亚砷酸钠对AML12肝细胞氧化应激、凋亡损伤及Hippo信号通路的影响

doi:10.12307/2022.822

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (26): 4186-4191.doi: 10.12307/2022.822

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

亚砷酸钠对AML12肝细胞氧化应激、凋亡损伤及Hippo信号通路的影响

赵哲仪1，2，王正蓉3，2，方兴艳2，王甜4，谢婷婷1，2

1贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004；3贵州医科大学附属医院产前诊断中心，贵州省贵阳市 550004；4山东省立第三医院检验科，山东省济南市 250031

收稿日期:2021-04-01 接受日期:2021-05-12 出版日期:2022-09-18 发布日期:2022-03-08
通讯作者: 谢婷婷，博士，副教授，硕士生导师，贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州省贵阳市 550004；贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:赵哲仪，女，1996年生，四川省南充市人，汉族，硕士，主要从事砷中毒机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81560514)，课题名称：p53介导的细胞凋亡通路在燃煤砷污染致机体肝损伤中的作用及银杏叶片干预研究，项目负责人：谢婷婷

Effects of sodium arsenite on oxidative stress, apoptosis and Hippo signaling pathway in AML12 hepatocytes

Zhao Zheyi1, 2, Wang Zhengrong3, 2, Fang Xingyan2, Wang Tian4, Xie Tingting1, 2

1Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 3Prenatal Diagnosis Center, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 4Department of Clinical Laboratory, Shandong Provincial Third Hospital, Jinan 250031, Shandong Province, China

Received:2021-04-01 Accepted:2021-05-12 Online:2022-09-18 Published:2022-03-08
Contact: Xie Tingting, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Clinical Laboratoay, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Zhao Zheyi, Master, Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560514 (to XTT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Hippo 信号通路：是最初在果蝇体内发现的、高度保守的激酶级联反应通路，其可通过调节氧化应激、细胞凋亡、细胞增殖和分化等过程控制器官生长发育。而亚砷酸钠的肝毒性作用与氧化应激、凋亡密切相关。

背景：肝脏作为砷毒作用的主要靶器官，成为砷毒性作用机制相关研究的关注焦点。
目的：探究亚砷酸钠(NaAsO2)对AML12肝细胞氧化应激、凋亡的作用及Hippo信号通路中关键分子表达的影响。
方法：AML12肝细胞分别暴露于0，10，15，20，25，30 μmol/L亚砷酸钠 24 h，倒置相差显微镜观察细胞形态变化，CCK-8法检测细胞存活率，荧光探针染色结合流式细胞术检测细胞内活性氧表达水平，化学比色法检测细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶3相对活性，异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡，实时荧光定量PCR检测Yes相关蛋白mRNA表达水平，Western blot检测磷酸化哺乳动物不育系20样激酶1/2、磷酸化Yes相关蛋白、Yes相关蛋白的蛋白表达水平。
结果与结论：①与对照组相比，随着亚砷酸钠浓度的增加：AML12肝细胞存活率逐渐降低；AML12肝细胞内活性氧表达水平逐渐升高；AML12肝细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶3相对活性及细胞凋亡率逐渐升高；AML12肝细胞Yes相关蛋白mRNA相对表达量无明显变化；AML12肝细胞磷酸化哺乳动物不育系20样激酶1/2和磷酸化Yes相关蛋白的蛋白相对表达量逐渐升高、Yes相关蛋白的蛋白相对表达量逐渐降低；②提示亚砷酸钠所致AML12肝细胞氧化应激和凋亡损伤可能与Hippo信号通路的激活有关。
缩略语：哺乳动物不育系20样激酶1/2：mammalian sterile20-like kinases1/2，MST1/2；Yes相关蛋白：Yes-associated protein，YAP；甘油醛-3-磷酸脱氢酶：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH

https://orcid.org/0000-0003-3710-9547 (赵哲仪)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 亚砷酸钠, AML12 肝细胞, 氧化应激, 凋亡, Yes相关蛋白, Hippo信号通路

