2.1   肩袖肌腱干细胞的形态及鉴定结果   ①培养第5天，肩袖肌腱干细胞开始从组织碎块中爬出，呈不规则形状；培养第10天，肩袖肌腱干细胞呈现长梭形并开始聚集；培养第20天，肩袖肌腱干细胞呈现明显的长梭形并逐渐呈现漩涡状分布，见图1；②克隆形成能力鉴定结果表明，肩袖肌腱干细胞具有克隆形成能力，见图2；③流式鉴定结果表明，肩袖肌腱干细胞表面分子CD105、CD90和CD44表达为阳性，而CD18和CD34表达为阴性，见图3；④三系分化能力检测表明，肩袖肌腱干细胞具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞分化的能力，见图4。















2.2   不同浓度H2O2模拟氧化应激状态对肩袖肌腱干细胞增殖能力的影响   使用0，50，100，200，400 μmol/L H2O2干预肩袖肌腱干细胞24，48，72 h，与空白组对比，50 μmol/L H2O2组细胞吸光度值显著升高(P < 0.05)，而100，200，400 μmol/L H2O2组细胞吸光度值显著降低(P < 0.05)，结果显示，随着H2O2浓度的增加，肩袖肌腱干细胞增殖活性下降，差异有显著性意义(P < 0. 05)。当H2O2浓度为50 μmol/L 时，肩袖肌腱干细胞增殖活性最强，因此采用50 μmol/L H2O2模拟肩袖肌腱干细胞氧化应激状态，见表1和图5。







2.3   各组肩袖肌腱干细胞自噬及凋亡检测结果    
2.3.1   各组肩袖肌腱干细胞自噬体染色情况(MDC法)   对照组只有少量点状荧光颗粒弥散分布在细胞质中，H2O2组与3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光颗粒明显增加，且H2O2组增加更明显。与空白组比较，H2O2组荧光强度较高，且在细胞质中可见明显聚集的荧光颗粒；与H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光强度降低且点状结构明显减少，见图6。




2.3.2  各组肩袖肌腱干细胞自噬溶酶体染色(Lyso-Tracker Red)结果  对照组只有少量点状荧光颗粒弥散分布在细胞质中，H2O2组与3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光颗粒明显增加，且H2O2组增加更明显。与空白组比较，H2O2组自噬溶酶体小点显著性增加；与H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组自噬溶酶体小点显著性下降，见图7。



2.3.3   免疫荧光染色检测各组肩袖肌腱干细胞LC3A/B的表达   空白组只有些许点状荧光颗粒散在分布，H2O2组LC3A/B荧光颗粒亮度明显，且数量增加；与H2O2组相比，3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光颗粒荧光强度明显降低，提示H2O2促进自噬相关蛋白LC3A/B表达，见图8。



2.3.4   基因测序检测自噬相关基因   与对照组比较，H2O2(50 μmol/L)组有142个基因上调，有253个基因下调；与对照组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组有88个基因上调，有629个基因下调；与H2O2(50 μmol/L)组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组有49个基因上调，462个基因下调， 见图9。




2.3.5   各组肌腱干细胞活性氧水平   与空白组比较，H2O2组细胞活性氧水平明显升高(P < 0.05)；与H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组活性氧水平明显降低(P < 0.05)，见图10。



2.3.6   Annexin V/PI检测细胞凋亡情况   与空白组比较，H2O2组细胞凋亡率明显升高(P < 0.05)；与H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)，见图11。



2.3.7   Western blot检测自噬及凋亡相关蛋白表达   与空白组比较，H2O2组Beclin-1、LC3A/B和caspase-3蛋白表达上调(P < 0.05)；与H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组Beclin-1蛋白表达下降(P < 0.05)。与空白组比较，H2O2组p-mTOR蛋白表达下降(P < 0.05)，mTOR蛋白无明显变化(P > 0.05)；与H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组p-mTOR蛋白表达上调(P < 0.05)，mTOR蛋白无明显变化(P > 0.05)，见表2和图12。

