497.
[8]	陈晨, 郑润泉, 张贵春. 大黄素对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4528-4534.
[9]	陶经纬, 周婧雅, 赵毅, 任敬佩, 胡传宇, 徐林, 穆晓红, 范筱. 川芎嗪对脊髓损伤大鼠铁死亡的调控作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4158-4163.
[10]	罗善超, 唐继仁. 橙皮素抑制氧化应激影响软骨细胞的炎性退变[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4184-4188.
[11]	李雁冰, 王记委, 刘晓琴, 郭敏芳, 牛晓洁, 孟涛, 苏琴, 王瀚斌, 杨立志, 马存根, 尉杰忠. 灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4041-4047.
[12]	何波, 何志军, 刘涛, 马岁录, 魏晓涛, 王威威. 间充质干细胞治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制及优势[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4065-4071.
[13]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 天然产物调控氧化应激治疗骨质疏松症[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(24): 3915-3921.
[14]	郑俭彬, 陆玉春, 江自鲜, 李秀芳, 王涛, 王文静. 彝药斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用及靶点预测[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3627-3635.
[15]	马万里, 杨红胜, 屈波, 张正东, 龚凯, 林炎水. 黄芩素预防大鼠激素性股骨头坏死的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3661-3668.