Abstract: BACKGROUND: As the main target organ of arsenic toxicity, the liver has become the focus of research on the mechanism of arsenic toxicity.
OBJECTIVE: To investigate the effects of sodium arsenite (NaAsO2) on oxidative stress and apoptosis of AML12 hepatocytes, as well as the influence on the expression of key molecules in the Hippo signaling pathway.
METHODS: AML12 hepatocytes were cultured in medium containing 0, 10, 15, 20, 25, 30 μmol/L NaAsO2 for 24 hours. The cell morphology was observed by phase-contrast microscopy and cell viability was assessed by cell counting kit-8 assay. The content of intracellular reactive oxygen species was detected by fluorescent probe technique combined with flow cytometry. The activity of caspase-3 was measured by colorimetry. The apoptotic rate of hepatocytes was detected by annexin V/propidium iodide double staining combined with flow cytometry. The mRNA expression level of Yes-associated protein was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The protein expression level of phosphorylated mammalian sterile20-like kinases1/2, phosphorylated Yes-associated protein and Yes-associated protein were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the viability of AML12 hepatocytes decreased gradually along with the increase of NaAsO2 concentration. With the increase of NaAsO2 concentration, the reactive oxygen species contents, the activity of caspase-3 and the apoptotic rate increased gradually in AML12 hepatocytes. There was no significant change in the mRNA expression of Yes-associated protein in NaAsO2 treated AML12 hepatocytes. NaAsO2 elevated the relative protein expression of phosphorylated mammalian sterile20-like kinases 1/2 and phosphorylated Yes-associated protein, while inhibited the relative protein expression of Yes-associated protein. Therefore, NaAsO2-induced oxidative stress and apoptosis injury in AML12 hepatocytes may be related to the activation of Hippo signaling pathway.

Key words: sodium arsenite, AML12 hepatocyte, oxidative stress, apoptosis, Yes-associated protein, Hippo signaling pathway

中图分类号:

赵哲仪, 王正蓉, 方兴艳, 王甜, 谢婷婷. 亚砷酸钠对AML12肝细胞氧化应激、凋亡损伤及Hippo信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4186-4191.

Zhao Zheyi, Wang Zhengrong, Fang Xingyan, Wang Tian, Xie Tingting. Effects of sodium arsenite on oxidative stress, apoptosis and Hippo signaling pathway in AML12 hepatocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(26): 4186-4191.

图/表（结果） 7

2.1 亚砷酸钠抑制AML12细胞活力且呈浓度依赖性检测不同浓度亚砷酸钠处理组AML12细胞的存活率发现，与对照组(0 μmol/L亚砷酸钠)相比，15-30 μmol/L亚砷酸钠组细胞存活率均显著降低(P < 0.05)，见图1。且随着亚砷酸钠浓度的增加，AML12细胞的存活率逐渐降低，呈剂量-效应关系。

2.2 亚砷酸钠引起AML12 细胞形态变化倒置相差显微镜观察亚砷酸钠对AML12细胞形态的影响发现，对照组细胞形态饱满呈多角形、生长状态良好，细胞间连接紧密呈铺路石样整齐排列；与对照组相比，10 μmol/L亚砷酸钠组细胞形态无明显差异；而在15-30 μmol/L亚砷酸钠组，随亚砷酸钠浓度的增加，细胞融合率逐渐降低，细胞的间隙逐渐变宽，细胞的排列逐渐失去规则，细胞逐渐失去正常形态且轮廓逐渐模糊不清，细胞内颗粒与空泡逐渐增多；细胞贴壁性逐渐变差，破碎裂解及脱落漂浮的细胞越来越多，见图2。

2.3 亚砷酸钠促进AML12细胞发生氧化应激检测不同浓度亚砷酸钠处理组AML12细胞内活性氧表达水平发现，经细胞数量均一化处理后，10-30 μmol/L亚砷酸钠组细胞的荧光峰值逐渐右移，细胞内活性氧染料的荧光逐渐增强，见图3。与对照组相比，10-30 μmol/L亚砷酸钠组细胞内活性氧表达水平显著升高(P < 0.05)，见表2。

