链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的构建及评价

doi:10.12307/2023.898

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (2): 237-241.doi: 10.12307/2023.898

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链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的构建及评价

陈思敏1，2，胡颖俊1，闫文睿1，冀乐1，邵梦丽1，孙泽1，3，郑红星1，4，祁珊珊1，2

陕西理工大学，1生物科学与工程学院，2秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室(培育)，陕西省汉中市 723000；3陕西省资源生物重点实验室，陕西省汉中市 723000；4陕西省黑色有机食品工程技术研究中心，陕西省汉中市 723000

收稿日期:2022-11-01 接受日期:2022-12-24 出版日期:2024-01-18 发布日期:2023-06-30
通讯作者: 祁珊珊，博士，教授，硕士生导师，陕西理工大学生物科学与工程学院，秦巴生物资源与生态环境省部共建国家重点实验室(培育)，陕西省汉中市 723000
作者简介:陈思敏，女，1997年生，陕西省汉中市人，汉族，陕西理工大学在读硕士，主要从事天然产物药理研究。
基金资助:
陕西省科技厅面上项目(2020JM-601)，项目负责人：祁珊珊；陕西省教育厅重点研发项目(20JY005)，项目负责人：祁珊珊；秦巴生物资源与生态环境国家重点实验室项目(SXC-2013)，项目负责人：郑红星；中国富硒产业研究院富硒专项研发项目(2021FXZX06)，项目负责人：祁珊珊；陕西省科技厅农业类一般项目(2023-YBNY-185)，项目负责人：郑红星

Establishment and evaluation of a streptozotocin-induced diabetic encephalopathy rat model

Chen Simin1, 2, Hu Yingjun1, Yan Wenrui1, Ji Le1, Shao Mengli1, Sun Ze1, 3, Zheng Hongxing1, 4, Qi Shanshan1, 2

1College of Biological Science and Engineering, 2Qinba State Key Laboratory of Biological Resources and Ecological Environment, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi Province, China; 3Shaanxi Province Key Laboratory of Bio-resources, Hanzhong 723000, Shaanxi Province, China; 4Shaanxi Black Organic Food Engineering Technology Research Center, Hanzhong 723000, Shaanxi Province, China

Received:2022-11-01 Accepted:2022-12-24 Online:2024-01-18 Published:2023-06-30
Contact: Qi Shanshan, MD, Professor, Master’s supervisor, College of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi Province, China; Qinba State Key Laboratory of Biological Resources and Ecological Environment, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi Province , China
About author:Chen Simin, Master candidate, College of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi Province, China; Qinba State Key Laboratory of Biological Resources and Ecological Environment, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi Province, China
Supported by:
Shaanxi Provincial Science and Technology Department (General Program), No. 2020JM-601 (to QSS); Key Research and Development Project of Shaanxi Provincial Education Department, No. 20JY005 (to QSS); State Key Laboratory of Qinba Biological Resources and Ecological Environment Project, No. SXC-2013 (to ZHX); China Selenium Enriched Industry Research Institute Special R&D Project for Selenium Enrichment, No. 2021FXZX06 (to QSS); Shaanxi Provincial Department of Science and Technology General Project for Agriculture, No. 2023-YBNY-185 (to ZHX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

糖尿病脑病：是由糖尿病引发的中枢神经系统病变，导致大脑萎缩、神经元结构和功能受损，神经生理改变及认知功能障碍。糖尿病脑病的发生与慢性高血糖造成的脑组织氧化应激、神经炎症及神经细胞凋亡有关。
链脲佐菌素诱导糖尿病脑病模型：链脲佐菌素可用于诱导啮齿类动物患糖尿病，其对胰岛β细胞具有特异性毒性，引起胰岛素合成减少。随着对糖尿病脑病研究的深入，确定其具体的发病机制和防治方法就成了关注的重点，因此糖尿病脑病疾病动物模型的构建十分必要。

背景：目前研究较成熟的糖尿病脑病模型主要有链脲佐菌素诱导模型、高糖高脂饮食诱导模型和自发性动物模型。建立简便易行、周期短、安全有效的糖尿病脑病模型对其发病机制的深入探讨和治疗药物的筛选有重要的作用。

目的：进一步验证链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的方法并对其进行评价。
方法：将20只SD大鼠随机分为对照组(n=10)和模型组(n=10)，模型组大鼠左下腹腔一次性注射45 mg/kg链脲佐菌素建立糖尿病实验动物模型，对照组大鼠用等量的柠檬酸缓冲液代替注射。实验期间监测大鼠体质量、饮食量、饮水量和血糖，8周后检测葡萄糖耐量和氧化应激水平，并比较脑组织病理变化及凋亡蛋白的表达情况。

