2.1   实验动物数量分析   大鼠50只在整个实验期间未发生意外死亡、脊髓损伤造模失败、感染等导致动物脱失的情况，脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组中随机选取2只大鼠进行甲苯胺蓝蛛网膜下腔内染色实验，术后1.5 h心脏灌注获取大体标本观察染色结果，其他48只大鼠全部顺利饲养28 d并获取完整的实验数据进入结果分析。
2.2   并发症发生情况   经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射操作时未出现大鼠肢体抽搐、呼吸节律异常等延髓或颈髓损伤的特殊征象，在麻醉苏醒后及术后各时间点，未发现大鼠头颈与前肢运动不协调(脊髓损伤大鼠不能靠前肢直线爬行，未损伤脊髓大鼠爬行时躯体左右剧烈摇摆)等小脑损伤表现，无抬头困难、斜颈等颈后肌群功能明显受损的情况，见图4。



大鼠未出现精神萎靡、饮食减少、自残等精神行为异常，所有枕颈部手术切口愈合良好，无脑脊液外漏的征象。蛛网膜下腔注射假手术组与蛛网膜下腔注射组无排尿排便功能障碍发生，脊髓损伤组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组与脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组均在术后一两周时逐渐恢复膀胱功能，抓尾排尿反射出现，无膀胱内大量残余尿，腹胀情况均在术后1周内缓解，无排便困难发生。
2.3   大鼠脊髓损伤后的行为学变化    经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射未造成大鼠中枢神经系统的损伤或原有的T9段脊髓损伤加重，在术前与术后不同观察时间点，无脊髓损伤的3组大鼠(正常对照组、蛛网膜下腔注射假手术组、蛛网膜下腔注射组)BBB评分皆为21分，有脊髓损伤的3组大鼠(脊髓损伤组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组)BBB评分在术前皆为21分，术后1 d皆为0分，此后逐渐改善且同一时间点的组间比较均无统计学差异(P > 0.05)，见表1。




无脊髓损伤的3组大鼠与有脊髓损伤的3组大鼠各自的斜板试验和热板试验结果在同一时间点无组间差异(P >  0.05)，见表2，3。







2.4   大鼠脊髓损伤后体质量变化   经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射未造成大鼠体质量长期严重降低，蛛网膜下腔注射假手术组、蛛网膜下腔注射组术后出现体质量降低(P < 0.05)，此后体质量逐渐增加，在术后1周时体质量恢复到术前水平(P > 0.05)，在术后3周时恢复到同期正常对照组水平(P >  0.05)，蛛网膜下腔注射假手术组与蛛网膜下腔注射组各时间点体质量无显著性差异(P > 0.05)；脊髓损伤组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组术后同样出现体质量降低(P < 0.05)，在术后2周时体质量恢复到术前水平(P > 0.05)，脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组术后1 d时体质量较脊髓损伤组低(P < 0.05)，术后1周及此后处于同等水平(P > 0.05)，脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组与脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组各时间点体质量无显著性差异(P > 0.05)，见表4。




2.5   甲苯胺蓝在脊髓损伤大鼠蛛网膜下腔内的弥散与分布   在蛛网膜下腔注射后1.5 h，甲苯胺蓝溶液随脑脊液循环在脊髓组织周围的蛛网膜下腔内广泛弥散，脊髓组织被染为蓝色，在T9段脊髓挫伤部位有大量甲苯胺蓝浓集，染色较脊髓尾端更深，证实了经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射可将药物全部送入蛛网膜下腔内，并且有较大剂量药物快速到达脊髓损伤部位，见图5。

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脊髓损伤动物模型常规的给药途径包括尾静脉注射、腹腔注射和灌胃等，但血脊髓屏障的存在阻碍了药物分子由血浆向脊髓组织的转运，降低了给药效率。血脊髓屏障虽在脊髓损伤后部分受损，通透性增高，但其开放的时间窗较短[1-2]，随着屏障功能重建仍能限制绝大部分硬膜外药物到达损伤脊髓组织。蛛网膜下腔给药作为一种有效的中枢神经系统给药途径，可令实验药物直接到达脊髓病变部位，有效避免血脊髓屏障对血液循环内药物的限制及胃肠道给药的首过效应，降低用药成本，并规避如干细胞等特殊干预药物进入血液循环后的生物安全性问题，在脊髓损伤实验中应用逐渐增多。

