扫描电镜下可见，相转变溶菌酶已经成功加载到了氧化锆表面，由均匀的球状体组成。利用相转变溶菌酶纳米薄膜改性后的氧化锆表面，在模拟体液中孵育第3天就已仿生矿化出羟基磷灰石晶体；在模拟体液中孵育10 d后，氧化锆表面己矿化出形貌规整、成分单一的羟基磷灰石涂层，而未被改性的氧化锆表面没有晶体出现。
2.2   改性前后氧化锆试件的X射线光电子能谱仪检测   见图2。

X射线光电子能谱显示，未改性氧化锆表面主要元素为C1s、N1s、O1s、Zr3d；由相转变溶菌酶改性后的氧化锆片表面出现了特征性的P2p(133 eV)和S2p(165 eV)，此波峰的出现来自于相转变溶菌酶中的三(2-羧乙基)磷酸盐溶液，同时Zr3d峰的消失表明相转变溶菌酶已经成功结合到氧化锆片表面；经相转变溶菌酶改性后介导形成的羟基磷灰石涂层，可以观察到C1s和N1s峰下降，出现了Ca2p峰。因此，再一次证明利用相转变溶菌酶纳米薄膜为模板可以成功地矿化出羟基磷灰石涂层。
2.3   羟基磷灰石涂层改性后氧化锆的结构与成分分析    见图3。

X射线多晶衍射结果显示，羟基磷灰石涂层改性后的氧化锆具有(200)(002)(211)(300)晶面，这4个晶面是羟基磷灰石中的典型晶面，说明在相转变溶菌酶表面所形成的无机物就是羟基磷灰石而不是磷酸钙等其他物质。显微共焦激光拉曼光谱可见几个峰，分别是428 cm-1处表示P-O键和593 cm-1处代表O-P-O键的弯曲振动以及962 cm-1处P-O的伸缩振动，在962 cm-1处的最高峰是羟基磷灰石晶体最具代表性标志。能量色散X射线光谱显示，羟基磷灰石涂层改性后的氧化锆表面形成的Ca/P比为1.66，该比值与天然骨组织中的羟基磷灰石中的Ca/P比接近。
2.4   改性前后氧化锆试件的表面接触角及粗糙度分析   实验结果表明，氧化锆片在经过相转变溶菌酶改性后进行羟基磷灰石矿化的过程中，相应的接触角大小也发生了显著变化。与未改性氧化锆片相比，经相转变溶菌酶改性后氧化锆片表面的接触角稍微降低，亲水性有所增加；在相转变溶菌酶改性的基础上进行羟基磷灰石矿化后，可以观察到氧化锆片表面的接触角明显缩小，增加了材料的表面亲水性。从以上结果可以看出，在相转变溶菌酶改性的基础上进行羟基磷灰石矿化，不但不会损害原有基材表面良好的亲水性，反而增加了基材表面的可湿性。表面粗糙度测试显示，改性前后材料之间的表面粗糙度比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。



2.5   改性前后氧化锆试件的机械性能检测   用商用3M胶带对羟基磷灰石涂层的氧化锆片进行撕拉测试，3M胶带的黏结强度大于1.23 N/cm，在进行撕拉过后，羟基磷灰石涂层稳定地黏附在经过相转变溶菌酶改性过后的氧化锆片表面；超声清洗前后，扫描电镜下可见羟基磷灰石涂层仍然稳定地黏附在氧化锆片表面，见图5。

在维氏硬度测量中，所有样品表面均可以清楚看到边缘，见图6A。各组氧化锆片的维氏硬度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6B，证明在氧化锆片表面不论是进行相转变溶菌酶改性还是负载羟基磷灰石涂层，对材料本身的硬度没有产生任何影响。各组氧化锆片的断裂强度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6C。



2.6   改性前后氧化锆试件表面的细胞活性   CCK-8检测显示，培养第1天，3组材料上的细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；随着培养时间的延长，各组细胞增殖吸光度值增加，相转变溶菌酶改性组培养3，5，7 d的细胞增殖吸光度值大于未改性处理组(P < 0.05)，羟基磷灰石涂层改性组培养3，5，7 d的细胞增殖吸光度值大于相转变溶菌酶改性组(P < 0.05)，见图7。

培养3 d，3组材料表面的细胞碱性磷酸酶活性比较差异无显著性意义(P > 0.05)；随着培养时间的延长，各组材料表面的细胞碱性磷酸酶活性增加，相转变溶菌酶改性组培养7，14 d的细胞碱性磷酸酶活性高于未改性处理组(P < 0.05)，羟基磷灰石涂层改性组培养7，14 d的细胞碱性磷酸酶活性高于相转变溶菌酶改性组(P < 0.05)，见图8。