结果与结论：①与对照组相比，模型组大鼠饮食量、饮水量、脑指数、血糖和血糖曲线下面积显著升高、体质量明显下降(P < 0.01)；②脑组织病理学显示，模型组大鼠存活神经细胞数量明显减少(P < 0.01)，神经细胞病理损伤明显高于对照组；③模型组大鼠较对照组血清超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽活力均明显降低(P < 0.01)，氧化活性丙二醛的浓度明显升高(P < 0.05)；④脑组织中凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达水平增加，Bcl-2表达水平降低(P < 0.01)；⑤结果说明，注射45 mg/kg链脲佐菌素8周后可以使糖尿病大鼠脑组织有明显的病理损伤，成功构建糖尿病脑病大鼠模型。

https://orcid.org/0000-0001-7744-3529(陈思敏)；https://orcid.org/0000-0003-1636-3060(祁珊珊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病脑病, 链脲佐菌素, 动物模型, 脑组织, 大鼠, 高血糖, 氧化应激, 神经细胞凋亡

Abstract: BACKGROUND: Animal models of diabetic encephalopathy that have been studied mainly include streptozotocin-induced model, high-sugar and high-fat diet-induced model and spontaneous animal model. Establishing a simple, easy, short-cycle, safe and effective model of diabetic encephalopathy can help to explore the subsequent pathogenesis and screen therapeutic drugs.
OBJECTIVE: To further explore and evaluate the method of building diabetic encephalopathy rat models.
METHODS: Twenty Sprague-Dawley rats were randomly divided into control (n=10) and model (n=10) groups. Rats in the model group were given a single injection of 45 mg/kg streptozotocin in the left lower abdominal cavity, and those in the control group were given the same amount of citrate buffer. During the experiment, the body mass, feed intake, water intake and blood glucose were measured. After 8 weeks, the glucose tolerance and oxidative stress levels were measured, and the pathological changes of brain tissue and the expression of apoptotic proteins were compared between groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the food intake, water intake, encephalization quotient, blood glucose and area under the blood glucose curve were significantly increased in the model group, while the body mass decreased significantly (P < 0.01). Histopathological examination of the brain showed that compared with the control group, the number of surviving nerve cells was significantly reduced in the model group (P < 0.01), with more significant pathological damage of nerve cells. Compared with the control group, the activities of serum superoxide dismutase, catalase and glutathione in the model group were significantly decreased (P < 0.01), and the content of oxidative malondialdehyde was significantly increased (P < 0.05). The expression levels of apoptosis-related proteins Bax and Caspase-3 in brain tissue increased in the model group compared with the control group, while the expression of Bcl-2 decreased (P < 0.01). In conclusion, an 8-week injection of 45 mg/kg streptozotocin can cause obvious pathological damage to the brain tissue of diabetic rats, to successfully establish the rat model of diabetic encephalopathy.

Key words: diabetic encephalopathy, streptozotocin, animal model, brain tissue, rat, high blood glucose, oxidative stress, neuronal cell apoptosis

中图分类号:

陈思敏, 胡颖俊, 闫文睿, 冀乐, 邵梦丽, 孙泽, 郑红星, 祁珊珊. 链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的构建及评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 237-241.

Chen Simin, Hu Yingjun, Yan Wenrui, Ji Le, Shao Mengli, Sun Ze, Zheng Hongxing, Qi Shanshan. Establishment and evaluation of a streptozotocin-induced diabetic encephalopathy rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(2): 237-241.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析实验将20只雄性SD大鼠分为2组，实验过程中动物均无死亡，20只大鼠全部纳入实验结果分析。
2.2 大鼠一般情况观察实验期间，对照组大鼠毛发干净光滑，反应灵敏，体型健壮，精神状态较好；注射链脲佐菌素后的模型组大鼠毛发泛黄，尿量多，反应迟钝，身体消瘦，精神状态较差。在第8周末，比较两组大鼠饮食量和饮水量，模型组大鼠明显高于对照组(P < 0.01)，见表1。

2.3 大鼠血糖比较对照组大鼠从实验开始到结束血糖一直较平稳，模型组大鼠在注射链脲佐菌素后与对照组比较，血糖显著升高(P < 0.01)，见表2。

2.4 大鼠糖耐量比较对照组大鼠灌胃葡萄糖后0.5 h时血糖水平高于灌胃前的空腹血糖，2 h后血糖又恢复至空腹水平；模型组大鼠在实验的各个时间点的血糖水平及血糖曲线下面积值较正常组均显著升高(P < 0.01)，见表3。