目前文献报道的蛛网膜下腔给药方式主要为经皮蛛网膜下腔注射与蛛网膜下腔置管[3-6]，操作方法成熟但存在单次给药剂量少(10-30 μL)、部分研究需多次给药的问题，同时，留置蛛网膜下腔导管可能损伤中枢神经系统并在术后出现导管脱落与堵塞等置管失败的情况[7]，而经皮蛛网膜下腔注射操作难度较大、神经损伤风险高[8]。为满足部分脊髓损伤动物实验中给药途径与剂量的特定需求(单次蛛网膜下腔给药大于30 μL)，减少给药时对中枢神经系统的损伤，文章介绍了一种可以一次性较大剂量蛛网膜下腔给药的经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射方法，并首次将其应用于纽约大学(New York University，NYU)脊髓打击器构建的标准化大鼠脊髓挫伤模型，以期在改变药物剂型后单次注射即足量给药，避免多次蛛网膜下腔注射或长期蛛网膜下腔置管带来的局部感染与神经损伤风险增加，提高给药操作的安全性。2020年9月课题组进行了预实验，在心脏灌注40 g/L多聚甲醛固定后解剖大鼠枕颈部，观察寰枕后间隙与小脑延髓池等解剖结构，见图1。并结合既往文献研究[9-13]，摸索合适的进针位置、进针角度与进针深度，完善了具体操作方法。随后，设计了以下的动物实验证实该给药方法的安全性与可靠性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

1.1   设计   完全随机设计，对照动物实验，单因素方差分析结合Tukey事后检验法检测。
1.2   时间及地点   实验于2020年10月至2021年6月在中国中医科学院中医基础理论研究所屏障环境动物房及北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室完成实验。
1.3   实验动物   SPF级2月龄雌性SD大鼠50只，体质量220-250 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所屏障环境动物房内，每笼4只，温度22-24 ℃，12 h光照/12 h黑暗循环，消毒后的饲料与水足量供给。
1.4   实验方法   
1.4.1   分组及干预   采用完全随机设计方式，将大鼠随机分为6组：正常对照组8只、蛛网膜下腔注射假手术组8只、蛛网膜下腔注射组8只、脊髓损伤组8只、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组8只，脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组10只。正常对照组不做任何处理；蛛网膜下腔注射假手术组暴露寰枕后膜后不进行蛛网膜下腔穿刺与模拟药液(生理盐水)注射；蛛网膜下腔注射组手术暴露寰枕后膜，匀速抽取脑脊液100 μL(抽取速度200 μL/min)后予200 μL模拟药液蛛网膜下腔注射；脊髓损伤组将NYU脊髓打击器(型号：model-II manual，NYU，美国)10 g打击杆于25 mm高度坠落造成T9段脊髓挫伤；脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组同时施以脊髓损伤组与蛛网膜下腔注射假手术组的手术操作；脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组同时施以脊髓损伤组与蛛网膜下腔注射组的手术操作，脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组中随机选取2只进行甲苯胺蓝(规格：BS级，福州飞净生物科技有限公司)蛛网膜下腔内染色。
1.4.2   术前准备   术前禁食、禁水8 h，手术采用体积分数4%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉，麻醉深度以牵拉出大鼠舌头不能自主回缩为度。注意保持大鼠呼吸道通畅，应在麻醉成功后将大鼠舌头从口腔一侧轻柔牵拉出置于口外，同时将5 mL注射器的针帽尾端剪开做成导管，插入大鼠口腔内维持大鼠气道通畅，必要时可气管插管后连接小动物呼吸机辅助机械通气。背部以及枕颈部切口处备皮。

1.4.3   脊髓挫伤模型大鼠的构建   采用NYU脊髓打击器重物坠击(weight dropping，WD)法构建标准化的大鼠不完全性脊髓损伤模型[14]，WD法依靠重物自由落体击打动物脊髓的方式建模，致伤过程接近于临床实际，制备的脊髓挫伤模型与人类创伤性脊髓损伤相关性好，术后评价方法成熟。NYU脊髓打击器是WD造模方式仪器化、精准化和标准化后的成果，可通过调节该装置10 g打击杆下落的高度构建不同损伤程度的大鼠脊髓损伤模型，同时有利于保证同批模型损伤程度及区域的一致性，减少人为操作的实验误差，可重复性好且稳定可靠，为实验奠定了基础，但该造模方法也存在切除椎板时可能损伤脊髓组织、打击杆未及时移除可能造成脊髓二次损伤等弊端[15-16]。