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肩袖是由冈上肌、冈下肌、小圆肌及肩胛下肌的肌腱所组成，并附着于肱骨大结节和解剖颈的边缘，又称旋转袖[1-2]。由于中国人口老龄化趋势及人民群众参加体育运动比例不断增加，肩袖损伤的发生率正逐年增加[3-4]。临床发现肩袖一旦损伤，腱骨止点很难自行愈合，即使通过关节镜手术治疗，修复后肩袖再发撕裂率仍比较高[5-7]。近年来，越来越多的研究致力于利用生物学技术促进肩袖修复后腱骨界面重建，尝试恢复腱骨连接处正常的组织形态，已成为目前运动医学界与骨科研究的热点。肩袖肌腱干细胞因在微环境中可定向分化为肌腱细胞，对肌腱损伤修复具有更为直接、有效的影响。然而，作者在临床上发现肩袖损伤腱骨止点常常愈合效果不佳，推测这可能与创面在氧化应激状态下出现异常细胞凋亡有关。因此，如何提高移植肌腱干细胞存活率成为亟待解决的问题。研究表明，氧化应激状态下不利于创面愈合[8]。该研究在体外模拟氧化应激状态刺激肌腱干细胞，研究细胞的活性及自噬现象，利用基因芯片技术检测细胞自噬相关基因的表达，并探讨Beclin-1、雷帕霉素靶蛋白(ma-mmalian target of rapamycin，mTOR)基因调控自噬对肩袖肌腱干细胞增殖、凋亡的作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   细胞学体外观察实验。所有数据经过正态性及方差齐性检验，组间比较用t检验，不满足方差分析时用非参数检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年1月至2021年8月在广州中医药大学第三附属医院实验室以及广州中医药大学实验动物中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   经广州中医药大学第三附属医院伦理委员会批准，选取年龄40-60岁的肩袖损伤患者，在患者和家属签署知情同意书的情况下，于肩关节镜术中取肩袖组织，分离培养肩袖肌腱干细胞，取培养效果好且对数生长期细胞用于实验。该研究的实施符合广州中医药大学第三附属医院的相关伦理要求，医院伦理批件号：KY(2019)002。
1.3.2   实验试剂和仪器   DMEM低糖培养基(Gibco，Cat.C11885500BT)；胎牛血清(Gibco，Cat.#10099133)；0.25%胰蛋白酶消化液(Gibco，Cat.#15050065)；Penicillin-Streptomycin双抗(Gibco，Cat.#15070063)；组织活性氧检测试剂盒(贝博生物，Cat.#BB-470532)；细胞活性氧检测试剂盒(碧云天，Cat.#S0033S)；超氧化物歧化酶检测试剂盒(碧云天，Cat.#S0060)；细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物，Cat.#KGA108-1)；CCK-8试剂(东仁化学，Cat.#CK04)；TRIzol试剂(北京天根生化，Cat.#DP424)；cDNA合成试剂盒(北京天根生化，Cat.#KR118)；荧光定量PCR试剂盒(广州复能基因，Cat.#QP002)；Beclin-1抗体(CST，Cat.#3495T)；mTOR抗体(CST，Cat.#2983T)；p-mTOR(Ser2448)抗体(CST，Cat.#5536T)；LC3A/B抗体(CST，Cat.#12741T)；Cleaved Caspase-3抗体(CST，Cat.#9661T)；山羊抗兔 IgG-HRP二抗(Jackson，Cat.#111-035-003)；细胞自噬染色检测试剂盒(索莱宝，Cat.#G0170-100T)；Lyso-Tracker Red(溶酶体红色荧光探针)(索莱宝，Cat.#L8010-50 μL)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，Cat.#P0012)；3-甲基腺嘌呤(MCE，Cat.#HY-19312)；ECL发光液(碧云天，Cat.#P0018S)；生物倒置显微镜(CKX41，OLYMPUS公司)；细胞培养箱(HERAcell® 150i，Thermo Fisher公司)；离心机(ST16，Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(C6，BD公司)；多功能酶标仪、热循环仪(珠海黑马)；核酸微量分析仪、荧光定量PCR仪(7500，ABI公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   肩袖肌腱干细胞的分离与培养   ①取手术修补剩余的人肩袖肌腱组织，1×PBS洗3次后去除肌腱外膜组织；②用0.25%胰酶将整段肌腱组织在37 ℃温箱中消化20 min，用含有胎牛血清的DMEM低糖培养基终止消化，再次用1×PBS冲洗3次，将肌腱剪成碎块；③用3 g/L的Ⅰ型胶原酶消化2 h，70 μm过滤器除去碎块，滤液以2 000 r/min离心5 min，弃上清，用含体积分数为10%胎牛血清、1%双抗的DMEM低糖培养基重悬沉淀，制成细胞悬液；④细胞计数后，以100个/cm2的低接种密度接种到25 cm2细胞培养瓶中，放入培养箱培养，大约10 d后细胞开始形成克隆，继续培养至20 d，用胰酶消化，以5 000个/cm2的密度传代。