2.4 亚砷酸钠促进 AML12细胞凋亡化学比色法检测各组AML12细胞内促凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶3相对活性发现，与对照组相比，10-30 μmol/L亚砷酸钠组细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶3相对活性明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4A。流式细胞术检测亚砷酸钠对AML12细胞凋亡的影响，结果表明0，10，15，20，25，30 μmol/L亚砷酸钠组细胞凋亡率分别为(3.12±0.48)%、(4.34±0.33)%、(11.52±2.34)%、(14.13±1.22)%、(23.12±1.73)%及(31.61±1.77)%。与对照组相比，15-30 μmol/L亚砷酸钠组细胞凋亡率明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4B，C。

2.5 亚砷酸钠处理的 AML12肝细胞YAP mRNA水平无明显变化实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，各染砷组YAP mRNA相对表达量相比差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.6 亚砷酸钠诱导AML12细胞p-MST1/2、p-YAP蛋白水平增加、YAP 蛋白水平降低 Western blot结果显示，随着亚砷酸钠浓度增加，p-MST1/2 蛋白相对表达量逐渐升高，与对照组相比，15-30 μmol/L亚砷酸钠组p-MST1/2蛋白相对表达量明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6A；随着亚砷酸钠浓度增加，p-YAP蛋白相对表达量逐渐升高，而YAP蛋白相对表达量逐渐降低，与对照组比较，15-30 μmol /L 亚砷酸钠组p-YAP/YAP蛋白相对表达量比值逐渐升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6B。