2.7   改性前后氧化锆试件表面的细胞黏附   见图9。

扫描电镜下可见，培养12 h，MC3T3-E1细胞在两组氧化锆材料表面紧密贴附，细胞为纺锤体或多边形，细胞附着及铺展良好；培养3 d，两组材料表面的MC3T3-E1细胞数量增加，其中羟基磷灰石涂层组的细胞数量更多并出现细胞连接。
2.8   氧化锆试件的细胞相容性   由CCK-8实验、碱性磷酸酶活性检测及细胞黏附实验结果可知，羟基磷灰石涂层氧化锆试件具有良好的细胞相容性。

近年来氧化锆材料快速发展，因其良好的生物相容性、力学性能以及美学效果被广泛应用于口腔种植领域[1-2]。但是氧化锆材料是一种生物惰性材料，生物活性差，所以需要对种植体表面改性来加强种植体与骨组织之间的结合力[3]。

羟基磷灰石具有与生物体硬组织相似的化学结构和成分，是具有理想骨反应的生物活性材料[4-5]。羟基磷灰石具有良好的生物相容性，是骨科和牙科植入物或植入物部件的理想候选材料[6-7]。制备羟基磷灰石涂层最常用的方法是等离子喷涂法，这种方法易使涂层分解，出现裂纹或发生剥脱，导致涂层在体内稳定性差；对于复杂形态的种植体，此工艺也很难在其表面形成厚度均匀的涂层[8-9]，因此寻找一种可靠的种植体表面改性方法成为一种趋势。

此次实验利用新型相转移溶菌酶材料对氧化锆表面进行功能改性，此种材料可以在各种材料表界面实现可控组装与黏附，从而对材料表面进行初步改性[10]。与目前所使用的聚多巴胺涂层不同，相转变溶菌酶可以很容易地在任意材料表面上形成具有可控厚度和形态以及强黏附强度的坚固纳米膜涂层，因为相转变溶菌酶纳米薄膜呈现出多种类型的官能团，可以实现与底层基底稳定可靠的多重结合，而不是在聚多巴胺涂层表面形成单一官能团结构[11-12]。

此次实验以相转变溶菌酶为模板诱导矿化羟基磷灰石涂层，该操作过程简便、绿色环保，为羟基磷灰涂层的制备提供了新的技术指导。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   种植体表面改性实验，组间比较采用单因素方差分析与LSD检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年5月至2021年10月在天津医科大学口腔医院中心实验室完成。
1.3   材料   3Y-TZP氧化锆全瓷材料(松下健康医疗器械有限公司)；碳化硅砂纸；碱性磷酸酶测试盒、CCK-8 试剂盒、HEPES缓冲液(北京索莱宝)；溶菌酶(Sigma公司)；三(2-羧乙基)磷酸盐(Sigma公司)；模拟体液(北京中科迈晨科技有限公司)；DMEM 培养基、胎牛血清(Hyclone)；扫描电子显微镜(TM3030，Hitachi)；X射线光电子能谱仪(AXIS ULTRA，Kratos)；X射线多晶衍射仪[Smart Lab (9)，Rigaku]；拉曼光谱(Raman，Via Reflex，Renishaw)；接触角测量仪(JC2000D1，中国)；粗糙度仪(SR300，中国)；WDW-20台式微机控制电子万能试验机(北京时代四合科技有限公司，中国)。
1.4    实验方法   
1.4.1   氧化锆表面相转变溶菌酶诱导羟基磷灰石涂层的制备

氧化锆表面处理：选用直径为15 mm、厚度2 mm的氧化锆片，实验前依次使用400，600，800目砂纸进行打磨抛光，之后用超声清洗机进行清洗，浸入体积分数75%的乙醇溶液中清洗30 min，结束之后使用去离子水清洗30 min。室温条件下均用紫外线灭菌灯照射5 h。

相转变溶菌酶改性：将5 g/L的溶菌酶溶液和50 mmol/L的三(2-羧乙基)磷酸盐溶液按照1∶1的体积比进行混合，可得到溶菌酶相转化产物，立即使用移液枪滴加在抛光后的氧化锆片上，反应2 h。反应结束后，镊子夹住锆片，用无菌去离子水进行漂洗，N2气吹干。

