消肿止痛合剂抗皮瓣缺血再灌注损伤的代谢组学作用机制

doi:10.12307/2023.591

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (23): 3653-3659.doi: 10.12307/2023.591

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消肿止痛合剂抗皮瓣缺血再灌注损伤的代谢组学作用机制

何波1，何志军2，刘涛2，马岁录1

1甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃省兰州市 730030；2甘肃省中医院足踝骨科，甘肃省兰州市 730050

收稿日期:2022-08-09 接受日期:2022-10-22 出版日期:2023-08-18 发布日期:2023-01-16
通讯作者: 何志军，教授，主任医师，硕士研究生导师，甘肃省中医院足踝骨科，甘肃省兰州市 730050
作者简介:何波，男，1991年生，甘肃中医药大学在读硕士，主要从事中医药防治骨与软组织疾病、皮瓣移植等方面的研究。
基金资助:
甘肃省中医药项目(GZKZ-2020-2)，项目负责人：何志军；兰州市人才创新创业专项(2019-RC-63)，项目负责人：何志军；国家自然科学基金(81660802)，项目负责人：何志军

Mechanism of Xiaozhong Zhitong Mixture against ischemia-reperfusion injury of skin flaps based on metabolomics

He Bo1, He Zhijun2, Liu Tao2, Ma Suilu1

1College of Traditional Chinese Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China; 2Department of Foot and Ankle Orthopedics, Gansu Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2022-08-09 Accepted:2022-10-22 Online:2023-08-18 Published:2023-01-16
Contact: He Zhijun, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Foot and Ankle Orthopedics, Gansu Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:He Bo, Master candidate, College of Traditional Chinese Medicine, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
Gansu Province Traditional Chinese Medicine Project, No. GZKZ-2020-2 (to HZJ); Lanzhou Special Project for Talent Innovation and Entrepreneurship, No. 2019-RC-63 (to HZJ); National Natural Science Foundation of China, No. 81660802 (to HZJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

皮瓣缺血再灌注损伤：是指以往发生过缺血性改变的组织重新开放血流供应时，组织的缺血状态非但没有改善，反而加快了皮瓣组织缺血性坏死的进程。皮瓣缺血再灌注损伤是导致皮瓣移植术后坏死的主要原因。
代谢组学：是通过对生物体内的代谢物进行定性和定量分析，揭示生物体中代谢产物的变化规律。该研究利用代谢组学阐述皮瓣缺血再灌注损伤代谢过程的变化，了解疾病的发展过程、体内物质的代谢途径及发病机制。

背景：课题组前期研究证实消肿止痛合剂能够缓解皮瓣缺血再灌注损伤，但关于其代谢组学方面的作用机制研究尚未报道。
目的：探究消肿止痛合剂抗大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制。
方法：建立大鼠皮瓣缺血再灌注损伤模型，利用代谢组学相关技术分析正常大鼠、模型大鼠以及给予消肿止痛合剂干预后大鼠血清样本中内源性代谢物的差异，检索及鉴定生物标志物并构建代谢通路。

结果与结论：消肿止痛合剂能够显著减轻皮瓣缺血再灌注损伤模型大鼠皮瓣组织的病理变化。筛选出显著性差异代谢物丙二酸和3-(3羟基苯基)丙酸，将差异代谢物导入在线数据库MetaboAnalyst 4.0及KEGG数据库进行代谢通路分析，得出消肿止痛合剂干预大鼠皮瓣缺血再灌注损伤后代谢的途径涉及嘧啶代谢、苯基丙氨酸代谢等代谢通路。结果表明，消肿止痛合剂通过对嘧啶代谢、苯基丙氨酸等代谢通路对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤进行调节，为阐明消肿止痛合剂治疗大鼠皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制提供了理论依据。

https://orcid.org/0000-0003-2787-0033(何波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 消肿止痛合剂, 代谢组学, 皮瓣缺血再灌注, 丙二酸, 3-(3羟基苯基)丙酸

