缺氧诱导因子1α基因修饰牙髓干细胞的体外成骨及成血管分化

doi:10.12307/2023.699

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3865-3870.doi: 10.12307/2023.699

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

缺氧诱导因子1α基因修饰牙髓干细胞的体外成骨及成血管分化

唐娟1，于栋林1，刘郭琦1，宋娇娇1，左金华2，付洪海2

1滨州医学院，山东省滨州市 256603；2滨州医学院附属医院口腔颌面外科，山东省滨州市 256603

收稿日期:2022-09-17 接受日期:2022-10-29 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-18
通讯作者: 付洪海，硕士，主治医师，滨州医学院附属医院口腔颌面外科，山东省滨州市 256603 左金华，博士，主任医师，滨州医学院附属医院口腔颌面外科，山东省滨州市 256603
作者简介:唐娟，女，1998年生，湖北省荆州市人，汉族，滨州医学院在读硕士，主要从事牙髓干细胞再生方面研究。
基金资助:
山东省自然科学基金(ZR2018PH023)，项目负责人：付洪海；滨州医学院徐荣祥再生医学课题(BY2020XRX011)，项目负责人：付洪海

Osteogenic and angiogenic differentiation of dental pulp stem cells modified by hypoxia-inducible factor-1 alpha gene in vitro

Tang Juan1, Yu Donglin1, Liu Guoqi1, Song Jiaojiao1, Zuo Jinhua2, Fu Honghai2

1Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China

Received:2022-09-17 Accepted:2022-10-29 Online:2023-08-28 Published:2023-01-18
Contact: Fu Honghai, Master, Attending physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China Zuo Jinhua, MD, Chief physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China
About author:Tang Juan, Master candidate, Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2018PH023 (to FHH); Xu Rongxiang Regenerative Medicine Project of Binzhou Medical College, No. BY2020XRX011 (to FHH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

缺氧诱导因子：缺氧诱导因子1是一种由缺氧诱导的亚基缺氧诱导因子1α以及另一个亚基缺氧诱导因子1β共同组成的异源二聚体复合体，它在血管生成、能量代谢、细胞存活等方面发挥重要作用。
牙髓干细胞：是从人恒牙牙髓中提取的，与骨髓间充质干细胞高度相似。它具有自我更新和多谱系分化能力，具有强大的血管生成能力，在特定条件下能够产生毛细血管样结构，对于骨和血管再生都有重要意义。

背景：如何有效地修复和重建临界骨缺损是临床医学的难题。牙髓干细胞作为转基因靶细胞修复受损组织或器官具有一定优势。
目的：探究缺氧诱导因子1α对牙髓干细胞体外成骨及成血管的作用。
方法：选取临床上12-18岁患者因正畸治疗需要拔除的健康、完整双尖牙的牙髓组织分离、培养牙髓干细胞，实验组将缺氧诱导因子1α基因转染至牙髓干细胞，对照组不做任何处理，采用qPCR检测缺氧诱导因子1α的基因表达以及Western blot检测成骨及成血管因子的蛋白表达。

结果与结论：①牙髓干细胞为短梭形的成纤维样细胞，细胞呈集落式生长。②缺氧诱导因子1α基因稳定转染至牙髓干细胞内，随着时间延长缺氧诱导因子1α基因表达逐渐增高，至14 d达到高峰，21 d明显降低。③与对照组相比，实验组的成血管相关因子表达水平更高。转染后1 d，血管内皮生成因子、基质细胞衍生因子1、促血管生成素2、胎盘生长因子蛋白表达明显增高，4 d达到高峰，随后实验组成血管相关蛋白表达虽略有降低，但与对照组相比明显增高。④与对照组相比，实验组的成骨相关因子表达水平更高。转染后1 d，人骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、Runt相关转录因子2蛋白表达明显增高，4 d达到高峰。⑤结果表明，缺氧诱导因子1α能够促进牙髓干细胞成骨及成血管因子的表达。

https://orcid.org/0000-0003-0270-5824 (唐娟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 牙髓干细胞, 缺氧诱导因子1α, 血管内皮生长因子, 骨形态发生蛋白2, 生长因子, 基质细胞衍生因子1, 血管生成素2