诱导羟基磷灰石涂层：将相转变溶菌酶改性氧化锆片放入12孔板内，使用移液枪吸取模拟体液滴加进每个孔板内，每孔2 mL；放入恒温箱，每隔12 h换液。培养3，10 d后取样，用无菌去离子水清洗样品，自然干燥。后续实验使用培养10 d的试样。
1.4.2    氧化锆试件形貌表征与元素分析    使用扫描电镜来观察改性前后氧化锆试件表面的形貌特征，所有试件表面扫描前均进行喷金处理。使用X射线光电子能谱分析改性前后氧化锆试件表面的元素，以证明在相转变溶菌酶改性基础上形成了羟基磷灰石涂层。
1.4.3    羟基磷灰石涂层结构分析    使用X 射线多晶衍射检测锆片表面羟基磷灰石晶体结构。对羟基磷灰石涂层组的样本进行拉曼测试，分析羟基磷灰石涂层结构，激发光源：λ=532 nm，测试范围：300-3 000 cm-1。使用能量色散 X射线光谱仪检测羟基磷灰石涂层组样本表面某一点的元素，分析材料表面的钙磷比。
1.4.4    氧化锆试件表面接触角及粗糙度测试    通过接触角测量仪评价改性前后氧化锆材料的亲水性能，使用去离子水滴一滴在氧化锆表面，测量水滴与样品表面的接触角并使用软件拍照记录。使用粗糙度仪测量改性前后氧化锆材料表面的粗糙度，每次为4 mm的测试长度，每组选择6个样品。
1.4.5    氧化锆试件机械性能测试

3M胶带撕拉测试：商用3M胶带的黏附强度高于1.23 N/cm。将羟基磷灰石涂层氧化锆试件用去离子水冲洗干净并真空干燥，之后经过3M胶带使用同等力撕拉3次之后，扫描电镜下观察表面形貌。

超声清洗测试：利用超声波清洗器测试羟基磷灰石涂层的稳定性能。在50 mL离心管中装入10 mL去离子水， 将羟基磷灰石涂层氧化锆试件放入离心管，在220 kV、50 Hz的超声清洗器中反复超声清洗3次，超声1 h后使用去离子水冲洗并干燥，扫描电镜下观察表面形貌。

维氏硬度：使用硬度测试机检测改性前后氧化锆样品的维氏硬度，每组分别选择6个样品进行测量，载荷为5 kg。

断裂强度：使用万能材料试验机对改性前后氧化锆样本进行断裂强度测试，每组重复9个样本，压头以1 mm/min的速度加载到材料表面，直至样本断裂，检测其断裂强度。
1.4.6    氧化锆试件表面细胞增殖及碱性磷酸酶活性检测

CCK-8实验：使用CCK-8法分析改性前后氧化锆试件表面的细胞增殖情况。将未改性、相转变溶菌酶改性与羟基磷灰石改性氧化锆片分别置于无菌24孔板内，每组试样设置5个平行复孔；向24孔板内滴加MC3T3-E1细胞(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)悬液，细胞浓度为1×107 L-1，每孔1 mL，放入培养箱中培养。在各培养时间点(1，3，5，7 d)，加入CCK-8溶液，继续孵育4 h后，用酶标仪测定在 490 nm 处的吸光度值。

碱性磷酸酶活性检测：将未改性、相转变溶菌酶改性与羟基磷灰石涂层改性氧化锆片分别置于无菌24孔板内，每组试样设置5个平行复孔；向24孔板内滴加MC3T3-E1细胞悬液，细胞浓度为1×107 L-1，每孔1 mL。培养3，7，14 d后，PBS冲洗试件，加入细胞裂解液，10 000 r/min离心10 min，收集细胞裂解物，根据BCA蛋白检测试剂盒说明书测得蛋白浓度；按照碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明书检测碱性磷酸酶活性，使用酶标仪在510 nm处测得吸光度值。
1.4.7    氧化锆试件表面细胞黏附实验    将未改性处理氧化锆片与羟基磷灰石涂层改性氧化锆片分别置于无菌24孔板中，向24孔板内滴加MC3T3-E1细胞悬液，细胞浓度为1×107 L-1，每孔1 mL。培养12 h和3 d，使用PBS静洗试件10 min，清洗2次；加入2.5%戊二醛溶液固定4 h；依次在不同体积分数(体积分数30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%)的乙醇中脱水15 min，放置至完全干燥；表面喷金后置于扫描电镜下观察。
1.5   主要观察指标   各组氧化锆试件的接触角、粗糙度、机械性能及细胞相容性。
1.6   统计学分析   采用SPSS 20.0统计软件进行分析。实验数据均采用单因素方差分析，并结合LSD检验进行两两比较。P < 0.05认为差异有显著性意义。统计学方法已经天津医科大学生物统计学专家审核。