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have confirmed that Xiaozhong Zhitong Mixture can alleviate ischemia-reperfusion injury of skin flaps, but its metabolomic mechanism has not been reported.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of Xiaozhong Zhitong Mixture against ischemia-reperfusion injury of rat skin flaps.
METHODS: A rat skin flap ischemia-reperfusion injury model was established. Related metabolomics techniques were used to analyze the endogenous levels of metabolite samples from normal rats, model rats and rats after intervention with Xiaozhong Zhitong Mixture. Relevant biomarkers were retrieved and identified and metabolic pathways were then constructed.
RESULTS AND CONCLUSION: Xiaozhong Zhitong Mixture could significantly reduce the pathological changes of skin flap tissue in rats with skin flap ischemia-reperfusion injury. Significantly differential metabolites, including malonic acid and 3-(3-hydroxyphenyl)propionic acid, were identified and imported into MetaboAnalyst 4.0 and KEGG databases for metabolic pathway analysis. After intervention, the metabolic pathways of Xiaozhong Zhitong Mixture included pyrimidine metabolism and phenylalanine metabolism. To conclude, Xiaozhong Zhitong Mixture improves ischemia-reperfusion injury of rat skin flap by regulating the metabolic pathways such as pyrimidine and phenylalanine metabolic pathways, which thereby provides a theoretical basis for clarifying the mechanism of Xiaozhong Zhitong Mixture in the treatment of ischemia-reperfusion injury of rat skin flap.

Key words: Xiaozhong Zhitong Mixture, metabolomics, flap ischemia-reperfusion, malonic acid, 3-(3hydroxyphenyl)propionic acid

中图分类号:

何波, 何志军, 刘涛, 马岁录. 消肿止痛合剂抗皮瓣缺血再灌注损伤的代谢组学作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3653-3659.

He Bo, He Zhijun, Liu Tao, Ma Suilu. Mechanism of Xiaozhong Zhitong Mixture against ischemia-reperfusion injury of skin flaps based on metabolomics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(23): 3653-3659.

图/表（结果） 15

2.1 病理组织观察结果由图1可见，正常组皮下未见淋巴细胞浸润和纤维组织增生，纤维组织排列规整，无炎症反应。模型组淋巴细胞大量增多，纤维组织明显增生并且排列不规整。消肿止痛合剂组的淋巴细胞数量和纤维组织增生明显减少，纤维组织排列比较规整，炎症反应明显减轻，说明消肿止痛合剂组可以明显缓解皮瓣组织的炎症症状。

2.2 质量控制样本质谱总离子流图(TIC)比对将质量控制样本正、负离子检测模式下的质谱总离子流图分别进行谱图叠加比较，见图2和图3，结果表明各色谱峰的保留时间和响应强度大致吻合，表明实验因仪器误差导致的变异不大，数据可靠。

2.3 主成分分析(PCA)得分图与其系统稳定性分析主成分分析得分图如图4，5所示。t[1]代表主成分1，t[2]代表主成分2。正常组与模型组的位置分布分离趋势十分明显，说明皮瓣缺血再灌注模型大鼠皮瓣组织代谢物产生了较为明显的差异。模型组与消肿止痛合剂组分离明显组间差异较大，说明给予消肿止痛合剂干预后的内源性代谢物发生了明显改变。

2.4 正交偏最小二乘方法判别分析(OPLS-DA) 建立正交偏最小二乘法判别分析模型，t[1]代表预测主成分。模型评价参数(Q2，R2Y)见表1，R2、Q2≥0.5，模型稳定可靠。建立模型组vs.正常组和消肿止痛合剂组vs. 模型组的正交偏最小二乘方法判别分析模型，模型得分图见图6和图7，正常组与模型组、模型组与消肿止痛合剂组的分离显著，聚类程度好，说明代谢产物在各比较组之间存在显著差异。图8和图9显示了该两组正交偏最小二乘方法判别分析模型的置换检验图，其中Q2截距小于0.05，表明实验数据建立的正交偏最小二乘方法判别分析模型可靠，不存在过拟合。

2.5 单变量统计分析及差异代谢物筛选根据正交偏最小二乘法判别分析模型得到的变量权重值(VIP)结合t检验以及差异倍数(FC)分析。此次实验以VIP > 1且P < 0.05为标准，筛选差异代谢物。其中，FC > 2且P < 0.05的物质为该比较组所有上调差异代谢物，FC < 0.5且P < 0.05的物质为该比较组所有下调差异代谢物。正常组与模型组筛选差异代谢标志物数共138个，其中上调31个，下调34个。模型组与消肿止痛合剂组筛选差异代谢标志物数共115个，其中上调39个，下调38个。图10和图11分别显示了模型组vs.正常组和消肿止痛合剂组vs.模型组的火山图，图中绿色点为下调的代谢物，红色点为上调代谢物。

2.6 层次聚类分析图12显示模型组vs.消肿止痛合剂组的显著性差异代谢物的层次聚类结果。纵轴和横轴分别代表生物标志物与样本，红色和蓝色分别表示含量最高和最低，颜色越浅反映变量值越小。从图中可以看出，两组代谢物分界清楚，说明很容易识别。