1.4.2   H2O2对肩袖肌腱干细胞增殖能力的影响   ①收集第3代对数生长期肌腱干细胞，用DMEM低糖完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，接种于96孔板，每孔0.1 mL，在37 ℃，体积分数为5% CO2条件下孵育过夜；②弃培养孔内旧培养基，加入0.1 mL含0，50，100，200，400 μmol/L H2O2的DMEM低糖完全培养基，于37 ℃，体积分数为5% CO2条件下继续培养；③培养24，48，72 h后，弃孔内培养基，加入0.1 mL含10% CCK-8的DMEM低糖完全培养基，37 ℃，体积分数为5% CO2条件下继续孵育两三个小时，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值，绘制细胞生长曲线。
1.4.3   细胞模拟氧化应激自噬状态   ①收集第3代对数生长期肌腱干细胞，用DMEM低糖完全培养基重新悬浮细胞，调整细胞浓度为1×108 L-1，接种6孔板，每孔2 mL，在37 ℃，体积分数为5% CO2条件下孵育过夜；②弃孔内旧培养基，按如下分组进行处理：空白组加入2 mL新鲜DMEM低糖完全培养基，H2O2干预组加入2 mL含50 μmol/L H2O2的DMEM低糖完全培养基，3-甲基腺嘌呤预处理组加入2 mL含5 mmol/L 3-甲基腺嘌呤的DMEM低糖基完全培养基预处理30 min，弃培养基，再加入2 mL含50 μmol/L H2O2的DMEM低糖完全培养基；③各组细胞于37 ℃，体积分数为5% CO2条件下继续培养48 h。
1.4.4   细胞自噬体MDC法染色   ①以上各组细胞干预48 h后，弃孔内培养液，用Wash buffer冲洗细胞；②加入MDC染色液，于37 ℃，体积分数为5% CO2条件下避光孵育；③加入Wash buffer冲洗细胞两三次；④荧光显微镜下观察(Ex/Em=355 nm/512 nm)，计数并拍照。
1.4.5   细胞自噬溶酶体Lyso-Tracker Red染色   ①取少量Lyso-Tracker Red按照1∶20 000的比例加入到DMEM低糖完全培养基中，使终浓度为50 nmol/L，即为Lyso-Tracker Red工作液；②以上各组细胞干预48 h后，弃细胞培养液，加入适量的Lyso-Tracker Red工作液，于37 ℃，体积分数为5% CO2条件下避光孵育30-120 min；③弃细胞表面染色液，加入新鲜的DMEM低糖完全培养基；④于荧光显微镜下观察，溶酶体呈明亮的强荧光染色。
1.4.6   免疫荧光染色检测LC3A/B的表达   ①以上各组细胞诱导干预48 h后，弃细胞培养液，PBS冲洗3次，用新鲜配制的40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min；②PBS洗3遍，每次5 min，用0.2% triton X-100(PBS配制)对细胞透化处理10 min；③PBS洗3遍，每次5 min，2%BSA封闭30 min；④PBS洗2遍，每次5 min，加入兔抗LC3A/B单抗(1∶400)，室温孵育1 h；⑤PBS洗3遍，每次5 min，加入FITC标记的二抗(1∶500)，室温孵育30-45 min；⑥PBS洗4遍，每次5 min，加入0.5 mg/L DAPI(PBS配制)染色10 min；⑦PBS洗3遍，去除多余的DAPI；⑧荧光显微镜观察并拍照记录。
1.4.7   基因表达谱芯片检测自噬相关基因   以上各组细胞干预48 h后，收集细胞，交联川生物进行基因表达谱芯片检测自噬相关基因。
