外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡诱导大鼠星形胶质细胞向神经元的转分化

doi:10.12307/2022.764

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (30): 4840-4846.doi: 10.12307/2022.764

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡诱导大鼠星形胶质细胞向神经元的转分化

贯世豪1，黄永辉1，龚爱华2，曹兴兵1，孙海涛1，蔡闯1

1江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000；2江苏大学，江苏省镇江市 212000

收稿日期:2021-08-31 接受日期:2021-10-11 出版日期:2022-10-28 发布日期:2022-03-29
通讯作者: 黄永辉，硕士，主任医师，江苏大学附属医院，江苏省镇江市 212000
作者简介:贯世豪，男，1994年生，山东省临沂市人，汉族，江苏大学在读硕士，主要从事脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
镇江市科技项目 (SH2020053)，项目负责人：黄永辉

Transdifferentiation of rat astrocytes into neurons induced by ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles

Guan Shihao1, Huang Yonghui1, Gong Aihua2, Cao Xingbing1, Sun Haitao1, Cai Chuang1

1Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China; 2Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China

Received:2021-08-31 Accepted:2021-10-11 Online:2022-10-28 Published:2022-03-29
Contact: Huang Yonghui, Master, Chief physician, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
About author:Guan Shihao, Master candidate, Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212000, Jiangsu Province, China
Supported by:
Zhenjiang Science and Technology Project, No. SH2020053 (to HYH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞外囊泡：指由细胞释放的直径为30-200 nm的双层膜结构的小囊泡，携带多种RNA和蛋白质，在细胞间的物质交换和信息传递中起重要作用。
转分化：指将一种类型的体细胞通过改变其细胞表型直接转变为另一种类型细胞的过程，该技术的出现使得病变损伤组织的原位修复得以实现，近年来在星形胶质细胞转分化方面受到广泛关注。

背景：脊髓损伤会使星形胶质细胞增生进而形成胶质瘢痕阻碍神经轴突的形成，而局部炎症微环境进一步加重了神经元的死亡，因此，将星形胶质细胞转分化为神经元既能减轻星形胶质细胞的增生又能增加神经元的数量，可谓是一举两得。而有关外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡能否诱导星形胶质细胞转分化为神经元尚未见相关报道。
目的：探索外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡能否诱导星形胶质细胞转分化为神经元。
方法：①采用组织块直接培养法培养SD大鼠鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞，并且根据其形态以及免疫荧光进行鉴定，收集细胞上清液以提取细胞外囊泡，通过粒径分析、透射电镜及蛋白免疫印迹予以鉴定；②采用胰酶消化法培养SD大鼠大脑星形胶质细胞，并予以鉴定；③星形胶质细胞分2组干预：分别加入外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡(质量浓度为1 g/L，2 mL培养基内加入细胞外囊泡体积为66 μL)和同体积的PBS干预星形胶质细胞72 h；④通过免疫荧光、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹来检测神经元标志物神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200的表达量。
结果与结论：①外胚层间充质干细胞形态呈典型梭形并且高表达间充质干细胞标志蛋白CD44、Nestin 和Vimentin；外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡呈经典茶托样形态，粒径分布在30-200 nm之间，蛋白免疫印迹显示细胞外囊泡标志蛋白CD9，CD63及TSG101呈现阳性表达；②星形胶质细胞形态呈不规则星状且高表达胶质纤维酸性蛋白；③与对照组相比，外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡组可见较多神经元样细胞，胞体呈梭形且饱满，突起增多变长，并且高表达神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200(P < 0.05)；④以上结果提示，外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡可诱导星形胶质细胞转分化为神经元。
缩略语：外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡：ectomesenchymal stem cells-extracellular vesicles，EMSC-EVs

https://orcid.org/0000-0002-7618-7321 (贯世豪)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 间充质干细胞, 细胞外囊泡, 中枢神经系统, 星形胶质细胞, 神经元, 神经元特异性烯醇化酶, 神经丝蛋白200, 转分化