2.5 大鼠脑质量、体质量和脑指数比较建模8周后，模型组大鼠脑质量和体质量明显下降，脑指数明显升高，与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见表4。

2.6 大鼠血清氧化应激指标比较与对照组相比，模型组大鼠血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化氢酶活性均明显降低(P < 0.01)，氧化活性丙二醛浓度显著升高(P < 0.05)，见表5。

2.7 大鼠脑组织病理学变化两组大鼠脑组织苏木精-伊红染色结果见图1A，B，对照组大脑皮质区神经元结构完整、边界清晰、细胞核大而完整；模型组大脑皮质神经元无序分布、结构不清晰完整，胞体固缩，出现空泡样变性、细胞核染色较深、结构模糊。两组大鼠脑组织尼氏染色结果见图1 C，D，对照组脑组织中神经细胞染色较深，尼氏体结构清晰数量丰富，存活神经细胞数量较多；与对照组比较，模型组神经细胞染色较浅，尼氏体少而模糊，细胞水肿变性，存活神经细胞明显减少(142±7.37，58.33±4.42，P < 0.01)。

2.8 大鼠脑组织Bax、Bcl-2、Caspase-3阳性细胞表达的比较免疫组化检测脑组织凋亡相关蛋白表达，见图2，在对照组脑组织中仅有少量胞质显色为深黄棕色的Bax和Caspase-3阳性细胞且表达水平较低，而Bcl-2阳性细胞增加，表达水平较高；与对照组相比，模型组大鼠脑组织中Bax和Caspase-3阳性细胞数增多，表达水平显著升高(P < 0.01)，Bcl-2阳性细胞数减少，表达水平降低(P < 0.01)，见表6。

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引言

糖尿病是一种慢性代谢紊乱疾病，可诱发多种并发症，尤其会引起肾脏、心脏、眼睛和脑等器官功能损伤[1-2]。糖尿病脑病是由糖尿病引起的中枢神经系统最常见的并发症，会使大脑神经元结构和功能受损、神经生理改变进而出现认知功能障碍[3]。流行病学证据表明糖尿病患者中出现认知功能障碍和痴呆症的风险为60%左右[4-5]。研究表明，糖尿病脑病的发生与慢性高血糖造成的脑组织氧化应激、海马突触结构的可塑性变化、神经炎症及神经细胞凋亡等因素可能有关[6-8]。过量的氧自由基生成导致机体发生氧化应激损伤，目前有大量的研究已经证实了氧化应激与脑组织损伤的关系。氧化应激会损伤大脑的不同区域，导致形态异常和记忆损伤[9]。此外还有研究发现，长期高血糖会使脑组织损伤，导致血脑屏障的通透性增加，引起神经元变性和凋亡[10]。目前研究较成熟的糖尿病脑病模型主要有链脲佐菌素诱导模型、高糖高脂饮食诱导模型和自发性动物模型[11-12]。有研究者通过诱导KKAy小鼠成功构建了糖尿病脑病模型，但该模型成本较高且小鼠生存条件要求严格[13]。相比之下，链脲佐菌素诱导模型由于造模周期短、方法简单、成模率高及价格便宜而得以广泛运用[14]。建立糖尿病脑病模型对其发病机制的深入探讨和治疗药物的筛选有重要的作用。该实验旨在通过注射链脲佐菌素构建糖尿病脑病模型，并从多方面对其进行评估，为糖尿病脑病治疗药物筛选和发病机制研究提供可行的实验动物模型。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两组间比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年6月在陕西理工大学病理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康SPF级SD大鼠20只，雄性，鼠龄8周，体质量(230±20) g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(川)2020-030。大鼠饲养于温度为(22±2) ℃，相对湿度为(65±10)%，光照/黑暗每12 h交替循环，干净通风的实验动物房中。实验方案经陕西省道尔丰生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准，批准号：20210902。
1.3.2 主要试剂和仪器链脲佐菌素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；曙红、苏木素购自国药试剂有限公司，甲苯胺蓝购于上海吉至生化科技有限公司；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽和丙二醛试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；羊抗兔IgG购自深圳欣博盛生物科技；Bax、Caspase-3、Bcl-2抗体购自Bioss公司；GA-3三诺血糖仪购于三诺有限公司；显微镜DM3000型购自Leica公司；紫外可见分光光度计UV-6100S型购自上海美谱达仪器有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组与造模方法 20只8周龄雄性SD大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为2组：对照组(n=10)，模型组(n=10)。提前12 h给大鼠禁食，水正常提供，根据体质量计算大鼠注射链脲佐菌素的剂量，模型组按45 mg/kg的剂量于大鼠腹腔注射用柠檬酸缓冲液溶解的链脲佐菌素溶液；对照组大鼠用等量的柠檬酸缓冲液代替注射。于3 d后在大鼠尾部静脉血管取血，进行血糖检测。当未禁食测得血糖≥16.7 mmol/L，并出现饮食量、饮水量和尿量增多的症状时，判定为糖尿病大鼠[15]。