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引言

砷及其化合物是广泛分布于自然界中的化学毒物，常通过饮水、空气或食物等途径进入机体而诱发急、慢性砷中毒。砷中毒是最常见的对人体损害严重的化学污染性疾病之一，可致全身多系统多器官损伤、甚至癌症[1-2]。而肝脏作为含砷类化合物储存和代谢的场所，也是受砷毒作用危害较大的靶器官之一[3]。砷致肝损伤机制一直是国内外公共卫生领域研究的焦点，但至今尚未阐明。
越来越多的研究表明，氧化应激和细胞凋亡在砷致肝损伤过程中发挥重要作用[4]。Hippo 通路是一条具有进化保守性的信号通路，参与调控细胞氧化应激、凋亡等多种生物学过程[5]。当 Hippo 通路被激活时，位于通路上游的关键信号传导分子哺乳动物不育系20样激酶1/2(mammalian sterile 20-like kinases1/2，MST1/2)被磷酸化激活，并进一步通过级联激酶复合物使下游的核心效应因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)发生磷酸化并降解[6]。而未发生磷酸化的YAP可转位至细胞核促进一系列与抗氧化应激、凋亡相关的靶基因表达[7]。许多参与砷致肝损伤的抗氧化蛋白和抗凋亡分子均可受到YAP的调控[8-9]。课题组前期发现，亚砷酸钠可调控鼠双微粒体基因2-p53信号通路并导致肝细胞发生凋亡[10]，而该通路可能也受Hippo通路调控[11]。由此可见，Hippo 信号通路与砷致肝损伤机制密切相关，但目前尚未见相关报道。此次研究以AML12肝细胞为实验对象，亚砷酸钠(NaAsO2)为处理因素，探究砷对肝细胞氧化应激、凋亡以及Hippo通路的影响，以期为进一步阐明砷致肝损伤机制提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学分组观察实验，组间比较采取单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 法。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年3月在贵州医科大学分子生物学实验室完成。
1.3 材料 AML12小鼠肝细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司(引自中国科学院上海细胞研究所细胞库)；亚砷酸钠购自Merck公司；含EDTA或不含EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液、DMEM/F-12培养基、PBS均购自Gibco公司；胎牛血清购自Corning公司；青霉素、链霉素购自Hyclone公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)购自东仁化学科技(上海)有限公司；二甲基亚砜、蛋白提取试剂盒和SDS-PAGE凝胶制备试剂盒均购自北京索莱宝公司；化学发光试剂购自Millipore公司；活性氧测试盒购自南京建成生物工程研究所；半胱天冬氨酸蛋白酶3活性检测试剂盒购自上海贝博生物有限公司；异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司；TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 均购自大连 TaKaRa公司；BCA法蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔抗小鼠YAP单克隆抗体、兔抗小鼠GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 均购自Abcam公司；兔抗小鼠p-MST1/2、p-YAP单克隆抗体购自 Cell Signaling Technology公司。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养、亚砷酸钠染毒处理及分组小鼠正常肝细胞AML12用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，于体积分数5%CO2 环境、37 ℃恒温条件下培养。待细胞处于对数生长期时，进行传代、冻存及后续实验。细胞于96孔板和6孔板的接种密度分别为1×104个/孔、3×105/孔(以下实验的接种密度均按此标准)。亚砷酸钠染毒处理：待细胞融合率达80%时，换以含不同浓度亚砷酸钠的培养基继续培养24 h。0 μmol/L亚砷酸钠处理组为对照组，10，15，20，25，30 μmol/L 亚砷酸钠处理组为实验组。
1.4.2 CCK-8 法检测AML12细胞存活率取处于对数生长期的AML12细胞接种于 96 孔板中，暴露于亚砷酸钠 24 h，各孔加入10 μL CCK-8溶液继续培养1 h。采用酶标仪检测在450 nm波长处的吸光度(A)值。实验同时设置空白组(加入等体积的DMEM/F-12培养基，不含细胞和亚砷酸钠)，每组设置6个复孔，实验重复3次。按照下列公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=[(A处理组-A空白组)/(A对照组-A空白组)]×100%。
1.4.3 流式细胞术检测AML12细胞内活性氧的表达水平取处于对数生长期的AML12细胞接种于6孔板中，待到进行亚砷酸钠染毒处理后，弃去原培养液，加入含10 μmol/L DCFH-DA工作液的 DMEM/F-12培养基继续培养1 h，消化收集细胞并用PBS洗涤2次，立即用流式细胞仪检测细胞内活性氧的表达水平。
1.4.4 化学比色法检测AML12细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶3活性取处于对数生长期的AML12细胞接种于90 mm细胞培养皿中，待到进行亚砷酸钠染毒处理后，各组均消化收集5×106个细胞至离心管内，加入100 μL裂解缓冲液，置于冰上裂解45 min期间，每隔5 min高速涡旋振荡15 s。裂解完成后在4 ℃，12 000×g条件下离心15 min，取上清置于冰上待测。根据说明书要求配制半胱天冬氨酸蛋白酶3活性检测反应体系，并在37 ℃下避光反应至溶液呈黄色，检测 405 nm处吸光度。以实验组与对照组的吸光度比值计算相对的半胱天冬氨酸蛋白酶3活性。每组样本设置3个复孔，并重复3次实验。
1.4.5 异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶双标记结合流式细胞术检测AML12细胞凋亡取处于对数生长期的AML12细胞接种于6孔板中，待到进行亚砷酸钠染毒处理后，使用相差显微镜观察各组细胞形态并拍照。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，经预冷的PBS洗涤 2 次后，用缓冲液制备 100 μL含1×105个细胞的单细胞悬液，分别加入5 μL异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ和5 μL碘化丙啶，轻轻涡旋细胞，在室温(25 ℃)避光孵育 20 min，立即用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。
1.4.6 实时荧光定量PCR法检测AML12肝细胞YAP mRNA表达取对数生长期的 AML12肝细胞接种于6孔板中，待到进行亚砷酸钠染毒处理后，TRIzol法提取各组细胞的 RNA，用去除基因组DNA的反转录试剂盒合成 cDNA。根据NCBI提供的基因组序列设计引物，见表1，并通过NCBI Primer-BLAST 验证引物特异性，委托上海生工公司合成引物。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环。扩增完成后进行熔解曲线分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1为双内参基因，采用2-ΔΔCt 计算出目的基因的相对表达量。每个样本重复检测 3 次，实验同时设无反转录酶对照和非模板对照。