大鼠俯卧位固定于鼠板，消毒、铺巾并定位T10棘突，定位方法来自既往大鼠解剖摸索及文献参考[17]，T10棘突高于T9，二者高度对比明显(T8-11棘突逐渐增高)，同时T9棘突倾向尾侧而T10棘突中立无倾斜，在大鼠背部正中从头侧至尾侧触及的第一个明显升高的棘突即为T10棘突，以T10椎体为中心，做长约4 cm的背部正中纵行皮肤切口，依次切开浅筋膜、深筋膜、背部浅层肌肉等各层组织，紧贴T9-11棘突切开背部深层肌并向两侧剥离，充分显露T9-11棘突、椎板及相应关节突关节，术中可见T10棘突约对应骶棘肌淡红色肌肉与银白色腱膜最头端移行处，且T10棘突头尾向宽度明显大于T9(T8-11棘突逐渐增宽)，可验证棘突定位。咬除T9、T10椎板后充分暴露T9段脊髓，使用NYU脊髓打击器配套固定装置钳夹大鼠术区头尾侧棘突固定大鼠脊柱，将大鼠置于打击器操作平台上合适位置，调整10 g打击杆于25 mm高度自由落体打击T9段脊髓背侧正中位置，当即可见坠击部位脊髓表面出现淤血，硬脊膜完整，大鼠出现持续数秒的双后肢抽动及尾部痉挛性摆动，随后双后肢及尾部肌肉完成松弛。予4 ℃冰盐水冲洗术区，充分止血，剪取适当大小的明胶海绵薄片覆盖于硬脊膜表面，防止硬脊膜与软组织瘢痕粘连，逐层缝合切口。
1.4.4   经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射
特殊器械：实验采用自制的穿刺针头与注射针头。截取长约10 cm的硬膜外麻醉导管(临沂兴华医用器材有限公司)，前端连接规格为30 G的注射器针头(国标3号，外径0.3 mm，内径0.16 mm，长度25 mm，康德莱医疗器械股份有限公司，温州市)用于穿刺与注射，后端连接5 mL注射器针头以方便安装于1 mL注射器上。将30 G注射器针头前端锐性部分磨除后的钝针头即为注射针头，用于注射模拟药液，保留锐性部分则为穿刺针头，用于蛛网膜下腔穿刺及抽吸脑脊液，见图2。

为减少对硬脊膜及蛛网膜的损伤，确保产生的针孔足够小，避免术后发生脑脊液漏，同时兼顾模拟药液推送的顺畅度，作者对比32 G，30 G，27 G，25 G几种规格的注射器针头后最终选用了30 G，针对小鼠、家兔等实验对象可灵活选用其他规格型号的注射器针头。
暴露寰枕后膜：大鼠俯卧位头部尽可能前屈(约30°)固定于鼠板，以使寰枕后间隙开大。枕颈局部消毒，取枕外隆突至枢椎棘突的连线做长约2 cm的枕颈部后正中纵行皮肤切口，用眼科剪依次剪开浅筋膜、深筋膜与枕颈部浅层肌肉(主要为斜方肌)，注意深筋膜与枕颈部浅层肌肉在枕骨的附丽处存在一处宽约3 mm的正中空隙，可从此处入剪，将深筋膜与浅层肌肉锐性分离，蚊式止血钳从后正中线向两侧钝性分离枕颈部深层肌肉(主要为头夹肌、头半棘肌)，11号尖刀片剥离枕下小肌群(主要为头后小直肌)充分显露枕骨、寰椎后弓以及寰枕后膜，注意勿过度损伤枕颈部肌肉，以免影响大鼠术后抬头进食、饮水，见图3A。
蛛网膜下腔穿刺与药物注射：用尖头的穿刺针头于后正中线上距枕骨大孔后下缘约1 mm处垂直穿刺寰枕后膜，针下获得突破感后针尖略微头倾20°-30°并缓慢进针1 mm，见图3B，穿刺针头后连1 mL注射器及实验室微量注射泵(型号：XMSP-1C单通道，南京晞迈纳米科技有限公司)，利用微量泵的抽吸功能匀速抽取无色透明脑脊液100 μL，速度设定为200 μL/min。抽液完成后拔出穿刺针头，立即改用钝头的注射针头依寰枕后膜原针孔刺入，见图3C，穿刺深度及角度同前，穿刺成功后向右侧(右利手)倾斜针头使进入蛛网膜下腔的针头前段平行并紧贴于蛛网膜及硬脊膜，以避免注射模拟药液时无法长时间维持针头穿刺的深度与角度，造成内部神经组织的损伤，同时钝头的注射针头倾斜时也不易刺穿蛛网膜及硬脊膜。注射针头同样后连1 mL注射器及实验室微量注射泵，注液速度设定为100 μL/min，模拟药液注射量为200 μL，注射时密切观察大鼠有无呼吸节律变化以及肢体抽搐等异常表现。注射完毕后停留30 s拔针防止药液外渗，拔针后立即以5 mm×5 mm的明胶海绵填塞于寰枕后膜穿刺点处并稍加压5 min，同时调整大鼠体位为头后伸、与水平面成30°的头高尾低位并保持30 min，以期加快模拟药液向脊髓损伤部位流动，同时观察有无脑脊液或模拟药液的渗漏。