1.4.2 标本采集建模至第8周，将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后在眼眶采集血液，将血液处理后保存备用。采用CO2吸入法处死大鼠，即用气瓶中的CO2结合流量计将气流量控制在(15%-35%) V/min，通气观察确定大鼠死亡[16]。将处死后的大鼠截取头部置于冰上采集脑组织并称取脑质量，脑指数(%)=脑质量(g)/动物体质量(g)×100%。随后将脑组织经缓冲液清洗后固定于40 g/L多聚甲醛中1 d备用[17]。

1.4.3 大鼠体质量和血糖监测在大鼠注射链脲佐菌素之前，对大鼠的原始体质量以及血糖进行测量，在注射链脲佐菌素之后，每周测量并记录大鼠的体质量。在第0，2，4，6，8周选择固定时间于各组大鼠尾部采血测定血糖值[18]。
1.4.4 大鼠糖耐量检测建模8周后，提前5 h让两组大鼠停止进食，测定血糖值，15 min后分别灌胃葡萄糖2.0 g/kg并于0.5，2 h采血后用血糖仪测定血糖值，观察血糖曲线下面积的变化[19]。
1.4.5 氧化应激指标检测将收集到的血液经3 000 r/min离心10 min分离得到血清后按相关试剂盒操作说明，检测血清氧化应激指标超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽活性及丙二醛浓度[20]。
1.4.6 脑组织病理学观察将保存的脑组织经脱水、透明、浸蜡包埋固定好后用切片机切成5 µm厚度的切片。通过苏木精-伊红染色，于光镜下观察大鼠脑组织结构病变；行尼氏染色，每个脑组织选取5个视野200倍镜下观察脑组织尼氏体损伤情况，并计数神经细胞存活数目[21]。
1.4.7 免疫组织化学法检测凋亡相关蛋白的表达脑组织切片先经脱蜡、浸水、抗原修复、消除过氧化物酶活性、3%BSA溶液封闭非特异抗原后，依次滴加初级抗体和次级抗体孵育，用DAB工作液显色，苏木精复染细胞核、脱水透明、中性树胶封固，再使用Image J分析软件定量分析脑组织Bax、Bcl-2、Caspase-3阳性细胞数百分比[22]。
1.5 主要观察指标 ①两组大鼠体质量、脑指数、血糖及血糖曲线下面积；②两组大鼠血清氧化应激水平；③两组大鼠脑组织病理学观察结果；④两组大鼠脑组织凋亡相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析实验数据用SPSS 26.0软件进行分析，计量资料用x±s表示，两组间用独立样本t检验比较差异，组内数据用LSD事后检验比较，以P < 0.05表示差异有显著性意义。该文的统计学方法已经陕西理工大学生物统计学专家审核。