Abstract: BACKGROUND: Spinal cord injury will lead to the proliferation of astrocytes, resulting in glial scar that hinders the formation of axons, and the local inflammatory microenvironment further aggravates the death of neurons. Therefore, converting astrocytes into neurons reduces the proliferation of astrocytes and increases the number of neurons — killing two birds with one stone. However, it has not been reported whether ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles can induce astrocytes to differentiate into neurons.
OBJECTIVE: To explore whether ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles can induce astrocytes to transdifferentiate into neurons.
METHODS: (1) Ectodermal mesenchymal stem cells derived from nasal mucosa tissue of SD rats were cultured by the tissue explant culture and identified according to their morphology and immunofluorescence. The cell supernatant was collected to extract extracellular vesicles, which were identified by particle size analysis, transmission electron microscopy, and western blot assay. (2) The astrocytes of SD rats were cultured and identified by trypsin digestion technique. (3) Astrocytes were divided into two groups for intervention. Ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles (mass concentration:
1 g/L, volume: 66 μL added into 2 mL medium) and PBS of the same volume were added into astrocytes for 72 hours. (4) The expression levels of neuron markers neuron-specific enolase and neurofilament 200 were detected by immunofluorescence, real-time fluorescence quantitative PCR, and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Ectodermal mesenchymal stem cells presented typical spindle shape and high expression of marker proteins CD44, Nestin, and Vimentin. The ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles exhibited classic tea receptor-like morphology. The particle size distribution ranged from 30 nm to 200 nm. Western blot assay demonstrated positive expression of marker proteins CD9, CD63, and TSG101. (2) Astrocytes were star-shaped and highly expressed the marker protein glial fibrillary acidic protein. (3) Compared with the control group, there were more neuron-like cells in the ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles group. The cell bodies were spindle shaped and full; the processes increased and became longer; and the neuron-specific enolase and neurofilament 200 were highly expressed (P < 0.05). (4) The above results suggest that ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles induce astrocytes to transdifferentiate into neurons.

Key words: mesenchymal stem cell, extracellular vesicle, central nervous system, astrocytes, neurons, neuron-specific enolase, neurofilament 200, transdifferentiation

中图分类号:

贯世豪, 黄永辉, 龚爱华, 曹兴兵, 孙海涛, 蔡闯. 外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡诱导大鼠星形胶质细胞向神经元的转分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4840-4846.

Guan Shihao, Huang Yonghui, Gong Aihua, Cao Xingbing, Sun Haitao, Cai Chuang. Transdifferentiation of rat astrocytes into neurons induced by ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(30): 4840-4846.

图/表（结果） 6

2.1 外胚层间充质干细胞的形态及鉴定结果原代培养2 d时可于镜下观察到大多数梭形细胞聚集于鼻黏膜组织周边，此时杂质较多；换液继续培养至6 d及10 d时可见细胞数量逐步增加，最终细胞形态大体一致，背景干净，见图1A-C。免疫荧光结果显示90%的外胚层间充质干细胞表达间充质干细胞标志蛋白CD44、Nestin和Vimentin，提示获得较高纯度的外胚层间充质干细胞，见图1D-L。

2.2 EMSC-EVs的鉴定结果透射电子显微镜观察EMSC-EVs为经典的茶托样结构，其直径为120 nm左右，见图2A；粒径分析结果显示其粒径分布在30-200 nm之间，见图2B；蛋白免疫印迹检测EMSC-EVs相对于外胚层间充质干细胞高表达细胞外囊泡标记蛋白CD9、CD63及TSG101，见图2C；以上表明实验提取的EMSC-EVs符合细胞外囊泡特征，可用于后续实验。

2.3 星形胶质细胞形态及鉴定结果培养的原代星形胶质细胞呈现不规则星状，随着培养天数的增加细胞数量逐渐增多，杂质减少，纯度逐渐增高，见图3A-C。经免疫荧光检测，提取的细胞高表达星形胶质细胞特异标志胶质纤维酸性蛋白，且细胞纯度达到(96.11±1.52)%，达到后续实验的细胞纯度要求，见图3D-F。

2.4 EMSC-EVs对星形胶质细胞存活率的影响随着EMSC-EVs质量浓度的增加，星形胶质细胞数量明显增高，且呈一定浓度依赖性，1.0，1.5 g/L细胞外囊泡均能有效促进细胞增殖，参考相关文献[24]，选用1 g/L EMSC-EVs进行后续实验，见图4A。
2.5 EMSC-EVs干预星形胶质细胞后形态变化以及免疫荧光检测结果 PBS组细胞呈现原有不规则星状，神经元样细胞较少，突起较短且少，见图4B，而EMSC-EVs干预72 h后可见EMSC-EVs组细胞呈现神经元样，胞体饱满呈梭形，突起增多变长，见图4C。采用免疫荧光检测EMSC-EVs干预72 h后神经元特异性蛋白表达，EMSC-EVs组显示成熟神经元表型特征神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200的表达较PBS组显著增多(P < 0.01，P < 0.001，n=3)，见图5A-M。
2.6 实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹检测EMSC-EVs干预后细胞中神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200的表达 EMSC-EVs组较PBS组显著高表达神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200(P 均 < 0.001，n=3)，见图5N-P，以上结果提示 EMSC-EVs可以诱导大鼠星形胶质细胞向神经元转分化。