1.4.7 Western blot 法检测 AML12 细胞 p-MST1/2、p-YAP 和YAP蛋白表达取处于对数生长期的AML12细胞接种于6孔板中，待到进行亚砷酸钠染毒处理后，收集细胞，按100∶1∶1的比例加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，各组取等量蛋白与1/4倍体积5×SDS-PAGE上样缓冲液充分混匀后，置于100 ℃金属浴中加热 10 min。各组蛋白均以40 μg上样量进行 SDS-PAGE 电泳，蛋白完成分离后被转移至 PVDF 膜上，50 g/L BSA 封闭 2 h。经 TBST洗膜10 min×3次后，分别加入兔抗小鼠p-MST1/2抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠p-YAP抗体(1∶1 000)、兔抗小鼠YAP抗体(1∶1 000)和兔抗小鼠GAPDH抗体(1∶10 000)，于 4 ℃孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000)，室温孵育2 h，TBST洗涤10 min×3次后进行ECL显影。采用Image J软件处理并分析图像，以GAPDH为内参照计算各目的蛋白的相对表达水平。
1.5 主要观察指标倒置相差显微镜观察细胞形态变化，CCK-8法检测细胞存活率，荧光探针染色结合流式细胞术检测细胞内活性氧表达水平，化学比色法检测细胞内半胱天冬氨酸蛋白酶3相对活性，异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡，实时荧光定量PCR检测YAP mRNA表达，Western Blot法检测各组AML12细胞p-MST1/2、p-YAP、YAP蛋白的相对表达量。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行数据统计学分析，所有计量资料均进行正态性检验、方差齐性检验。计量资料呈正态分布但方差不齐时，将数据对数转换后进行单因素方差分析。计量资料呈正态分布且方差齐时，结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 法。所有统计分析结果均以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