Abstract: BACKGROUND: How to effectively repair and reconstruct critical bone defects has become a difficult problem in clinical medicine. Dental pulp stem cells have certain advantages as transgenic target cells to repair damaged tissues or organs.
OBJECTIVE: To investigate the effect of hypoxia-inducible factor-1α on osteogenesis and angiogenesis of dental pulp stem cells in vitro.
METHODS: The pulp tissues of healthy and intact bicuspid teeth extracted by orthodontic treatment in patients aged 12 to 18 years were isolated to culture dental pulp stem cells. The hypoxia-inducible factor-1α gene was transfected into dental pulp stem cells in the experimental group. The control group did not do any treatment. The expression of the hypoxia-inducible factor 1α gene was detected by qPCR and the expression of osteogenic and angiogenic factors was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Dental pulp stem cells were short spindle-shaped fibroblast-like cells, and the cells grew in colonies. (2) Hypoxia-inducible factor-1α gene was stably transfected into dental pulp stem cells. The expression of the hypoxia-inducible factor-1α gene increased gradually with the extension of time, reached a peak at 14 days, and significantly decreased at 21 days. (3) Compared with the control group, the expression level of angiogenesis-related factors in the experimental group was higher. The protein expression levels of vascular endothelial growth factor, stromal cell-derived factor 1, angiopoietin 2, and placental growth factor were significantly increased at 1 day after gene transfection and reached a peak at 4 days. After that, the expression of angiogenesis-associated protein in the experimental group decreased slightly, but was significantly higher than that in the control group. (4) Compared with the control group, the expression level of osteogenic-related factors in the experimental group was higher. The protein expression levels of human bone morphogenetic protein 2, osteocalcin, and Runt-related transcription factor 2 were significantly increased at 1 day after gene transfection, with the highest protein expression at 4 days. (5) It is concluded that hypoxia-inducible factor-1α can promote the osteogenesis and the expression of angiogenic factors in dental pulp stem cells.

Key words: dental pulp stem cell, hypoxia-inducible factor-1α, vascular endothelial growth factor, bone morphogenetic protein 2, growth factor, stromal cell-derived factor 1, angiopoietin 2

中图分类号:

唐娟, 于栋林, 刘郭琦, 宋娇娇, 左金华, 付洪海. 缺氧诱导因子1α基因修饰牙髓干细胞的体外成骨及成血管分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3865-3870.

Tang Juan, Yu Donglin, Liu Guoqi, Song Jiaojiao, Zuo Jinhua, Fu Honghai. Osteogenic and angiogenic differentiation of dental pulp stem cells modified by hypoxia-inducible factor-1 alpha gene in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3865-3870.

图/表（结果） 8

2.1 人牙髓干细胞体外培养及鉴定倒置相差显微镜下观察贴壁细胞为短梭形的成纤维样细胞，细胞呈集落式生长，形成细胞克隆。核为卵圆形、位于胞质中央，似成纤维细胞样，见图1。

免疫荧光显微镜观察到牙髓干细胞标记分子Stro-1主要表达在细胞膜，呈绿色荧光，而CD146主要表达在细胞膜和细胞浆，呈明显绿色荧光，见图2。

2.2 慢病毒转染后细胞活性倒置荧光显微镜观察感染复数为15 pfu/cell时，转染效率最高。MTT结果显示实验组吸光度值较空载体对照组相比下降(P < 0.05)，见图3。

2.3 缺氧诱导因子1α基因转染牙髓干细胞后目的基因的表达实时荧光定量PCR检测结果显示，转染1 d实验组的缺氧诱导因子1α mRNA表达开始增高，随着时间延长缺氧诱导因子1α mRNA表达逐渐增高，至14 d 达到高峰，21 d时缺氧诱导因子1α mRNA表达明显降低。对照组仅可见少量缺氧诱导因子1α mRNA的表达，见图4。

