1.1 设计 细胞学体外实验,两组间比较釆用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2019年7月至2020 年2月在武汉市第一医院(武汉市中西医结合医院)完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 人成骨细胞株OB-6(上海冠导生物工程有限公司)。
1.3.2 主要仪器及试剂 流式细胞仪(贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司,型号:DxFLEX);石蜡切片机(湖北孝感阔海医疗科技有限公司,型号:KH-Q320);-80 ℃超低温冰箱(广州傲雪制冷设备有限公司,型号:YCD-263);恒温水浴箱(常州市金坛友联仪器研究所,型号:HH-600);低温高速离心机(Eppendorf 中国有限公司,型号:5427R);生物显微镜(北京上光仪器有限公司,型号:XSP-9CA);胎牛血清(上海江林生物科技有限公司);线粒体膜电位检测试剂盒(上海恒远生物科技有限公司);亲环蛋白D多克隆抗体(上海沪震实业有限公司);细胞色素C抗体(武汉艾美捷科技有限公司);SC79(北京百奥莱博科技有限公司,纯度超过98%);地塞米松(广东华南药业集团有限公司,生产批号:44024469,规格:0.75 mg×100 s);磷酸化维生素C(苏州维华化工有限公司);CCK-8溶液(博恩生物科技有限公司);乳酸脱氢酶检测试剂盒(上海沪震实业有限公司发);RPMI 1640培养液(北京泊宁乐成科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养 将OB-6细胞放入含体积分数10%胎牛血清、50 g/L磷酸化维生素C及100 U/mL青链霉素的RPMI 1640培养液中,置于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱内进行培养,当细胞密度达85%左右时进行传代培养。培养过程中及时更换培养液,当细胞完全贴壁后弃掉旧培养液,以适量PBS冲洗,加入10 mL含体积分数10%胎牛血清、50 g/L磷酸化维生素C、100 U/mL青链霉素的RPMI 1640培养液。细胞至少需要稳定传3代后方可进行正式实验。当细胞生长至80%时吸走培养液,加入0.25%胰蛋白酶1 mL进行消化,当细胞变圆变小且贴壁状态逐渐减弱时终止消化。反复吹打直至底部细胞脱落,取脱落细胞与细胞悬液移至离心管中离心,去除上清液,加入新鲜培养基混匀。取混匀细胞悬液放于培养箱中继续培养。
1.4.2 细胞分组处理 取传代培养后生长状态良好的第2代细胞,培养至对数生长期,以10 000个/孔接种至96孔板,每孔接种150 μL,分4组处理:对照组常规培养,地塞米松组加入2 μmol/L地塞米松处理24 h;SC79组加入20 μmol/L SC79处理24 h;SC79+地塞米松组首先加入20 μmol/L SC79处理2 h,再加入2 μmol/L 地塞米松处理24 h。每组设置5个复孔。
1.4.3 细胞活性检测 处理结束后,每孔加入CCK-8溶液20 μL,置于细胞培养箱中继续培养2 h,使用酶标仪检测520 nm处的吸光度值,分析细胞活性变化。
1.4.4 细胞死亡情况检测 处理结束后,采用乳酸脱氢酶释放实验检测乳酸脱氢酶释放即细胞死亡情况。分别设置空白对照孔、样品对照孔、样品最大酶活性对照孔及药物孔,做好标记,按照实验分组给予相应的处理。至检测时间前1 h于样品最大酶活性对照孔中加入培养液体积10%的乳酸脱氢酶试剂,混匀,继续孵育直至预订时间,使用离心机以1 000 r/min离心5 min,取各孔上清液,使用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测,计算乳酸脱氢酶释放。乳酸脱氢酶释放=释放的乳酸脱氢酶/(释放的乳酸脱氢酶+裂解物中的乳酸脱氢酶)。
1.4.5 细胞凋亡检测 处理结束后,各孔加入胰蛋白酶消化细胞,1 500 r/min离心5 min,去除上清液,分别加入5 μL Annexn V及5 μL PI,混匀,避光孵育20 min,上流式细胞仪检测,计算细胞凋亡率。
1.4.6 细胞凋亡相关蛋白表达检测 处理结束后,采用分光光度法检测细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2的活性。加入细胞裂解液充分裂解细胞,1 000 r/min离心5 min,取上清液,采用BCA法检测蛋白浓度,分别加入20 μL Reaction Buffer及2 μL Caspase-3(或Bax、Bcl-2)底物,避光孵育2 h,利用分光光度计检测405 nm处Caspase-3、Bax、Bcl-2的吸光度值。
1.4.7 线粒体膜电位强度检测 处理结束后,采用JC-1染料检测线粒体膜电位变化。向待测细胞液中加入终浓度2 μmol/L的JC-1溶液10 μL,置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养20 min;PBS冲洗,离心,使用500 μL PBS重悬细胞,取150 μL/孔细胞转移至96孔板中,进行荧光酶标板分析;使用cell questpro软件分别检测激发波长488 nm、发射波长535 nm(绿色荧光)及激发波长550 nm、发射波长600 nm(红色荧光)的平均荧光强度,以红绿荧光比值代表线粒体膜电位强度。
1.4.8 氧化应激相关因子蛋白表达检测 处理结束后,采用蛋白质印迹法测定细胞亲环蛋白D、细胞色素C表达水平。提取细胞总蛋白,采用BCA法检测细胞总蛋白浓度,准备蛋白样品,制作电泳凝胶,上样、电泳、转膜、封闭,PCST洗膜,孵育一抗亲环蛋白D多克隆抗体(稀释比例1∶5 000)、细胞色素单克隆抗体(稀释比例1∶1 000),洗膜,孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(稀释比例1∶5 000),洗膜,ECL发光液发光,X射线机器曝光,采用ImageJ软件分析条带灰度。
1.5 主要观察指标 各组细胞的活性、死亡及凋亡情况。
1.6 统计学分析 采用 Kolmogorov-Smirnov法对计量资料进行正态性检验,各组数据均符合正态性分布,对于符合正态性分布的计量资料,组间两两比较釆用独立样本t检验,多组间计较采用单因素方差分析,两两比较采用独立样本t检验,均以x±s表示。采用SPSS 20.0软件包进行统计学数据分析,以统计所得结果P < 0.05视为差异有显著性意义。该文统计学方法已经徐礼森专家审核。