切口缝合：逐层缝合切口，缝合肌肉时不予缝合枕下小肌群与枕颈部深层肌肉，只缝合枕颈部浅层肌肉与皮肤2层，力求对枕颈部伸肌群的干扰最小。
1.4.5   术后处理   术后将大鼠置于保温毯上复苏，保持呼吸道通畅，必要时可使用注射器连接细管吸痰。复苏后单笼饲养3 d，予足够饮水及饲料，每日另予葵花籽适量加强营养。术后每日背部皮下注射青霉素钠(20万单位/只)预防感染，连续3 d。术后3 d内采用两侧合并前后加压手法按摩膀胱帮助排尿，同时揉按腹部并轻柔挤出粪粒，每日3次，3 d后若尿潴留及腹胀情况改善可2次/d，直至大鼠排尿排便功能恢复。密切观察经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射是否引起大鼠中枢神经系统损伤、脑脊液漏、抬头困难、甚至死亡等并发症。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   行为学评价
运动功能评价：术前与术后1，3，7，14，21，28 d，在1 m×1 m的纸箱内进行旷场试验，依据BBB评分量表(Basso，Beattie and Bresnahan scale)对大鼠后肢运动功能评分[18]。BBB评分为0-21分，0分为双后肢完全瘫痪，9分可依靠足底/足背负重，21分为双后肢运动完全正常。旷场试验完成后30 min进行斜板试验，评价大鼠前后肢的承重能力及肌肉力量，参照RIVLIN等的方法[19]，准备一块长方形木板，上覆橡胶垫增加摩擦力，大鼠头朝木板抬高侧、身体纵轴与木板长边平行放置于橡胶垫上，将木板一侧短边缓慢抬起，观察木板长边与工作台平面形成的角度，该角度从0°开始增加，每次增加5°，记录大鼠在斜板上停留至少5 s的最大角度，每只大鼠测5次，每次间隔至少5 min，去掉最高值与最低值，结果记为剩余3次的平均值。
感觉功能评价：术前与术后3，7，14，21，28 d，进行热板试验测试大鼠对热痛刺激的缩足反应时间。将大鼠左右后肢足底先后置于加热到55 ℃的热板上(检测仪器：YLS-6B智能热板仪，山东省医学科学院设备站，济南市)，记录大鼠因热痛刺激发生缩足反应的时间，若大于30 s仍无反应则停止测试避免烫伤。每只大鼠测2次，间隔至少15 min，结果取左右后肢及两次测试的平均值。
1.5.2   体质量测量   在术前与术后1，7，14，21，28 d称量大鼠体质量，选取9时与17时2个固定时间，称量前需手法辅助排尽尿液和粪粒，结果取2个时间的平均值。
1.5.3   甲苯胺蓝蛛网膜下腔内染色   蛛网膜下腔内注射生物染色剂常被用于定位蛛网膜颗粒[20-21]、蛛网膜下腔置管时标记导管末端的位置[8，22-23]、蛛网膜下腔出血模型中显示血液沉积区域[24]。受此启发，实验在脊髓损伤造模完成后经寰枕后间隙将甲苯胺蓝溶液注入蛛网膜下腔，并在1.5 h后通过大体标本观察脊髓组织染色情况，旨在证实经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射可将200 μL药液全部注入蛛网膜下腔内，且药液在较短时间内可随脑脊液循环分布于损伤的脊髓组织，以此说明该给药方式的可靠性。
术前从脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组中随机选取2只大鼠以甲苯胺蓝溶液代替模拟药液，在T9段脊髓挫伤造模完成后将体积分数1%的甲苯胺蓝溶液200 μL经寰枕后间隙注入蛛网膜下腔，方法同前。在蛛网膜下腔注射后1.5 h进行心脏灌注清除血液，避免干扰组织染色情况的大体观察，将体积分数4%戊巴比妥钠0.1 μL/g腹腔注射深度麻醉后将大鼠仰卧位固定于鼠板，从中下腹开始由下往上呈U形剪开腹前壁、膈、胸前壁，完整暴露心包及心脏，眼科剪、眼科镊小心剪开并剥离心包膜，于心尖部偏左侧剪开一长约2 mm切口，将钝头灌注针自切口处插入左心室，向上经主动脉瓣进入升主动脉2 mm后直血管钳固定。立即剪开右心耳同时快速灌注4 ℃预冷的PBS液(酷来搏科技有限公司，北京市)100 mL，降低灌注速度保持一定压力再持续灌注约200 mL，待肺脏、肝脏、肾脏色泽由暗红变为淡红苍白，且右心耳处流出的灌注液颜色转为无色透明后停止灌注。将大鼠改为俯卧位固定，去除背侧部分皮肤肌肉，咬除脊柱所有椎板完全暴露脊髓，观察甲苯胺蓝溶液在蛛网膜下腔内的弥散与分布情况。
1.6   统计学分析   所有数据应用SPSS 20.0软件进行分析，结果以x±s表示，同一组中术前与术后不同时间点的配对资料采用配对t检验进行比较；同一时间点，两组资料的比较采用两独立样本t检验，多组资料的比较采用单因素方差分析，并用Tukey法检验。以P < 0.05认定为差异有显著性意义。