1.4.8   DCFH-DA检测细胞活性氧水平   ①按照1∶1 000用无血清DMEM低糖培养基稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μmol/L；②各组细胞干预48 h，消化收集细胞后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×109 L-1-2×1010 L-1，37 ℃细胞培养箱内孵育20 min；③每隔3-5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触；④用无血清DMEM低糖培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；⑤流式细胞仪实时检测荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。
1.4.9   Annexin V/PI检测细胞凋亡   ①各组细胞干预48 h，用不含EDTA的胰酶消化细胞，2 000 r/min室温离心5 min，收集(1-5)×105个细胞，PBS洗涤2次；②在50 μL的Binding Buffer中加入5 μL PI染液，混匀；在细胞中加入上述PI染液，混匀，室温避光反应5-15 min；③反应后加入450 μL的Binding Buffer混匀；④加入1 μL Annexin V-FITC混匀，室温避光反应5-15 min；⑤上流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，发射波长为530 nm，Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，使用FL1通道检测；激发波长为488 nm，发射波长≥630 nm，PI红色荧光用FL3通道检测。
1.4.10   Western blot检测自噬及凋亡相关蛋白的表达   ①各组细胞干预48 h，PBS洗涤，将细胞重悬并加入RIPA蛋白裂解液，在4 ℃裂解30 min；②通过蛋白凝胶电泳，将蛋白转到PVDF膜上；③将膜用含有5%脱脂奶粉的0.05%吐温20(TBST)封闭1 h，并与Beclin-1、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、LC3A/B、Cleaved Caspase-3一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min；④加入山羊抗兔 IgG-HRP二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min；④通过ECL发光液显色，放入暗匣中X射线胶片曝光，最后用显影、定影试剂进行显影和定影；⑤X射线胶片扫描后，Image J软件处理系统分析目标条带的吸光度值。
1.5   主要观察指标   ①肩袖肌腱干细胞的形态及鉴定结果；②不同浓度H2O2模拟氧化应激状态对肩袖肌腱干细胞增殖能力的影响；③各组肩袖肌腱干细胞自噬和凋亡情况。
1.6   统计学分析   采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，以x±s表示计量资料，所有数据经过正态性及方差齐性检验，组间比较用t检验，不满足方差分析时用非参数检验，检测水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广州中医药大学第三附属医院生物统计学专家审核。