2.4 缺氧诱导因子1α基因调控牙髓干细胞成骨及成血管生长因子的表达通过Western blot检测3个成骨相关因子人骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、Runt相关转录因子2及4个成血管相关因子血管内皮生成因子、基质细胞衍生因子1、促血管生成素2、胎盘生长因子的表达。
缺氧诱导因子1α基因转染后1，4，7，14，21 d提取细胞蛋白，Western blot检测成血管相关因子蛋白的表达。与对照组相比，实验组的成血管相关因子的表达水平在上述5个时间点都更高。在目的基因转染后1 d，血管内皮生成因子、基质细胞衍生因子1蛋白表达明显增高，转染后1 d，血管内皮生成因子、基质细胞衍生因子1蛋白表达明显增高，4 d达到高峰，随后实验组成血管相关蛋白表达虽略有降低，但与对照组相比明显增高。促血管生成素2、胎盘生长因子蛋白表达也呈增高趋势，见图5，6。

Western blot检测成骨相关因子蛋白的表达。与对照组相比，实验组的成骨相关因子的表达水平在上述5个时间点都更高。在目的基因转染后1 d，人骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、Runt相关转录因子2蛋白表达明显增高，其中4 d的蛋白表达水平最高，见图7，8。

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引言

临界骨缺损是指骨缺损达到一定范围，无法实现自发性修复的骨缺损[1]。如何有效地修复和重建临界骨缺损成为了临床医学面临的难题之一。临床上修复骨缺损的金标准是自体骨移植，这样可以有效地减少免疫介导的排斥反应和疾病传播的风险[2]，但这样的修复方式仍然存在着很多缺点，如需二次手术等。随着组织工程的不断发展，组织工程化骨以其优异的性能克服了上述缺点，在人体硬组织缺损修复中得到一定的应用。
组织工程中血管再生与骨再生是相辅相成的。在血管生成与骨形成耦合的起始阶段，缺氧诱导因子1α起着至关重要的作用。缺氧诱导因子1α在人类和小鼠中普遍表达，目前已发现缺氧诱导因子1α在缺氧条件下能够调控转录高达81种具有不同功能的基因表达[3]，其中能够调控血管生成的血管内皮生成因子是其众多下游靶基因之一[4]。血管内皮生成因子对诱导血管生成起着关键性的作用，它能够将内皮细胞重新归巢到缺氧区和缺血区参与血管生成，并刺激其增殖。缺氧诱导因子1α在促进血管形成的同时也可以诱导新骨的形成[5]。因此，通过构建含有缺氧诱导因子1α基因的组织工程化骨可能是解决临界骨缺损修复重建难题的一个有效方法。
干细胞是具有高度更新和分化潜能的细胞群体[6]。牙髓干细胞是从人恒牙中提取出来的具有高度分化潜能的成体干细胞，随着基因工程技术的不断发展，牙髓干细胞作为转基因靶细胞修复受损组织或器官具有一定优势。
该实验通过运用基因增强的组织工程技术，将缺氧诱导因子1α转染到牙髓干细胞中，探讨缺氧诱导因子1α对牙髓干细胞成骨以及成血管的影响，为今后临界骨缺损的修复重建奠定一定的基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2018年3月至2020年6月在滨州医学院附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞选取2018年10月至2019年8月滨州医学院附属医院口腔颌面外科15例12-18岁患者因正畸治疗需要拔除的健康、完整的双尖牙，取所选离体牙牙髓组织进行原代培养。实验通过滨州医学院附属医院伦理委员会审核，所有患者及监护人均知情同意。
1.3.2 实验试剂及仪器胎牛血清(FBS500-S，澳大利亚AusGeneX公司)；DMEM培养基(KL-P0032，德国Merck/Sigma公司)；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(K1002S，美国Promega公司)；MTT溶液(N/A-896，美国 Ameko 公司)；缺氧诱导因子1α、β-actin 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；血管内皮生成因子抗体、基质细胞衍生因子1抗体、胎盘生长因子抗体、促血管生成素2抗体、人骨形态发生蛋白2抗体、骨钙蛋白抗体、Runt相关转录因子2抗体、GAPDH抗体(Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(0295G-HRP，美国Santa公司)；恒温培养箱(MIR-162-PC/MIR-262-PC，日本松下公司)；qRT-PCR仪(ABI 7500，美国Applied Biosystems公司)；酶标仪(Model550)、化学发光成像系统(ChemiDocXRS)购自美国Bio-Rad公司。
1.4 实验方法
1.4.1 牙髓干细胞的分离、培养及鉴定