相转移溶菌酶具有足够强的黏附能力，在超声清洗、各种极性和非极性有机溶剂以及酸、碱、无机盐、表面活性剂和氧化剂中也完好无损[10]。相转移溶菌酶纳米膜中淀粉样结构的黏附，使得羟基磷灰石与体内骨和牙齿等基质之间具有出色的黏结稳定性[13-14]。同时还有研究表明，相转移溶菌酶对革兰阳性/阴性菌和真菌具有持久的广谱抗菌效果，并具有防污和抗生物膜活性，而且不产生任何其他环境危害[15]。此次实验通过使用相转变溶菌酶作为初始层对氧化锆表面进行改性，为氧化锆表面赋予了生物活性，为后续建立羟基磷灰石涂层奠定了基础，也是连接氧化锆基材与羟基磷灰石涂层的桥梁，为在氧化锆表面加载羟基磷灰石涂层提供了一种新的方法。通过扫描电镜图像可以看到相转移溶菌酶形成了纳米球体均匀地附着在氧化锆片的表面，实现了对氧化锆表面的初步改性；X射线光电子能谱分析结果也进一步证明了相转变溶菌酶被成功加载到了氧化锆片表面，相转变溶菌酶预处理后的基材表面可以连接许多物质，为后续羟基磷灰石涂层的形成奠定了基础。

羟基磷灰石自20世纪80年代引入后，便用于研究骨组织与植入物之间的骨整合问题[16]。羟基磷灰石具有与骨相似的矿物成分，因此显示出有利于组织反应的生物活性，从而增强骨整合[17]。通过X射线光电子能谱结果对氧化锆片上的每一层涂层进行元素分析，以各个涂层特征性的元素出现以及被覆盖的某些涂层元素的减少或者消失来证明某一涂层的成功负载，相转变溶菌酶/羟基磷灰石中钙元素的出现表明羟基磷灰石涂层成功负载到了氧化锆片表面。扫描电镜图像显示，在模拟体液中孵育10 d过后，氧化锆片表面已经形成了一层完全覆盖的羟基磷灰石涂层，说明已经成功在相转变溶菌酶改性过后的氧化锆片表面加载出了羟基磷灰石涂层。此后使用一系列的检测手段对羟基磷灰石进行检测，X射线多晶衍射分析表明，在以相转变溶菌酶为模板进行矿化的氧化锆片表面形成的是羟基磷灰石而不是磷酸钙。拉曼测试结果表明，出现的962 cm-1最高峰是羟基磷灰石结晶最具代表性的标志。能量色散X射线光谱仪检测结果表明，羟基磷灰石中的钙磷比为1.66，与天然骨组织中的羟基磷灰石含量相近。这些检测结果可以证明，在氧化锆片表面以相转变溶菌酶作为初始改性层成功矿化出了羟基磷灰石涂层。

种植体表面的润湿性很重要，有研究表明材料表面越亲水越有利于种植体骨整合[18]。此次实验通过测量接触角的实验来探索氧化锆种植体表面的润湿性，实验结果表明不同处理组之间的接触角存在显著差异(P < 0.05)，负载羟基磷灰石涂层的氧化锆片表面亲水性明显提高。有研究证明材料表面的性能直接影响接触角的大小，就材料表面的粗糙度而言，粗糙度增加则接触角变小，相对应的润湿性和亲水性也增强[19-20]。粗糙度实验表明，相转变溶菌酶/羟基磷灰石组的粗糙度远远大于纯氧化锆组。粗糙化氧化锆植入物对界面剪切强度产生有利影响[21]。据广泛报道，材料表面粗糙度本身对成骨细胞的附着、增殖和分化有很大影响[22]。在植入体与体液的初始接触过程中，表面粗糙度是表面润湿性的决定因素，而粗糙度和润湿性都会干扰大分子膜形成过程中的蛋白质吸附过程，进而影响进一步的细胞反应。如果细胞到达植入体表面，它们本身就会受到各自面临的润湿性和粗糙度的影响[23]。材料表面粗糙度的差异似乎影响了吸附蛋白质的数量，与更光滑的样品相比，粗糙钛合金上的纤维连接蛋白含量更高[24]。