2.7 生物相容性由图4A可见，不同质量浓度的细胞外囊泡均促进星形胶质细胞生长，未发生抑制星形胶质细胞生长而发生的生物毒性作用，因此说明具有良好的生物相容性。

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引言

随着人口老龄化的加剧，中枢神经系统疾病的发生率也日益剧增，其中脑缺血、脊髓损伤、阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的主要特征是神经元的退化和死亡，且很少能在损伤部位进行修复再生[1-4]。因此，如何改善损伤部位的神经功能缺损，促进缺血脑组织的神经元发生以及损伤神经元的修复是中枢神经系统疾病治疗领域的研究热点和难点[5-6]。

近年来，间充质干细胞移植疗法逐渐进入研究者的视野。研究表明，在大鼠脊髓损伤区域移植的间充质干细胞可分化为神经元以及少突胶质细胞，并且在移植数日后大鼠的运动功能在一定程度上得以改善[7-8]。同时，还有研究指出，移植的间充质干细胞在损伤处能最终分化为神经元并存活下来的数量太少，并且大部分没有显示出特定的神经元电生理特性[9-10]。因此有学者指出，间充质干细胞主要通过释放细胞外囊泡而发挥其神经再生功能[7]。细胞外囊泡是一类含蛋白质、核酸、脂质、细胞因子、神经营养因子、生长因子等物质的囊泡，在行使其母体细胞功能中发挥了重要作用，加上其无致瘤性、免疫原性低、生物相容性高、可通过血脑屏障等优势，近年来在脊髓损伤的治疗中受到广泛关注[11-13]。

星形胶质细胞是哺乳动物中枢神经系统中分布最广泛的一类细胞，起初被认为仅有机械支持作用，但后续实验证实其功能具有多样性[14-15]。在脊髓损伤后，星形胶质细胞通过活化并增殖以形成胶质瘢痕从而保护邻近组织免受进一步损伤[16-18]。然而，胶质瘢痕持续存在形成的物理屏障阻碍了突触的传递，同时胶质瘢痕会分泌轴突生长的抑制剂，抑制了损伤区域的神经元生长[3，19]。近年来有文献指出通过过表达NEUROD1、ASCL1等转录因子可以将损伤区域的星形胶质细胞直接转分化为神经元，这为脊髓损伤治疗提供了新的可能[20-21]。星形胶质细胞向神经元转分化是指星形胶质细胞在某些外部因素作用下发生程序化改变，上调神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白200而达到向类神经元转化的一种形式。神经丝蛋白200主要存在于神经元的轴突中，由神经元大量合成，在神经修复再生中发挥作用；神经元特异性烯醇化酶是一种在中枢神经中存在的蛋白酶，作为神经元异性识别的抗体，常被用来研究神经元发育时的生长情况。在以往的研究中，骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞深受学者的青睐，然而其在取材及伦理方面的问题一直无法避免[22]。课题组前期研究发现，外胚层间充质干细胞是来源于发育早期外胚层神经嵴的成体干细胞，鼻黏膜是其重要的细胞来源，因其取材方便，不涉及伦理问题，因此更加有利于实验研究及可能的临床应用[23]。