在大鼠实验中，经寰枕后间隙进入蛛网膜下腔的解剖入路多被用于蛛网膜下腔置管给药、抽取脑脊液及构建蛛网膜下腔出血模型[10-13，25-26]，实验设想经此解剖入路直接进行蛛网膜下腔注射。经过文献回顾学习、解剖观察与预实验摸索操作方法后，对正常与脊髓损伤大鼠经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射给予模拟药液(生理盐水)，以甲苯胺蓝溶液替换模拟药液观察药物在蛛网膜下腔内的弥散与分布，同时设置了相应的空白对照组与假手术组以证实操作的安全性与可靠性。

参考蛛网膜下腔置管研究中提出的判定蛛网膜下腔给药方式成功与否的标准[8，27]，实验将以下4点作为定义蛛网膜下腔注射成功的标准：①该操作未引起受试动物的中枢神经系统损伤，包括对正常动物未引起运动、感觉及括约肌功能障碍，对胸段不完全性脊髓损伤动物未引起前肢运动功能障碍、未影响后肢运动与感觉功能在术后的部分恢复、亦未延缓膀胱及肠道功能的术后恢复；②蛛网膜下腔注射未导致受试动物体质量长期严重降低；③术中及术后无脑脊液或模拟药液外漏，药物能到达脊髓损伤部位；④脊髓损伤动物在术后可正常抬头饮水进食，抬头时可正常摆正头部，无头颈偏斜；无精神萎靡、饮食减少及自残等精神行为异常。