2.7 代谢通路富集分析将已鉴定的代谢物导入在线数据库MetaboAnalyst 4.0及KEGG数据库进行代谢通路分析，见图13。

结果表明嘧啶代谢、苯基丙氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸、β-丙氨酸、胆汁分泌、烟酸和烟酰胺代谢、赖氨酸降解等是其重要的代谢途径，而消肿止痛合剂通过对上述通路的调控缓解皮瓣缺血再灌注损伤。
2.8 共同差异代谢标志物分析筛选正常组vs.模型组、模型组vs.消肿止痛合剂组的共同代谢标志物并代入代谢通路进行分析，得出共同差异代谢标志物共2个：丙二酸和3-(3羟基苯基)丙酸，且均在模型组中表达下调，在消肿止痛合剂组中表达上调，见表2。

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引言

皮瓣的缺血再灌注损伤是指发生过缺血的组织在血流重新开放后，组织缺血不仅没有改善，反而加重，最终导致皮瓣坏死的现象[1]。据报道，缺血再灌注普遍存在氧化应激和炎性反应，相关研究证实氧化应激和炎性反应是缺血再灌注最基本的病理生理改变[2]。而关于皮瓣缺血再灌注损伤的炎症学说在最近也引起广泛关注，许多研究表明皮瓣缺血再灌注损伤大鼠外周血促炎细胞因子水平增高[3]，提示皮瓣缺血再灌注可能是一种炎症性疾病[4]。炎性反应和氧化应激广泛存在于皮瓣缺血再灌注损伤及其并发症的发生发展过程
中[5]。研究表明，缺血再灌注损伤是多种细胞参与及多因子介导的复杂的病理生理过程[6]，其中炎症细胞和炎症因子扮演了重要的角色[7]。如何运用现代技术对皮瓣缺血再灌注损伤的发病机制进行阐述，抑制炎性反应和氧化应激，有效防治皮瓣坏死及提高皮瓣移植术后皮瓣存活率，是现代医学研究的重要任务之一。
消肿止痛合剂由桃仁、川芎、赤芍、红花、当归等药物构成，具有“活血化瘀、消肿止痛”的功效，是甘肃省中医院院内制剂，已用于临床多年，效果明显。皮瓣缺血再灌注损伤是皮瓣移植术后出现皮瓣坏死的重要原因，属于中医“血瘀”范畴。前期研究表明消肿止痛合剂对于皮瓣缺血再灌注损伤具有积极的调节作用，能够显著提高皮瓣移植术后的存活率[8-10]。尽管消肿止痛合剂在抗皮瓣缺血再灌注损伤方面的作用明显，但具体机制仍缺乏相关研究。
代谢组学是通过对生物体内的代谢标志物进行定性和定量分析，揭示生物体在新陈代谢过程中代谢产物的动态变化规律，寻找代谢物与生物体在生理病理方面的关系，有利于了解疾病的变化过程、体内物质的代谢途径及发病机制的阐
释[11]。皮瓣缺血再灌注损伤的发生和发展与体内的代谢关系密切，而代谢组学可以全面地从生物代谢的角度揭示机体生命活动的本质，而关于皮瓣缺血再灌注损伤的差异性血清代谢标志物尚一直未研究。该研究利用大鼠皮瓣缺血再灌注损伤模型和代谢组学技术，揭示消肿止痛合剂干预后皮瓣组织内源性代谢物的变化和相关代谢通路，探索其发病机制，为临床应用提供新的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用差异倍数分析以及t 检验等。
1.2 时间及地点实验于2022年1-3月在甘肃中医药大学动物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠30只，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，雌雄各半，体质量 200-220 g，实验动物生产许可证号：SCXK(甘)2020-0001，使用许可证号：SYXK(甘)2020-0009，合格证编号：NO.62001000000533。
实验方案经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准，审批号：2021-024。实验过程遵循国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下手术，并最大限度减少其痛苦和死亡。
1.3.2 实验药物、仪器和试剂消肿止痛合剂由甘肃省中医院制剂室按制备工艺制成，注册文号：甘卫普制准字(1997)-202-04，批号：20051122，规格：250 mL/瓶。质谱：Triple TOF 5600+质谱仪，色谱：超高压液相色谱仪，色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 µm，2.1 mm×100 mm column。试剂：乙腈(millipore，1.00030.4008)、乙酸铵(Sigma，