(1)牙髓干细胞分离：选取临床上12-18岁患者因正畸治疗需要拔除的健康、完整的双尖牙，将牙齿置于4 ℃预冷的PBS(含5%100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)中冲洗两三分钟，转移至超净工作台，于无菌条件下劈开牙冠及牙根，取出牙髓，弃根尖约2 mm的牙髓组织。在PBS(含2% 100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)浸润下将剩余牙髓组织充分剪碎，置于含有Ⅰ型胶原酶(3 mg/mL)和Dispase(4 mg/mL)的消化液中，置于培养箱中消化一两个小时，期间每5-10 min拿出来振荡1次，组织松散后反复吹打，使其彻底分散；取出离心管，加入含血清的DMEM培养基终止消化，用70 μm筛子过滤细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，收集组织，用DMEM培养基(含体积分数为20%的胎牛血清，2 mmol/L谷胺酰氨，100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)重悬，接种于25 mm2的培养瓶中，在体积分数为5%CO2细胞培养箱37 ℃标准条件下培养，每两三天更换1次培养液，倒置显微镜下观察细胞生长情况及细胞形态，当细胞生长至70%-80%汇合状态时，按1∶3消化传代。
(2)牙髓干细胞培养：采用有限稀释法克隆化培养牙髓干细胞。将牙髓干细胞用Dispase(4 mg/mL)消化一两分钟，加入含血清的DMEM培养基终止消化，吹打混匀，制备成单细胞悬液。细胞计数，将细胞悬液依次稀释至1×108 L-1，1×106 L-1，1×103 L-1，将末次稀释的细胞悬液5 mL接种至60 mm培养皿中，放入CO2培养箱静置培养1周，待集落形成，进行单个集落的分离。
(3)牙髓干细胞鉴定：应用免疫荧光技术检测牙髓干细胞标记物Strol-1、CD146。将已消毒的20 mm盖玻片置于90 mm培养皿中，取15 mL细胞浓度为2×107 L-1的细胞悬液接种于培养皿中进行细胞爬片，5 d后进行免疫细胞化学染色鉴定，PBS清洗标本3次，每次1 min，冰丙酮固定15 min，空气干燥5 min，PBS清洗标本3次，每次2 min，0.5%Triton X-100(DPBS配)孵育1次20 min，PBS清洗标本3次，每次2 min，体积分数为3%H2O2孵育15 min，DPBS清洗标本3次，每次2 min，封闭血清孵育20 min，加入一抗2 ℃孵育过夜，PBS清洗标本3次，每次5 min，二抗工作液37 ℃孵育30 min，PBS清洗标本3次，每次5 min，DAB显色约5 min，蒸馏水洗2次，每次1 min，苏木素复染1 min，自来水洗30 min，树胶封固，荧光显微镜观察。
1.4.2 慢病毒载体构建、病毒包装及滴度测定根据GENEBANK中缺氧诱导因子1α基因合成过表达载体，通过重组后构建慢病毒载体Lenti-LacZ和Lenti-HIF-1α(载体信息为：HIF1A：Human，基因 ID3091，NM_001530，载体元件信息：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)。使用Invitrogen的慢病毒包装，将慢病毒载体Lenti-LacZ和Lenti-HIF-1α分别和包装质粒Packaging Mix共转染293T细胞，包装得到病毒进行滴度测定。将收集到的慢病毒液10倍比滴度稀释后感染牙髓干细胞，观察各稀释度孔病毒感染情况并计数，根据可数的最小梯度稀释孔的荧光细胞数目计算慢病毒滴度。
1.4.3 MTT法检测细胞活性用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM配成单细胞悬液，将牙髓干细胞分为2组：不做任何处理的对照组和过表达慢病毒转染的实验组，以每孔5×103个牙髓干细胞接种到96孔板，每孔体积200 μL；在CO2培养箱中分别培养1，4，7，14，21 d后，每孔加MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解；选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值(A值)为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.4.4 缺氧诱导因子1α基因转染后牙髓干细胞中缺氧诱导因子1α的表达将状态良好，处于对数生长期的牙髓干细胞用0.25%胰酶消化后离心，用DMEM培养基将细胞沉淀悬浮成单细胞悬液，细胞计数后按照每孔2×105个细胞接种于6孔板中，待细胞生长至70%-80%融合度时，按照测定的最佳感染复数值加入相应体积的慢病毒转染牙髓干细胞。对照组为空载组，不进行慢病毒转染。