针对这4条标准，作者在实验中进行了观察与分析。首先，术中及术后均未观察到穿刺区域中枢神经系统损伤的征象，无脊髓损伤的3组大鼠(正常对照组、蛛网膜下腔注射假手术组、蛛网膜下腔注射组)与有脊髓损伤的3组大鼠(脊髓损伤组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射假手术组、脊髓损伤+蛛网膜下腔注射组)各自的行为学评价结果在各时间点无组间差异，前者未出现排尿排便功能障碍，后者膀胱和肠道功能在术后同期恢复。其次，因术前禁食水与手术创伤，蛛网膜下腔注射假手术组与蛛网膜下腔注射组大鼠术后出现体质量降低，但在术后快速恢复，并达到正常对照组体质量水平；所有脊髓损伤大鼠术后1周及此后体质量处于同等水平，术后2周时体质量恢复到术前水平。此外，实验采用外径0.3 mm的针头减小硬脊膜损伤，注射前抽取100 μL脑脊液防止注射时脑脊液压力过大，给药后留针30 s，拔针后按压针孔5 min，关闭切口前头高尾低位观察30 min，术后枕颈部切口正常愈合，术中术后均未发现脑脊液及模拟药液外漏的情况。甲苯胺蓝蛛网膜下腔内染色实验证实该方法可令药物分布于损伤的脊髓节段。最后，所有大鼠术后均可正常抬头，无精神行为异常。因此，作者认为经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射是安全可靠的。

近年来，越来越多的学者在脊髓损伤动物实验中采用直接将药物注入蛛网膜下腔内的给药方式。马克军等[3]在大鼠脊髓缺血再灌注损伤实验中用25 μL微量注射器进行经皮蛛网膜下腔注射，单次给药剂量15 μL，连续给药 3 d(1次/d)。秦燕等[4]对大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型给予右美托咪定经皮蛛网膜下腔注射，每次给药30 μL，共给药3次(1次/d)。彭程等[28]建立大鼠T10段脊髓重物坠击挫伤模型后，连续蛛网膜下腔注射给药14 d(1次/d)，每次给药10 μL。封青等[5]经L3-4棘突间隙置入蛛网膜下腔导管(改良Yarst法)，置管成功后经导管注射20 μL神经节苷脂，观察神经节苷脂预处理对布比卡因所致脊髓损伤的影响。刘明等[29]在小鼠脊髓钳夹损伤处(T9段)以33 gauge微量注射器穿刺蛛网膜下腔，给药4 μL。给药方式类似的文献说明，在以蛛网膜下腔给药为干预方式的脊髓损伤动物实验中，大鼠为主要实验对象，多选用重物坠击挫伤与缺血再灌注损伤等保留硬脊膜完整性的造模方式，给药方式以经皮蛛网膜下腔注射和蛛网膜下腔置管为主[5-6，30-32]，单次给药剂量小于30 μL，部分研究需多次进行经皮蛛网膜下腔注射给药或长期留置蛛网膜下腔内导管[3-4，28，33-35]。

实验介绍的经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射的方法与既往研究采用的给药方式存在以下几点不同：①作者发现对于体质量220-250 g的大鼠单次安全蛛网膜下腔注射剂量可达200 μL，这是该方法的优势所在，对于部分需大剂量蛛网膜下腔给药的大鼠脊髓损伤动物实验不失为一种可供选择的方法；②该给药方法若与缓释/控释药物剂型联合使用可能达到一次性足量给药，避免多次蛛网膜下腔穿刺或者蛛网膜下腔内导管留置增加感染与中枢神经系统损伤的风险；③实验在大鼠脊髓损伤模型中首次采用经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射的给药方式，并详细探讨了操作中的注意事项，证实了经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射应用于脊髓损伤大鼠安全可行；④与经皮蛛网膜下腔穿刺不同，该方法采取直视下操作，切开组织显露寰枕后膜的过程虽然增大了创伤，并在术后导致大鼠体质量短暂的降低，但可以精确定位进针位置，随时调整进针方向与深度，有力地避免了操作中误伤中枢神经系统，同时确保药液完全注入蛛网膜下腔内。但是，经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射存在部分缺点：该方法仅适用于单次蛛网膜下腔给药，多次给药将增大创伤，在需要长时间多次给药的动物实验中并不适用。同时，该方法需要一个完整的脑脊液循环，只适用于硬脊膜完整的脊髓损伤动物模型，如脊髓挫伤、压迫损伤、缺血损伤和牵拉损伤等，在脊髓全横断、半横断损伤中若未采用显微操作缝合硬脊膜则不适合使用该方法。