讨论

糖尿病会使中枢神经系统遭到严重损伤，引发糖尿病脑病，进而增加认知功能障碍及痴呆症等的发病风险[23-24]。糖尿病脑病目前没有明确的统一诊断标准，应用较普遍的诊断要求是临床表现上有明确糖尿病病史、排除其他因素导致的认知功能障碍，并且尚未达到痴呆标准，运用认知功能筛查量表、神经影像学和神经电生理学辅助检查评价认知功能[8，25]。由于糖尿病脑病的发病机制复杂多样，尚无定论，目前的治疗药物还是以控制血糖为主，缺乏具体的病因治疗。要进一步明确糖尿病脑病的发病机制及筛选药物可以通过构建实验动物模型来反映其发生和发展的变化情况。
链脲佐菌素是目前诱导糖尿病脑病应用最广泛的诱导剂，它可以特异性识别胰岛β细胞质膜上丰富的葡糖糖转运蛋白2(Glucose transporter type 2，GLUT2)，导致胰岛β细胞结构受损、胰岛素分泌减少[26]。据报道，除了胰岛β细胞，链脲佐菌素还会损伤其他表达GLUT2的器官，尤其是肾脏和肝脏，但由于链脲佐菌素无法穿透缺乏GLUT2转运蛋白的血脑屏障而使大脑不会受到直接影响，且其在机体中易被肝肾迅速代谢清除，因此毒性较小[26-27]。研究发现，用链脲佐菌素诱导糖尿病脑病模型可采取腹腔注射和侧脑室注射，但不同的注射途径会导致血糖和行为的不同变化[28]。RAVELLI等[29]给予小鼠侧脑室注射3 mg/kg链脲佐菌素，14 d后检测到淀粉样蛋白β和Tau蛋白磷酸化增加，记忆和认知能力下降。这种方法构建的糖尿病脑病模型会直接引起空间和情感记忆丧失，但血糖无变化。SAMARGHANDIAN等[30]对大鼠腹腔注射链脲佐菌素60 mg/kg，经生化指标和行为学检测发现大鼠的糖脂代谢异常，大脑氧化应激显著增加、认知功能受损，成功构建了糖尿病脑病模型。此外，贺青华等[31]研究发现，经抗氧化指标和组织病理学检测，大鼠腹腔注射链脲佐菌素后，脑组织氧化应激和炎性因子水平显著增加，脑组织严重损伤，成功建立了糖尿病脑病模型。有研究发现链脲佐菌素的剂量对实验影响较大，注射链脲佐菌素50 mg/kg以上或者40 mg/kg以下，都会严重影响造模成功率[32]。因此为了提高成模率、降低大鼠死亡率，此次实验选择单次腹腔注射45 mg/kg链脲佐菌素造模，并运用病理形态计量学方法对糖尿病引起的脑组织损伤进行了系统评价。
在此次实验中腹腔注射45 mg/kg链脲佐菌素建模3 d后，模型组大鼠血糖高于16.7 mmol/L初步达到建模的效果。建模8周后观察比较大鼠一般情况，结果表明模型组大鼠尿多且毛发泛黄，饮食量及饮水量显著增加，表现出明显的糖尿病症状；进一步比较体质量和血糖水平，结果发现模型组大鼠体质量明显减少，血糖和血糖曲线下面积值显著增加，综合表明，糖尿病大鼠模型建立成功。
持续高血糖对大脑造成的损害与脑神经细胞死亡导致的脑萎缩有关[33]。此次实验对大脑总体外观和质量进行比较，发现模型组大鼠大脑的质量减少，脑指数增加，提示糖尿病导致大脑萎缩。氧化应激是糖尿病引起脑组织损伤的一个关键因素。研究发现，大脑因耗氧量高、抗氧化酶水平低而对氧化应激特别敏感，高血糖会导致大脑氧化应激损伤加重[34]。在此次实验中，模型组较对照组血清氧化酶丙二醛水平显著升高，抗氧化酶超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、过氧化氢酶水平均有所下降，结果表明糖尿病使机体发生氧化应激损伤，表现为增加神经元膜脂质过氧化，降低神经元抗氧化能力[35]。
糖尿病会使大脑的结构和功能改变进而引发认知功能障碍。研究表明，脑组织氧化应激损伤会使得神经细胞数目及结构功能改变[36]。苏木精-伊红染色结果显示，模型组大脑皮质神经元无序分布、结构不清晰完整，胞体固缩，出现空泡样变性、细胞核染色较深、结构模糊；对照组大鼠脑组织神经元排列有序、结构完整，无明显的病理变化。经尼氏染色结果显示，模型组较对照组脑组织尼氏体明显减少，存活神经细胞数量显著下降。有研究显示，脑组织损伤最主要表现在神经元的凋亡，Bax、Bcl-2和Caspase-3是与细胞凋亡相关的蛋白，其中Bax和Caspase-3促进细胞凋亡，Bcl-2抑制细胞凋亡[37]。在此次实验中，腹腔注射链脲佐菌素8周后模型组大鼠脑组织Bax和Caspase-3蛋白表达水平高于对照组，而Bcl-2明显低于对照组，提示链脲佐菌素诱导的高血糖会引起脑组织神经细胞损伤，如坏死或凋亡。
综上所述，腹腔注射链脲佐菌素(45 mg/kg) 8周后，经形态学、生化指标和组织病理学检验，证实可成功建立糖尿病脑病大鼠模型，引发大鼠脑组织损伤。该糖尿病脑病模型简便易行、实验周期短，安全有效。链脲佐菌素诱导的糖尿病脑病除了引起氧化应激和脑组织病理损伤外，还会导致大脑认知功能受损，因此，在后续的研究中还需要进一步进行行为学检测，以评估大鼠认知功能障碍的情况，从而为糖尿病脑病认知障碍治疗的药物筛选和发病机制研究提供基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的构建及评价

Establishment and evaluation of a streptozotocin-induced diabetic encephalopathy rat model

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