地方性砷中毒是全球公共卫生领域关注的重大卫生问题，砷致肝损伤机制相关研究具有重要价值。国内外已有大量研究发现，砷致肝损伤的发生发展与氧化应激、细胞凋亡密切相关，但具体作用机制尚未阐明[12]。此次研究着重探究砷致肝细胞发生氧化应激以及凋亡的机制。
活性氧是一类具有高化学反应活性的含氧物质，在正常情况下，机体内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态。当机体受到某些有害因子的刺激时，会产生过多的活性氧，使体内氧化与抗氧化系统失衡，从而引起氧化应激[13]。当细胞发生氧化应激时，活性氧使生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的脂肪酸侧链等大分子物质发生脂质过氧化反应从而破坏细胞膜完整性[14]。此次实验通过体外构建砷中毒细胞模型，发现随着染砷剂量的增加，AML12肝细胞内活性氧的表达水平逐渐增加，倒置相差显微镜下观察到破碎裂解的AML12肝细胞逐渐增多，可为砷诱导AML12肝细胞发生氧化应激损伤提供直接证据。氧化应激同时也是诱导细胞发生凋亡的重要因素，FU等[15]的研究表明，活性氧可以激活促凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶3而介导细胞发生凋亡。此次实验中染砷组AML12肝细胞的半胱天冬氨酸蛋白酶3活性及细胞凋亡率随着砷暴露剂量、活性氧表达水平的升高而升高，提示砷可能通过氧化应激反应导致细胞凋亡，但其具体机制仍需通过干预氧化应激反应进一步验证。
Hippo通路是一条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶信号链，可通过调控细胞增殖和凋亡控制器官大小[16]。MST1/2是该通路中关键的信号传导激酶，可被通路上游的蛋白复合体磷酸化激活[17]。研究发现，活化的MST1/2与氧化应激之间存在正反馈调节机制：MST1/2在氧化应激状态下可发生自磷酸化而被激活，而p-MST1/2可通过抑制一系列抗氧化酶的表达致使细胞发生氧化应激[18]。在细胞凋亡方面，MST1不仅能促进抑癌基因p53的转录，还能激活半胱天冬氨酸蛋白酶3从而发挥促凋亡作用[19]。ZHANG等[20]研究表明，心衰大鼠左心室梗死组织中p-MST1和p53的表达量明显上升，且心肌细胞凋亡率明显高于其正常对照组。课题组前期研究发现，在亚砷酸钠诱导肝细胞发生凋亡过程中，鼠双微粒体基因2和p53的表达量升高[10]。且FURTH等[11]发现Hippo通路可调节鼠双微粒体基因2-p53通路介导的细胞凋亡，由此推测砷可能通过Hippo通路导致肝细胞损伤。此次实验结果即显示，亚砷酸钠诱导AML12细胞发生氧化应激和凋亡过程中，p-MST1/2的表达量及半胱天冬氨酸蛋白酶3活性增加，且存在剂量-反应关系，提示砷很可能通过氧化应激反应上调p-MST1/2从而促进肝细胞凋亡，但具体生物学机制有待深入研究。
YAP是Hippo通路下游的核心转录辅激活因子，当Hippo信号通路被激活时，p-MST1/2可通过一系列激酶级联反应使YAP发生磷酸化；p-YAP与支架蛋白14-3-3结合后，被滞留在胞质中发生泛素化降解；而未被磷酸化的YAP，可通过进入细胞核与不同转录因子结合而促进多种抗氧化应激、抗凋亡相关靶基因的转录[21]。在YAP负责转录调控的抗氧化酶中，已有超氧化物歧化酶1、过氧化氢酶等被证实参与砷致肝脏氧化应激过程[22]。在细胞凋亡方面，YAP可促进存活蛋白(survivin)、环氧化酶2等抗凋亡因子的转录[23]。JIN等[24]研究发现，三氧化二砷可通过下调survivin致胆管癌细胞发生凋亡。OOKI等[25]通过基因富集分析发现，慢性砷暴露能显著诱导环氧化酶2的表达增高，从而引起膀胱尿道上皮细胞发生恶性转化。以上研究均表明，砷与YAP具有密切联系。此次实验发现，亚砷酸钠对AML12肝细胞YAP mRNA表达的影响不明显，但可上调p-YAP蛋白的表达水平，下调YAP的蛋白表达水平。由于mRNA转录和蛋白质翻译之间存在延迟，细胞在短时间内常通过转录后修饰、翻译后加工及修饰机制分别改变现有转录本的翻译效率和蛋白质的稳定性，去适应新的培养环境[26]。YAP在mRNA和蛋白表达水平的不一致可能是由于转录后修饰、翻译后加工及修饰等机制的调控，其具体原因有待进一步研究；而YAP总蛋白表达水平下降很可能是由于p-YAP的泛素化降解造成的。与此次实验结果类似，ZHOU等[27]构建的砷纳米复合物可致YAP蛋白的表达量显著下降，从而促进结肠癌细胞凋亡。ZHAO等[28]发现三氧化二砷可抑制血管平滑肌细胞中YAP蛋白的表达和核易位。推测砷可能通过激活MST1/2促进YAP发生磷酸化降解，进而抑制相关抗氧化酶、抗凋亡因子表达。
综上所述，亚砷酸钠能导致AML12肝细胞发生氧化应激损伤和凋亡损伤，其机制可能与砷激活Hippo信号通路，上调p-MST1/2、p-YAP蛋白表达水平，下调YAP蛋白表达水平有关。此次研究仅初步探讨了Hippo信号通路关键成员在砷致肝损伤中的表达变化，还需利用MST1/2抑制剂、敲低MST1/2进行干预实验来进一步验证Hippo信号通路在砷致肝损伤过程中的具体作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

亚砷酸钠对AML12肝细胞氧化应激、凋亡损伤及Hippo信号通路的影响

Effects of sodium arsenite on oxidative stress, apoptosis and Hippo signaling pathway in AML12 hepatocytes

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