肩袖损伤是人体常见的运动系统疾病，可由创伤、退行性等因素造成[9-10]。在美国，每年大约有450万人因肩痛就诊，其中约25万人接受了肩袖手术治疗[11]。在中国，随着人口老龄化趋势和全民健身普及，肩袖损伤的发病率和就医率也在逐步上升[12-13]。作者团队在临床中发现损伤后的肩袖往往无法自行愈合，甚至撕裂严重导致其他结构损伤。即使通过关节镜手术治疗，修复后的肩袖也往往因腱骨愈合不良容易再发撕裂。从组织病理生理学的角度看，究竟是什么原因导致的腱骨愈合不良，这引起了作者的极大关注与思考。目前肩袖止点腱骨愈合机制尚未完全阐明，任何环节受不良的调控因素干扰均可影响愈合过程。

氧化应激是机体促氧化与抗氧化失衡、产生自由基增多、组织器官抗氧化能力下降的一种病理状态，它可导致创面损害，不利于愈合[14]。急性期时肩袖按照组织学规律适时地愈合，创面暴露于炎症反应时间短，受氧化应激损害较少。然而，肩袖在距离大结节止点1 cm处缺乏血管供应[15]，由于缺血缺氧容易造成局部氧化应激状态，炎症反应时间持续延长，肩袖创面一直都暴露在炎症反应中，活性氧将持续过多地产生，细胞损害也将持续进行[16-17]；同时过量的活性氧又促成炎症的级联反应，炎症反应又刺激了氧化应激的产生，反过来氧化应激又促进了炎症持续，这样就进入一个恶性循环，导致创面难愈[18-20]。肩袖损伤难愈创面与愈合不良都是棘手的医学难题，因此，深入探讨氧化应激状态下肩袖创面修复的细胞分子机制仍是重要的医学科学问题。H2O2作为活性氧的主要成员，极易透过细胞膜，可用于模拟体内的氧自由基损伤，而且性质相对稳定，易于获得，已成为研究细胞氧化应激损伤的常用工具[21-23]。该研究结果显示，随着H2O2浓度的增加，肩袖肌腱干细胞增殖活性下降，差异有显著性意义(P < 0.05)。当 H2O2浓度为50 μmol/L 时，肩袖肌腱干细胞增殖活性最强，因此采用50 μmol/L H2O2模拟肩袖肌腱干细胞氧化应激状态。另外，与空白组比较，50 μmol/L H2O2组细胞活性氧水平明显升高(P < 0.05)；与50 μmol/L H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组活性氧水平明显降低(P < 0.05)，可见成功建立了肩袖肌腱干细胞体外氧化应激损伤模型。

肩袖肌腱干细胞是肌腱组织中的间充质干细胞，具有多向分化潜能且分化能力强，在特定的微环境中能分化为成纤维细胞及软骨细胞，对于促进肩袖腱骨愈合具有巨大的潜能[24-26]。BI等[27]最早从兔子和人体的肌腱组织中分离并培养出了肌腱干细胞，为其今后在促进肩袖损伤中的应用奠定了基础。目前虽然应用肌腱干细胞促进腱骨愈合的相关研究相对较少，但由于肌腱干细胞是肌腱唯一的前体细胞，可能对腱骨修复具有更为直接、有效的影响。因此，如何提高肩袖损伤愈合过程中肌腱干细胞的存活率及更好的分化能力成为亟待解决的问题[28-30]。该研究各组细胞自噬体染色结果显示，对照组只有少量点状荧光颗粒弥散分布在细胞质中，H2O2组与3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光颗粒明显增加，且H2O2组增加更明显。与空白组对比，H2O2组荧光强度较高，且在细胞质可见明显聚集的荧光颗粒；与H2O2组对比，3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光强度降低且点状结构明显减少。各组细胞自噬溶酶体染色结果显示，对照组只有少量点状荧光颗粒弥散分布在细胞质中，H2O2组与3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光颗粒明显增加，且H2O2组增加更明显。与空白组对比，H2O2组自噬溶酶体小点显著性增加；与H2O2组对比，3-甲基腺嘌呤+H2O2组自噬溶酶体小点显著性下降，可见H2O2组细胞自噬水平明显增强。然而，各组细胞流式凋亡检测显示，与空白组比较，H2O2组细胞凋亡率明显升高(P < 0.05)；与H2O2组比较，3-甲基腺嘌呤+H2O2组凋亡率明显降低(P < 0.05)，可见自噬在一定程度上具有抵抗细胞凋亡的作用。