迄今为止，外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡(ectomesenchymal stem cells-extracellular vesicles，EMSC-EVs)诱导星形胶质细胞转分化为神经元的相关文章尚未见报道。该研究将EMSCs-EVs在体外作用于星形胶质细胞，检测神经元特定标志物以验证其是否具有促进星形胶质细胞向神经元转分化的作用，从而为EMSC-EVs治疗脊髓损伤等中枢神经系统疾病提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外培养大鼠鼻黏膜间充质干细胞并提取其细胞外囊泡，体外培养大鼠星形胶质细胞；细胞外囊泡干预第3代星形胶质细胞。
1.2 时间及地点实验于2020年9月至2021年7月在江苏大学基础医学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄雌性SD大鼠6只，体质量100 g左右，用于分离提取外胚层间充质干细胞；新生24 h SD大鼠6只，体质量5-10 g，用于分离提取星形胶质细胞。所有动物由江苏大学实验动物中心提供，动物合格证编号：NO.202105363，NO.202110777，所有动物均符合江苏大学附属医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。
1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F-12培养基、PBS(Hyclone)；胎牛血清、青霉素-链霉素(Gibco)；细胞外囊泡提取试剂(System Biosciences)；L-多聚赖氨酸(Sigma)；0.25%胰蛋白酶(上海生兴公司)；TRIzol 试剂(日本TaKaRa公司)；引物(中国南京金斯瑞公司)；miScript SYBR Green PCR 试剂盒(德国QIAGEN公司)；DAPI染液(碧云天)；荧光二抗(美国Abcam公司)；CD9抗体、CD63抗体、TSG101抗体、神经丝蛋白200抗体、神经元特异性烯醇化酶抗体、胶质纤维酸性蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG抗体(武汉ABclonal公司)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo Molecular Technologies公司)；AvantiTM J-30I Centrifuge超高速离心机、OptimaTM L-90K Ultracentrifuge超速离心机、AllegraTM X-12R Centrifuge 高速离心机、配套离心管(美国贝克曼公司)；外科手术器械(上海医疗器械有限公司)；细胞超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；CO2细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；可调微量移液器(德国Eppendorf公司)；相差倒置显微镜和荧光倒置显微镜(Olympus公司)；Western
电泳仪 (美国Bio-Rad公司)；Tecnai 12透射电镜(荷兰Philips公司)；动态光粒子散射仪(美国Wyatt Technology 公司)。所用其他试剂及实验所需仪器均为江苏大学基础研究所2508实验室提供。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠外胚层间充质干细胞分离与鉴定在无菌条件下将100 g左右SD大鼠麻醉后处死，乙醇及碘伏消毒鼻部，完整仔细地取出鼻中隔于PBS中清洗并分离全层鼻黏膜；清洗鼻黏膜3次至无色，然后用眼科剪充分剪碎并将其接种于细胞培养皿内，加入4 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基(含青霉素和链霉素各100 U/mL)，在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱内培养，每隔2 d半量换液，当细胞生长融合至80%时，将其标记为第1代并消化传代。取第3代细胞，在光镜下观察其形态，然后接种于24孔板，待细胞铺满培养板底的80%时，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBST洗3次，然后0.5% Triton破膜15 min，3%牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗CD44、Nestin和Vimentin(1∶100)，4 ℃孵育过夜；然后避光加入荧光二抗(1∶100)，暗盒常温下孵育1 h，DAPI染核，甘油封固后于荧光显微镜下拍照验证外胚层间充质干细胞提取是否成功。