转染后1，4，7，14，21 d收集细胞，提取总RNA，反转录合成cDNA，采用qRT-PCR法检测缺氧诱导因子1α mRNA表达水平，内参基因为GAPDH，相对表达量以2-ΔΔCt法表示。反应程序：95 ℃、10 min，95 ℃、10 s，55 ℃、25 s，72 ℃、2 min，循环40次；72 ℃、10 min。引物序列见表1。

1.4.5 蛋白印迹法检测缺氧诱导因子1α基因转染后牙髓干细胞成骨及成血管因子的表达转染后1，4，7，14，21 d收集细胞，PBS洗涤，提取各组细胞总蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度。配制SDS-PAGE凝胶，向蛋白样品中加入1/5体积的5×SDS电泳样品缓冲液，100℃加热3-5 min，离心10 min，取上清作SDS-PAGE电泳分离；电泳、转膜、封闭液室温平摇1 h，分别加血管内皮生成因子抗体、基质细胞衍生因子1抗体、促血管生成素2抗体、胎盘生长因子抗体、人骨形态发生蛋白2抗体、骨钙蛋白抗体、Runt相关转录因子2抗体、GAPDH抗体(1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h，加化学发光底物，Tanon 600图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值。
1.5 主要观察指标牙髓干细胞中标记物Strol-1、CD14的表达，缺氧诱导因子1α mRNA表达量，成骨及成血管因子蛋白表达量。
1.6 统计学分析所有数据以x±s表示。统计学分析采用SPSS10.0软件(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)，采用ANOVA方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过滨州医学院附属医院生物统计学专家审核。