Beclin-1是细胞自噬关键的正调控因子，也称BECN1基因，是酵母ATG6的同系物。研究表明Beclin-1可调节细胞自噬与凋亡之间的平衡：当凋亡刺激持续存在时，Beclin-1被凋亡蛋白裂解而不能诱导自噬，细胞最终走向凋亡[31-32]；自噬又可通过Beclin-1阻止凋亡蛋白Bcl-2激活而抑制凋亡，保护细胞存活[33-34]。mTOR是细胞自噬关键的负调控因子，通过与多种蛋白结合成复合物mTORC1和mTORC2发挥生理功能，其活性受多个信号通路调控。2010年《Nature》的报道，首次证实自噬对mTOR具有负反馈调节作用[35]。PI3K/AKT/mTOR信号通路在自噬的调控中有重要的作用，其中mTOR是参与自噬信号通路的主要感受器，是细胞自噬的能量和营养状态的感受器，在调节细胞自噬方面起关键的作用。关于自噬调控细胞存活的机制，KANG等[33]研究小组提出mTOR介导的自噬与 Beclin-1 介导的自噬/凋亡互反馈作用成为重要的途径。该研究结果显示，与空白组及3-甲基腺嘌呤+H2O2组对比，H2O2组自噬正调控因子Beclin-1蛋白表达上调(P < 0.05)，自噬负调控因子mTOR蛋白表达下降(P < 0.05)，可见Beclin-1与 mTOR 的互反馈调控作用是促进细胞存活的重要机制，但Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路、mTOR介导的自噬/mTOR 的互反馈信号通路之间是如何交互影响的，其具体机制可能包括：①Beclin-1的表达下降或基因突变甚至缺失时，Beclin-1介导的肌腱干细胞的自噬行为减少，导致自噬依赖性蛋白质、细胞器的降解和自噬体的形成减少，在肩袖损伤氧化应激微环境下，肌腱干细胞不能在正常自噬介导下增殖、分化成肌腱细胞以修复损伤的肩袖组织，造成肩袖损伤迁延不愈。②Beclin-1的减少和失活将导致Bcl-2家族某些基因的失调，从而降低细胞的自噬能力和程序性细胞死亡。而自噬对mTOR具有负反馈调节作用，mTOR的表达增加，加重了自噬的抑制，降低细胞在氧化应激微环境中的生存能力，影响肩袖损伤愈合，所以Beclin-1是肩袖损伤患者预后的保护因素，检测Beclin-1和mTOR的表达在一定程度上可反映肩袖损伤预后情况。另外，基因表达谱芯片检测自噬相关基因结果显示，与对照组相比，H2O2(50 μmol/L)组有142个基因上调，有253个基因下调；与对照组相比，3-甲基腺嘌呤+H2O2组有88个基因上调，有629个基因下调；与H2O2(50 μmol/L)组相比，3-甲基腺嘌呤+H2O2组有49个基因上调，462个基因下调。蛋白芯片检测自噬相关蛋白结果显示，与对照组相比，H2O2处理后有10个与细胞自噬相关的蛋白表达上调；与对照组相比，3-甲基腺嘌呤+H2O2组有9个与细胞自噬相关的蛋白表达下调，提示自噬相关基因及蛋白表达水平均显著升高，并且自噬相关基因及蛋白表达水平与凋亡、氧化应激水平呈显著正相关，表明自噬及凋亡相关基因的表达可能与氧化应激状态的肩袖损伤预后有一定关系。自噬通过膜性结构包裹损坏的蛋白质及细胞器形成双膜囊泡，与溶酶体结合形成自溶酶体，从而降解内容物[36]，其中LC3A/B是自噬发生的关键基因，其表达水平与自噬活性关系密切，是监测自噬的特异性标志物，常作为研究的重点[37]。自噬发生过程中，LC3B-Ⅰ被活化并转化为LC3B-Ⅱ，分布于自噬体的外膜上，因此检测LC3A/B的表达量可估计自噬水平的高低[38]。研究表明，氧化应激在诱导细胞凋亡的同时促进细胞自噬[39]，然而氧化应激环境下自噬与凋亡的关系比较复杂。关于在氧化应激微环境中肌腱干细胞是否发生自噬、自噬与细胞存活及凋亡的关系，目前国内外相关研究尚不多见。该研究用 H2O2 模拟氧化应激微环境，探讨肌腱干细胞在体外氧化应激环境中凋亡及自噬水平的变化，并通过调节肌腱干细胞自噬水平，观察其在氧化应激微环境下对肌腱干细胞增殖和凋亡的影响。首先，免疫荧光染色检测LC3A/B的表达，空白组中只有些许点状荧光颗粒散在分布，H2O2组LC3A/B荧光颗粒亮度明显，且数量增加；与H2O2组相比，3-甲基腺嘌呤+H2O2组荧光颗粒荧光强度明显降低，可见H2O2促进自噬相关蛋白LC3A/B表达，诱导细胞自噬有比3-甲基腺嘌呤+H2O2组好的趋势。该研究发现LC3A/B呈现与自噬相关性显著，LC3A/B也可作为肩袖损伤患者预后的独立预测因素。研究表明Caspase-3表达上调可促进细胞凋亡[40]。该研究结果显示，H2O2处理后肩袖干细胞凋亡率升高，Caspase-3表达上调，提示H2O2可诱导细胞自噬的同时亦可以诱发肩袖干细胞凋亡。为探讨在氧化应激微环境下细胞发生的自噬与凋亡的关系，实验结合Annexin V/PI及流式细胞术发现低浓度的H2O2可促进人肌腱干细胞增殖，细胞凋亡有小幅度升高，也在正常范围内，但是它在使一小部细胞产生凋亡的同时，让更多的细胞转入自噬消除H2O2的影响，从而提高大部分细胞的增殖活力，这是一种细胞高转化状态。当抑制自噬后，这种高转换状态被破坏，凋亡率反而下降。