1.4.2 EMSC-EVs的分离和鉴定使用含有体积分数为10%无细胞外囊泡血清(120 000×g超速离心 16 h获得)的DMEM/F-12培养基培养外胚层间充质干细胞，共收集细胞上清约200 mL：使用高速离心机500×g离心10 min、2 000×g离心15 min、10 000×g离心30 min去除死细胞及细胞碎片；使用0.22 μm无菌滤器过滤上清；超速离心机100 000×g离心3 h后弃上清，PBS重悬离心后的沉淀，重复超速离心1次；最后用150 μL PBS重悬沉淀，保存于-80 ℃备用。
取适量细胞外囊泡悬液滴于铜网，然后用2%磷钨酸负染10 min，将标本置于透射电镜下观察、拍照。利用动态光粒子散射仪检测细胞外囊泡的大小。使用BCA试剂盒检测细胞外囊泡的蛋白浓度，利用蛋白免疫印迹检测被封装到细胞外囊泡中的特异性标志蛋白CD9、CD63和 TSG101的表达(最终测得细胞外囊泡的质量浓度为30 g/L)：收集外胚层间充质干细胞及EMSC-EVs，加入含蛋白酶磷酸酶抑制、PMSF的蛋白裂解液充分混匀冰上裂解10 min，刮取混合物移入EP管，4 ℃预冷离心机12 000×g离心15 min；按照2∶1比例加入2×上样缓冲液混匀后置于100 ℃金属浴煮10 min；再次12 000×g离心15 min；之后取适量蛋白质样品进行凝胶电泳并转至PVDF膜上；5%牛血清白蛋白封闭1 h之后加入一抗β-Tubulin抗体、CD9抗体、CD63抗体和TSG101抗体(1∶1 000) 于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次8 min；用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)于室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min；最后对条带进行曝光显影。
1.4.3 大鼠星形胶质细胞的分离、原代培养及鉴定新生SD大鼠用乙醇浸泡消毒后，无菌条件下快速取出大脑皮质，PBS清洗并剪碎，加入含 EDTA的0.125%蛋白酶消化；加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基(含青霉素和链霉素各100 U/mL)终止消化，轻柔吹打混匀后用200目滤网过滤除去较大未消化组织，过滤后的液体移至15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min；使用上述DMEM/F-12培养液重悬沉淀，接种于多聚赖氨酸包被的6 cm细胞培养皿中，在37 ℃、体积分数为 5%CO2培养箱中培养24 h后进行半量换液，之后每隔2 d半量换液；细胞铺满皿底80%时将培养皿置于培养箱摇床，200 r/min 速度摇晃4 h以除去小胶质细胞等。当细胞铺满皿底85%时进行消化传代。选用第3代星形胶质细胞接种于24孔板，待细胞铺满板底80%时用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBST洗3次，每次5 min；PBS配制的0.5% Triton X-100破膜15 min，PBS洗3次，每次5 min；3% 牛血清白蛋白室温封闭1 h；吸掉封闭液，加入一抗胶质纤维酸性蛋白(1∶200)，4 ℃孵育过夜；PBST 洗3次，每次5 min，避光加入荧光二抗(1∶100)，暗盒常温孵育1 h；DAPI染核，甘油封固后于荧光显微镜下拍照。
1.4.4 CCK-8 法检测细胞存活率将第3代星形胶质细胞以每孔10 000个(100 μL)密度接种于96孔板，于 37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱培养，待细胞贴壁后，PBS洗3遍，加入不同质量浓度(0，0.1，0.5，1.0，1.5 g/L)EMSCs-EVs干预72 h，使用 CCK-8试剂盒检测细胞存活率。
1.4.5 实验分组及干预取对数生长期第3代星形胶质细胞，以每孔5×104个接种于6孔板，随机分为PBS组及EMSCs-EVs组，用含体积分数为10%去细胞外囊泡胎牛血清(120 000×g超速离心16 h获得)的DMEM/F-12培养基进行扩增培养，当细胞生长融合度达到80%时，分别将同体积(66 μL)的PBS、EMSCs-EVs(质量浓度为1 g/L)加入对应的含有2 mL培养基的6孔板内，放入37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱干预72 h，采用免疫荧光、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检测神经元相关指标表达。
1.4.6 细胞免疫荧光染色检测转分化效率使用40 g/L多聚甲醛分别固定两组星形胶质细胞15 min，PBST洗3次，每次5 min；PBS配制的0.5% Triton X-100破膜15 min，PBS洗3次，每次5 min；3% 牛血清白蛋白室温封闭1 h；吸去封闭液，加入神经丝蛋白200一抗及神经元特异性烯醇化酶一抗4 ℃孵育过夜；第2天PBST洗3次，每次5 min，避光加入相应荧光二抗(1∶100)，暗盒常温孵育1 h；DAPI染核(1∶100)，甘油封固后于荧光显微镜下观察相应蛋白的表达。
1.4.7 实时荧光定量PCR检测mRNA水平使用 TRIzol试剂从两组星形胶质细胞中提取总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒将RNA反转录为cDNA，使用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR。根据内参GAPDH的表达，使用 2-ΔΔCT法计算相关mRNA的相对表达。数据用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析，引物序列见表1。

1.4.8 蛋白免疫印迹检测蛋白质水平去除两组细胞的培养基，加入现配的预冷的蛋白裂解试剂(苯甲基磺酰氟、蛋白酶磷酸酶抑制剂)冰上裂解10 min；刮取内容物移入EP管中，4 ℃预冷离心机12 000×g 离心15 min；按照2 ∶ 1比例加入2×上样缓冲液混匀，置于100 ℃金属浴煮10 min，再次12 000×g离心15 min；取适量蛋白质样品行SDS-PAGE，60 V电泳45 min后调至100 V继续电泳80 min，300 mA湿转150 min至PVDF膜；用含5%牛血清白蛋白的TBST封闭1 h，加入一抗神经丝蛋白200(1∶1 000)、一抗神经元特异性烯醇化酶(1∶1 000)、一抗β-Tubulin( 1∶1 000 )于4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min；用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000)室温孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后对条带进行曝光显影。
1.5 主要观察指标免疫荧光染色、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检测EMSCs-EVs干预后细胞中神经丝蛋白200及神经元特异性烯醇化酶的表达。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义，每个实验至少重复 3 次。