对于材料的机械性能方面，此次实验进行了3M胶带撕拉测试、超声清洗测试、维氏硬度以及断裂强度测定。氧化锆上的羟基磷灰石涂层在3M胶带剥离和超声清洗时表现出持久的黏合稳定性，通过反复撕拉以及超声测试可以看到，表面形态和涂层的厚度几乎没有变化，羟基磷灰石涂层仍稳固地黏附在经相转变溶菌酶改性过后的氧化锆片表面，这是因为相转变溶菌酶纳米薄膜中纳米颗粒的二维组装保证了纳米薄膜与底层基底的高效接触，纳米膜在基底上的高结合强度主要来自纳米膜与基底之间的界面黏合。GU等[12]研究了相转变溶菌酶的界面黏附机制，相转变溶菌酶纳米膜从基底剥离的实验结果表明，相转移溶菌酶与材料之间界面的黏附依靠其表面丰富的化学结构，此种结构涉及与材料表面的多种结合，表面具有-NH2、-COOH、-OH、-SH等一系列官能团，这些官能团可以通过静电相互作用和氢键作用力等稳定地黏附在材料表面。在整个实验中，相转变溶菌酶起到了连接氧化锆基材与羟基磷灰石涂层的一个桥梁作用[25]。上述结果表明，相转变纳米薄膜作为一种“强力胶”在有机-无机杂化材料的开釆中具有巨大的潜在应用价值。在维氏硬度和断裂强度测试中发现，涂层后氧化锆陶瓷的强度和硬度没有显著变化，这并不意外，因为维氏硬度对薄涂层不敏感，尤其是那些比基底软的涂层[26]，而且晶粒的的尺寸非常小，因此测得的硬度值和强度值都不受涂层的影响，经统计学分析，涂层和未涂层样品的强度之间没有显著差异，也就是说实验中所使用的各种材料对于氧化锆本身没有产生影响。

羟基磷灰石涂层提高了氧化锆表面的生物活性，增加了氧化锆表面的润湿性，为细胞的黏附、增殖提供了良好的条件[27-31]。细胞在氧化锆材料表面整体呈现增殖趋势，说明材料表面的生物相容性好，有利于促进成骨细胞的增殖。碱性磷酸酶通常被认为是成骨分化的早期标志物[32]。此次实验结果显示，随着培养时间的进一步增加，羟基磷灰石涂层组表现出最高的碱性磷酸酶活性，这在一定程度上反映了羟基磷灰石材料具有良好的生物活性，提示其具有良好的促成骨分化能力。细胞在未改性处理氧化锆片表面培养12 h和3 d的扫描电镜观察结果可见，细胞在氧化锆表面紧密贴附，这是因为氧化锆材料本身也具有良好的生物学性能，可以促进 MC3T3-E1细胞的增殖及黏附[33]。在羟基磷灰石涂层组培养12 h后，材料表面细胞为纺锤体或多边形形态，细胞附着并良好地铺展在材料表面；培养3 d后，材料表面细胞密度均增大并出现细胞连接，其中羟基磷灰石涂层组表面的细胞数量更多，且细胞间出现交错连接，这也说明羟基磷灰石表涂层表现出良好的生物相容性和骨传导性。有研究表明，细胞在材料表面的黏附和生长与其接触的材料表面性能密切相关[34-35]。氧化锆表面修饰会影响成骨细胞和成纤维细胞的黏附、增殖，从而促进种植体表面的骨整合[36-37]，大多数细胞倾向于亲水表面，羟基磷灰石使得氧化锆表面的润湿性增加，为细胞提供了良好的营养物质，并且表面越粗糙越有利于细胞增殖，从而有更多的表面积提供给细胞黏附增殖[38-39]。此实验所形成的连续且致密的羟基磷灰石涂层，为细胞的生长提供了更好的生存环境，促进了细胞的增殖[40]。

综上所述，实验以相转变溶菌酶为模板，利用其表面的功能基团成功在氧化锆表面制备出了羟基磷灰石涂层，为羟基磷灰石涂层的制备提供了一种新的技术手段，同时也为生物医学应用提供了一种实际应用方法。
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文题释义：
相转变溶菌酶：溶菌酶的缓冲溶液中加入三(2-羧乙基)磷酸盐缓冲溶液，溶菌酶经过自组装过程就可以形成类淀粉样相转变溶菌酶薄膜。该薄膜是可以对任何表面进行修饰的具有多功能性的致密薄膜，为材料表面改性/功能化奠定了基础。
羟基磷灰石：具有与生物体硬组织相似的化学结构和成分，用于改善骨与植入物之间的骨整合。植入骨组织内的羟基磷灰石对活体组织无刺激和排斥作用，而且可以和骨直接结合，有良好的生物相容性、生物再吸收性以及良好的骨传导和骨诱导能力，是骨科和牙科植入物的理想候选材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

实验以相转变溶菌酶为模板在此基础上诱导矿化羟基磷灰石涂层，该操作过程简便快捷、绿色环保、机械性能优越，具有良好的生物相容性，为羟基磷灰涂层的制备提供了新的技术指导。

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