综上所述，自噬在一定程度上具有抵抗细胞凋亡的作用。但是，自噬也并非都是积极保护作用，过度的自噬能损伤细胞，甚至可致细胞死亡。自噬对细胞起“双刃剑”的作用， 而自噬的程度就是这把“双刃剑”的核心问题，自噬在激活和抑制之间的平衡将决定“双刃剑”的走向，因此，调控细胞的自噬程度应该是使这把“双刃剑”转向细胞保护作用的关键。Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈信号通路、mTOR介导的自噬/mTOR 的互反馈信号通路可能是调控自噬“双刃剑”转向利于细胞存活从而促进肩袖损伤愈合的重要调控机制，但其具体机制仍需要进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
缺血缺氧微环境与人肌腱干细胞：肩袖止点存在乏血管区，使损伤的创面处于一个缺氧、缺血状态，这样的微环境会释放大量有毒物质、炎症递质及促凋亡因子，导致归巢的肌腱干细胞无法分化成足够数量的目标细胞修复创面，严重者还会加速肌腱干细胞的凋亡。
氧化应激与肩袖损伤愈合：由于缺血缺氧容易造成局部氧化应激状态，炎症反应时间持续延长，肩袖创面一直都暴露在炎症反应中，持续过多地产生活性氧，而过量的活性氧又促成炎症的级联反应，炎症反应又刺激了氧化应激的产生，反过来氧化应激又促进了炎症持续，这样就进入一个恶性循环，导致肩袖损伤愈合不良。这可谓肩袖损伤治疗的“瓶颈”。

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以氧化应激诱导自噬促进人肌腱干细胞继续生存为突破点，设想通过Beclin1-mTOR交互作用调控自噬来缓解细胞氧化应激性损害，从而保护细胞正常增殖、分化及调亡，探明在氧化应激微环境下人肌腱干细胞发生自噬及凋亡现象的相关性和Beclin1、mTOR及LC3A/B表达情况，为人肌腱干细胞在促进肩袖腱骨愈合中发挥的作用提供了分子生物学依据。

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