讨论

成功的临界骨缺损修复首要的就是恢复骨骼器官原有的结构刚性和对机体组织的支持作用，这就包括了骨骼内的血管和细胞成分的恢复[7]。虽然相较于自体骨移植和同种异体骨移植，组织工程化骨在临床治疗后能很大程度改善骨缺损患者的预后，但由于临界骨缺损面积过大，组织工程化骨移植后骨化中心部位的血供往往不足，常处于缺氧状态，导致骨移植后固化效果不佳，甚至可能会出现坏死而导致修复失败的情况[8]。当使用组织工程化骨修复临界骨缺损时，需要通过植入复合细胞的支架，建立稳定的血运循环，才能使植入骨存活并正常行使功能[9]。血运重建已被认为是骨组织工程继种子细胞、支架材料、细胞因子三大要素之后的第四大要素，因此骨组织工程研究中的血管化问题的重要性日益彰显。如何解决组织工程化骨中缺氧及血管化的问题是临界骨缺损修复重建亟待解决的难题。
干细胞工程是当前热门的话题，干细胞能够分化为神经、血管和骨组织等，多项研究证明了干细胞能够用于治疗缺血性脑卒中、骨关节炎、骨损伤和心血管疾病等[10]。目前对于干细胞的研究主要集中于人胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞等[11]。近年来，骨髓间充质干细胞在骨再生、血管再生以及神经再生等再生医学方面被广泛研究[12-13]。
牙髓干细胞是从人恒牙牙髓中分离出来的，具有自我更新、高度分化能力[14]。多项研究均已证明牙髓干细胞能够分化为神经胶质细胞、神经元、软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞、成牙本质细胞和成肌细胞[15-16]。牙髓干细胞多取材于第三磨牙以及正畸拔除牙等健康恒牙的牙髓组织，取材方便，人恒牙牙髓干细胞作为一种独特的干细胞来源，可能会为骨组织工程开辟一条新路。CD146分子是间充质干细胞的特征性标记分子，它比其他标记分子更具有普遍性，已在多种组织中发现鉴定及分离间充质干细胞的有力证据，其中包括间充质来源的牙髓干细胞[17]。MATTEI等[18-20]发现牙髓干细胞位于血管周围，表达CD73、CD90、CD105、CD146、CD44和Stro-1等间充质干细胞特异性标记物，但不表达CD11b和CD19等造血标记物。该研究成功从15例健康完整的恒前磨牙牙髓中分离出牙髓干细胞，镜下观察细胞形态为短梭形，免疫荧光检测干细胞标记分子Stro-1和CD146阳性，通过以上结论可以明确成功分离出牙髓干细胞。
牙髓干细胞作为与骨髓间充质干细胞功能高度相似的干细胞群体，具有强大的血管生成能力，在某些特定条件下通过产生和分泌大量血管生成相关因子例如集落刺激因子、白细胞介素8、血管内皮生长因子、血小板源生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等，在这些因子的相互促进和作用下，血管内皮细胞将会增殖和存活[21-22]，产生毛细血管样结构，对于骨再生和血管再生都有重要意义[23-24]。
缺氧诱导因子1α是缺氧诱导因子1的一个亚基，它在缺氧环境下能够调控血管内皮生成因子等多种成血管相关因子的表达，是血管发生的核心调控因子，能够直接参与血管发生的全过程[25-26]。骨再生与血管再生两者之间具有密不可分的关系，以耦合的形式存在[27]。该研究探讨缺氧诱导因子1α基因对牙髓干细胞成血管以及成骨分化的影响，此次研究证明了缺氧诱导因子1α能够促进牙髓干细胞成骨及成血管分化。ZHANG等[28]通过大鼠视网膜实验证明在低氧条件下，缺氧诱导因子1α上调了血管内皮生长因子的表达，随着缺氧诱导因子1α水平的抑制，血管内皮细胞计数明显减少，且具有时间依赖性。CUI等[29]通过分析肝癌干细胞的细胞特性，发现当敲除肿瘤细胞中的缺氧诱导因子1α基因后，肝癌干细胞中的成血管相关因子的表达被抑制。通过沉默牙髓干细胞中的缺氧诱导因子1α基因，可以发现牙髓干细胞的成管能力减弱，小管成形率降低。该实验通过转染提高牙髓干细胞中缺氧诱导因子1α的表达，结果显示转染后1，4，7，14，21 d牙髓干细胞中成血管相关因子血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子1、促血管生成素2、胎盘生长因子以及成骨相关因子人骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白和Runt相关转录因子2的蛋白表达与对照组相比均有不同程度的阶段性上调，提示缺氧诱导因子1α具有促进牙髓干细胞成骨及成血管分化的作用，实验结果与既往学者研究结论相一致[30]，能够说明缺氧诱导因子1α能够促进牙髓干细胞成骨及成血管方向分化。
综上所述，实验采用了基因突变技术，对缺氧诱导因子1α基因进行区域性突变，并将其稳定转染至牙髓干细胞中，使其能够在体外环境稳定存活。通过体外检测成血管因子及成骨因子的表达，初步证实了缺氧诱导因子1α基因体外促进牙髓干细胞成骨及成血管分化的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

缺氧诱导因子1α基因修饰牙髓干细胞的体外成骨及成血管分化

Osteogenic and angiogenic differentiation of dental pulp stem cells modified by hypoxia-inducible factor-1 alpha gene in vitro

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