73594)、甲醇(millipore，1.06007.4008)、氨水(Merck，105426)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组将30只SPF级SD大鼠随机分为3组：正常组、模型组、消肿止痛合剂组，各组10只。
1.4.2 动物造模与给药参考Schmauss等[12]文献所述方法进行造模：1%戊巴比妥(5 mL/kg)腹腔麻醉3组SD大鼠，俯卧位固定，正常组切取背部约 5 cm×6 cm 皮肤及其皮下筋膜，未游离皮瓣。模型组与消肿止痛合剂组完全游离背部大小约5 cm×6 cm带蒂皮瓣，并使用微血管夹夹闭双侧胸背浅动脉2 h，2 h后去除血管夹，进行再灌注1 h，在显微镜下观察血运恢复情况，模拟皮瓣的缺血再灌注损伤，用6-0医用聚酰胺缝合线缝合皮瓣。造模后24 h，消肿止痛合剂组给予消肿止痛合剂灌胃，给药量按70 kg 成人体表面积折算等效剂量，按1.8 mL/(kg·d)灌胃，1 mL/100 g(每毫升含生药0.09 g)；正常组、模型组灌胃同体积生理盐水，连续20 d。
1.4.3 标本采集各组大鼠于末次给药7 d后禁食，麻醉处理后，取4 mL腹主动脉血放进离心管中，3 200 r/min离心10 min取上清，无菌离心管分装，-20 ℃冰箱保存待用；分离皮瓣组织进行苏木精-伊红染色。
1.4.4 组织学评价对皮瓣组织进行苏木精-伊红染色，过程如下：脱水石蜡切片后，脱蜡、水化、苏木素染色、分化、伊红染色、脱水、封固[13]，显微镜下观察并拍照。
1.4.5 色谱分离血清放于4 ℃进样器中，采用超高效液相色谱系统(UHPLC)使用HILIC色谱柱进行分离。进样量5 μL，柱温25 ℃，流速0.3 mL/min。色谱流动相A：水+25 mmol/L乙酸铵+25 mmol/L氨水；乙酸铵+25 mmol/L氨水；色谱流动相B：乙腈；色谱梯度洗脱程序如下：0-0.5 min，95% B；0.5-7 min，95%-65% B；7-9 min，65%-40% B；9-10 min，40% B；10-11.1 min，40%-95% B；11.1-16 min，95% B。样本中插入质量控制样品，用于监测和评价实验数据可靠性和系统稳定性。
1.4.6 质谱采集样品采用电喷雾电离进行正负离子模式检测。采用超高效液相色谱系统(UHPLC)使用HILIC色谱柱进行分离后用质谱仪进行质谱分析。电喷雾电离源条件如下：离子源气体1：60 psi，离子源气体2：60 psi，窗帘式气体：30 psi，源温：600 ℃，离子缓冲电压浮动±5 500 V；TOF MS scan m/z range：60-1 200 Da，产品扫描m/z range：25-1 200 Da，TOF MS扫描积累时间 0.15 s/spectra，产品扫描积累时间0.03 s/spectra；二级质谱采用information dependent acquisition获得，散流电位：±60 V，碰撞能量：30 eV，IDA设置如下：Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：6。
1.4.7 数据处理与分析数据经过格式转换后采用MSDIAL软件中的程序XCMS进行峰对齐并提取峰面积。利用精确质量数匹配和二级谱图匹配方式筛选代谢物，检索MassBank等数据库。提取数据后剔除组内缺失值> 50%的离子峰，应用软件SIMCA-P 14.1进行识别，数据在经过单位方差比例预处理后进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。用 SPSS 22.0 统计软件进行t 检验以及差异倍数(FC)分析，以变量权重值(VIP) > 1和FC > 2 或 FC < 0.5，且P < 0.05 作为筛选标准筛选差异代谢物并对其鉴定，通过与对照品比对二级质谱碎片，以及KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)代谢物数据库匹配确定代谢标志物。此外，通过分层聚类分析观察标志物的合理性和变化趋势。最后利用MetaboAnalyst 4.0数据库(https:// www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home. xhtml)进行代谢通路分析[14]。
1.5 主要观察指标利用代谢组学相关技术分析正常大鼠、模型大鼠以及给予消肿止痛合剂干预后大鼠血清样本中内源性代谢物的差异，检索及鉴定生物标志物并构建代谢通路。