此外，实验操作中作者有如下几点体会：①该方法需要掌握安全的脑脊液抽取与药液注射剂量，术中匀速抽吸与注射。参照经寰枕后间隙抽取脑脊液时的采集量[13，25-26]，实验在注射前匀速抽取100 μL脑脊液，抽吸速度设定为200 μL/min，以免引起急性低颅压反应，亦可避免注射时出现脑脊液压力陡然升高进而损害中枢神经系统。②胸段不完全性脊髓损伤动物模型在术后早期出现双后肢运动功能的丧失，支撑躯体进食饮水的能力降低，此时头颈部肌肉是保证正常饮水进食的关键，所以在该操作中应尽可能避免对枕颈部伸肌群功能的影响，实验在显露穿刺区域时锐性剪开枕颈部浅层肌肉，钝性分离枕颈部深层肌肉，关闭切口时只缝合枕颈部浅层肌肉与皮肤，减少了对枕颈部伸肌群的损伤。部分脊髓严重损伤的动物模型中，后肢运动功能很难恢复到支撑躯体质量的程度(BBB评分≥9分)，此时保留头颈后伸功能显得尤为重要。③建立蛛网膜下腔出血模型时的蛛网膜下腔注射剂量可达300 μL[10-11]，但选用的都是300 g以上的大鼠，给药量与大鼠体质量(脑脊液总量)可能有一定关系。但即便是300 g大鼠其脑脊液总量仍仅有580 μL[36]，实验中体质量220-250 g的大鼠脑脊液总量可能更低，这决定了其蛛网膜下腔能耐受的药液总量不可能有较大的提升。在课题组的预实验中，当蛛网膜下腔注射剂量达到250 μL以上时，大鼠出现呼吸加深加快，随后呼吸频率降低甚至死亡。

实验存在一定的局限性。首先，实验虽利用甲苯胺蓝染色观察到给药1.5 h后药物在蛛网膜下腔内的弥散与分布，但只是通过大体观察得到的定性结果，没有进一步定量分析蛛网膜下腔内药物的弥散、分布以及代谢情况，尤其应该在未来探索药物随脑脊液循环在不同时间点于脊髓损伤部位的聚集情况。其次，利用该方法给药量大的优势，实验假定单次给予可缓释/控释药物可能达到常规方法多次给药的效果，这需要结合药剂学与生物材料学的相关成果进行深入的研究与验证，作者所在团队正进行相关研究。再次，实验将安全给药剂量的上限设定为200 μL，这仅针对体质量220-250 g的大鼠，没有根据大鼠体质量的不同探索经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射的最大给药剂量。最后，未来需要在更多的实验中采用该给药方法并实际使用干预药物，以进一步验证经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射的安全性与可靠性。

文章介绍的蛛网膜下腔给药方法安全性强可靠性高，引起大鼠蛛网膜下腔注射区域中枢神经系统损伤、脑脊液漏、抬头困难、体质量长期严重降低或死亡等并发症的风险较小。经寰枕后间隙蛛网膜下腔注射丰富了脊髓损伤实验研究的干预方式，为需要一次性大剂量蛛网膜下腔给药的动物实验提供了一种可供选择的给药方式。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

文题释义：
脊髓损伤动物模型：脊髓损伤动物模型被用于研究脊髓损伤的病理机制并探索最佳的干预措施。大鼠、小鼠、犬、兔是常见的实验对象，损伤部位多选择胸段脊髓。根据损伤时限的不同可分为急性机械性损伤与慢性压迫性损伤，前者又因不同的造模方式而分为挫伤、挤压伤、完全或部分横断损伤及牵拉/脱位损伤等，此外，还有缺血再灌注损伤及化学损伤等致伤方式。
蛛网膜下腔注射：为避免血脑/脊髓屏障阻碍药物分子由血液进入脊髓组织，提高脑脊液中的药物浓度，通过蛛网膜下腔穿刺直接将药物注入蛛网膜下腔内的给药方式，常采用经皮穿刺腰椎棘突间隙、暴露硬脊膜直视下穿刺等方法进入蛛网膜下腔。蛛网膜下腔注射在动物实验中多用于镇痛研究，并作为中枢神经系统创伤、感染、退行性疾病等的干预途径。

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文章不存在治疗药物，模拟药物(生理盐水)不存在治疗功能，注射生理盐水是为了证明该给药方法的给药剂量，并且减少干扰因素，各组行为学评价的结果没有差异可说明实验的给药方式不会影响大鼠的行为学，是安全的。

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