讨论

中枢神经系统损伤是一种永久性致残类疾病，它会导致运动和感觉系统的永久性神经功能缺失，因此，恢复受损的脊髓神经网络至关重要。在过去普遍认为神经细胞不可再生，然而间充质干细胞的发现打破了这一观念[25]。间充质干细胞是多能成体干细胞，可以分化为不同类型的细胞，有研究表明使用间充质干细胞作为种子细胞在损伤部位进行移植可以促使神经元的修复，通过静脉注射间充质干细胞后发现大鼠下肢运动功能得以改善，然而改善的效果仍然十分有限。随着研究深入，更多资料表明间充质干细胞外囊泡在损伤神经功能恢复中发挥了更重要的作用，且细胞外囊泡中携带大量母体细胞的RNA、蛋白质和脂质等，同时具有低免疫原性、非致瘤性、保存方便、可透过血脑屏障等优点[26]，在脊髓损伤治疗中较细胞治疗具有更大优势[27-30]。该实验重点研究了EMSC-EVs是否能够诱导星形胶质细胞向神经元的转分化。实验选取生长状态良好、细胞形态相对一致的第3代星形胶质细胞进行诱导分化，结果显示，EMSC-EVs干预后神经元特异性烯醇化酶和神经丝蛋白200的mRNA及蛋白表达较PBS组明显增加，说明EMSC-EVs能够诱导星形胶质细胞向神经元的转分化。

星形胶质细胞在中枢神经系统损伤中的作用需要辩证看待，在损伤早期，星形胶质细胞被激活从而起到防止炎症扩散及防御的作用，然而过度的星形胶质细胞增生则会形成胶质瘢痕阻碍神经的修复，胶质瘢痕被认为是神经元再生的机械屏障[21，31]。除此之外，它还分泌众多抑制性蛋白因子，其中硫酸软骨素蛋白多糖由瘢痕组织中的反应性星形胶质细胞和其他细胞大量表达，被认为是这一时期神经元及轴突再生的主要抑制剂[32]。因此，诱导星形胶质细胞转分化为神经元治疗中枢神经系统损伤这一策略不仅能减轻胶质瘢痕形成的神经抑制作用，还能促使神经元修复再生，最重要的是，相比细胞移植而言，原位星形胶质细胞转分化的神经元可能比外部移植的细胞更容易整合到局部环境中，并且细胞外囊泡相比干细胞移植而言，它可以通过血脑屏障并显著降低了致瘤性，这为中枢神经系统损伤的治疗提供了新的思路[33]。随着转分化诱导条件日渐成熟且诱导方式多种多样，这为神经系统退变和神经损伤患者带来了曙光[34-38]。

大量研究表明EMSC-EVs对中枢神经系统具有重要的免疫调节作用，先前有很多学者已证明星形胶质细胞可在生理状态下转分化为神经元，YIN等[39]通过将NOTCH、GSK-3β、TGF-β及BMP四条通路的抑制剂混合物加入星形胶质细胞中发现均可将星形胶质细胞转分化为神经元，而BRULET等[20]将携带NeuroD1基因的反转录病毒感染星形胶质细胞，以探讨NeuroD1过表达能否介导星形胶质细胞转分化为神经元，结果发现在纹状体中观察到了新转化的成熟神经元，但新生成的神经元总数仍然较低，效率有限。LIU等[40]证实间充质干细胞移植通过Notch信号通路调控改善骨质减少，COLLETTI等[41]研究证实携带miR-375的神经母细胞瘤细胞外囊泡促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。因此结合以上研究作者猜测EMSCs-EVs可以通过调控NOTCH信号通路从而诱导星形胶质细胞转分化为神经元，并鉴于细胞外囊泡含物质的复杂性，具体是EMSCs-EVs中何种物质起诱导转分化的作用还需进一步研究，并且转分化后的“神经元”是否为具有功能的真正神经元、能否与周围神经元建立联系并产生回路以及存活时间尚需探讨，损伤血管的恢复以及局部炎症的调控也是不可忽视的一部分。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡诱导大鼠星形胶质细胞向神经元的转分化

Transdifferentiation of rat astrocytes into neurons induced by ectodermal mesenchymal stem cells-derived extracellular vesicles

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