讨论

皮瓣缺血再灌注损伤是一个非常复杂的病理生理过程，主要包括氧自由基增多、内皮细胞损伤、炎症反应等多个部分，各个部分相互作用，最终导致细胞凋亡。相关研究表明，消肿止痛合剂对大鼠皮瓣缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，主要是其能抑制炎症递质的释放。研究发现，消肿止痛合剂通过嘧啶代谢和苯基丙氨酸代谢通路可以有效清除自由基和活性氧，进而调节细胞膜的代谢，从而有效抑制氧化应激。
3.1 嘧啶代谢丙二酸是一种线粒体毒素，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，能够有效地可逆抑制琥珀酸脱氢酶[15]。研究表明琥珀酸脱氢酶能够显著促进线粒体活性氧的产生[16-22]，而线粒体活性氧的产生被证明是缺血再灌注损伤早期重要的驱动因素。据报道，琥珀酸脱氢酶在缺血再灌注损伤过程中诱导氧化应激主要是通过创造有利于活性氧生成的环境因素来实现的。研究表明，在缺血期间，线粒体代谢物琥珀酸选择性的积累[23-25]，再灌注后重新引入的氧气会迅速氧化积累的琥珀酸盐[24，26]，而丙二酸通过有效抑制琥珀酸的积累和氧化来缓解缺血再灌注损伤[27-29]，其机制是丙二酸通过二乙酰氧甲基丙二酸二酯传递释放到组织来抑制琥珀酸脱氢酶，减少缺血再灌注过程中线粒体活性氧的病理生成，保留了线粒体呼吸作用，减少了线粒体通透性。而琥珀酸脱氢酶被丙二酸抑制后，线粒体逐渐恢复正常的功能，三磷酸腺苷/二磷酸腺苷的比值恢复正常，从而为缺血再灌注损伤早期提供治疗作用。此研究中，模型组丙二酸水平明显下降，消肿止痛合剂使丙二酸水平明显升高，表明消肿止痛合剂可以通过上调丙二酸水平来抑制氧化应激反应，从而预防皮瓣缺血再灌注损伤。
3.2 苯基丙氨酸代谢 3-(3-羟基苯基)丙酸是槲皮素微生物代谢产物，相关研究表明，3-(3-羟基苯基)丙酸不仅能够显著提高抗氧化酶中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，而且能够有效抑制红细胞中活性氧的增加。3-(3-羟基苯基)丙酸还可以降低镉诱导的超前氧化蛋白产物和丙二醛水平的升高[30]。此外，3-(3-羟基苯基)丙酸还能够提升抗氧化剂和自由基清除剂中谷胱甘肽的水平。研究表明，谷胱甘肽是人体重要的抗氧化剂、还原缓冲剂和生物活性物质，它对氧化还原系统发挥重要的活化作用，也具有维持细胞正常生理活动的作用。皮瓣在缺血后产生大量的自由基，并攻击富含不饱和脂肪酸的血管和神经膜，从而生成脂质氢过氧化物和过氧化物。而细胞在丢失不饱和脂肪酸后，其结构的完整性遭到破坏，主要表现为膜的通透性、屏障功能和离子转运功能均受到严重影响，进而导致细胞坏死。谷胱甘肽能够通过激活巯基酶来有效清除活性氧和自由基，促进蛋白质代谢、脂肪代谢以及碳水化合物代谢，最后调节细胞膜代谢，防止细胞坏死[31-33]。因此，上述研究表明3-(3-羟基苯基)丙酸主要通过上调谷胱甘肽水平来有效清除自由基和活性氧，进而调节细胞膜的代谢，从而有效抑制氧化应激。该研究表明，与正常组相比，模型组3-(3-羟基苯基)丙酸水平明显下降，与模型组相比，消肿止痛合剂组3-(3羟基苯基)丙酸水平明显升高，表明消肿止痛合剂通过上调3-(3-羟基苯基)丙酸水平来上调谷胱甘肽水平，进而清除机体内过多的自由基和活性氧，从而有效抑制了氧化应激，缓解皮瓣缺血再灌注损伤，最终提高皮瓣移植术后的存活率。
综上，该研究通过建立大鼠皮瓣缺血再灌注损伤模型以及采用色谱-质谱联用技术及代谢组学相关技术，探究皮瓣缺血的发病机制以及消肿止痛合剂对皮瓣缺血再灌注损伤的保护机制。经统计分析筛选得到代谢物丙二酸和3-(3羟基苯基)丙酸，通过嘧啶代谢、苯基丙氨酸代谢等代谢通路起到调节作用。该研究丰富了消肿止痛合剂保护皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制，也为皮瓣缺血再灌注损伤提供了新的治疗方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

消肿止痛合剂抗皮瓣缺血再灌注损伤的代谢组学作用机制

Mechanism of Xiaozhong Zhitong Mixture against ischemia-reperfusion injury of skin flaps based on metabolomics

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