颈椎成骨性退变间盘组织学改变及局部骨化灶的潜在形成机制

doi:10.12307/2022.696

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (18): 2868-2873.doi: 10.12307/2022.696

• 骨科植入物相关基础实验 Basic experiments of orthopedic implant • 上一篇下一篇

颈椎成骨性退变间盘组织学改变及局部骨化灶的潜在形成机制

熊洋1，2，杨莹骊3，高誉珊4，王秀梅2，杨永栋1，赵丁岩1，赵赫1，李传鸿1，杨凯坦1，俞兴1

1北京中医药大学东直门医院骨科，北京市 100700；2清华大学材料学院，北京市 100084；3北京协和医院中医科，北京市 100032；4北京中医药大学中医学院，北京市 100029

收稿日期:2021-04-19 接受日期:2021-06-27 出版日期:2022-06-28 发布日期:2022-01-30
通讯作者: 俞兴，教授，主任医师，北京中医药大学东直门医院骨科，北京市 100700
作者简介:熊洋，男，1988年生，湖北省咸丰县人，北京中医药大学第一临床医院毕业，博士，现工作于清华大学博士后工作站，主要从事生物骨材料相关研究。杨莹骊，女，1990年生，江苏省扬州市人，2019年北京中医药大学第一临床医学院毕业，博士，医师，主要从事中医药临床与基础相关研究。
基金资助:
仿生矿化胶原人工骨在脊柱疾病及骨折治疗中的疗效观察，项目负责人：俞兴

Histological changes of cervical disc tissue and underlying ossification mechanism in patients with cervical degenerative ossification

Xiong Yang1, 2, Yang Yingli3, Gao Yushan4, Wang Xiumei2, Yang Yongdong1, Zhao Dingyan1, Zhao He1, Li Chuanhong1, Yang Kaitan1, Yu Xing1

1Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2School of Materials Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 3Department of Traditional Chinese Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100032, China; 4School of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

Received:2021-04-19 Accepted:2021-06-27 Online:2022-06-28 Published:2022-01-30
Contact: Yu Xing, Professor, Chief physician, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
About author:Xiong Yang, MD, Department of Orthopedics, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; School of Materials Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China Yang Yingli, MD, Physician, Department of Traditional Chinese Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100032, China Xiong Yang and Yang Yingli contributed equally to this article.
Supported by:
the Curative Effect of Biomimetic Mineralized Collagen Bone in the Treatment of Spinal Diseases and Fractures (to YX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
颈椎间盘退变：是颈椎病患者神经根或脊髓受压迫导致临床症状产生最常见原因，影像学可表现为椎间隙高度丢失、节段失稳或活动度丢失，颈椎核磁主要表现为T2加权像髓核信号降低，间盘突出压迫脊髓或神经根；组织学改变主要包括水分丢失、细胞外基质降解及蛋白多糖减少等。
颈椎成骨性退变：是颈椎退变常见的表现之一，在椎间盘退变的同时，病变节段周围韧带发生骨化或钩椎关节、小关节增生，最终形成局部骨化灶，或进一步加重神经压迫损伤，增加手术减压风险；临床中常见的成骨性退变包括：后纵韧带骨化、黄韧带骨化、钩椎关节增生、关节突关节增生、椎体缘骨刺及人工颈椎间盘置换术后异位骨化等。

背景：病变椎间盘周围成骨性退变可加重神经压迫，增加手术风险。但目前国内外对临床颈椎成骨性退变患者间盘组织学的改变及潜在成骨机制鲜有报道。
目的：对颈椎成骨性退变患者病变椎间盘进行组织学观察，并初步探索局部骨化灶潜在形成机制。
方法：临床筛选颈椎病手术治疗患者，术中收集手术节段病变椎间盘组织，根据术前颈椎X射线片及CT检测将所有椎间盘样本分为成骨组和非成骨组。对两组样本进行苏木精-伊红染色、Masson三色染色及番红O固绿软骨染色比较椎间盘组织学差异；通过免疫组织化学方法并进行半定量检测比较两组椎间盘及骨赘样本中转化生长因子β1及其下游p-Smad2/3的表达水平。
结果与结论：①椎间盘样本可明确区分外层纤维环、内层纤维环及髓核，骨化样本中均可明确观察到成熟的骨小梁及骨髓腔；②组织学上，成骨组椎间盘内细胞数量显著多于非成骨组(P < 0.05)；但基质中蛋白多糖含量显著低于非成骨组(P < 0.05)；③转化生长因子β1/Smad2/3在所有椎间盘及骨赘组织中均可见；④成骨组转化生长因子β1、p-Smad2及p-Smad3在局部的含量均显著高于非成骨组(P < 0.05)；⑤结果显示，与非成骨性退变相比，颈椎成骨性退变患者的椎间盘组织退变更为严重；局部微环境中更高含量的转化生长因子β1对成骨性退变或具有促进作用，而下游活化的p-Smad2/3对成骨的作用存在差异。

https://orcid.org/0000-0001-9977-5866 (熊洋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 颈椎病, 颈椎间盘, 椎间盘退变, 成骨性退变, 骨赘, 组织学, 转化生长因子β1, Smad2/3

Abstract: BACKGROUND: Cervical degenerative ossification may aggravate nerve compression in patients with cervical degenerative disease, and also make the decompression procedure more challenging. However, the accompanied histological changes of the intervertebral disc and the underlying mechanism of degenerative ossification have not yet been documented.
OBJECTIVE: To explore the histological features of the cervical disc in patient with cervical degenerative ossification and the underlying mechanisms of local ossification.
METHODS: Patients with cervical spondylosis undergoing surgical treatment were selected from the clinical practice, and cervical disc samples were harvested during the surgical process. Based on preoperative cervical X-ray and computed tomography (CT) examinations, all the disc samples were divided into ossification group and non-ossification group. Hematoxylin-eosin staining, Masson trichrome staining and Safranin O-fast green staining were used to compare the histological differences between the two groups. Furthermore, for the expression of transforming growth factor-β1, p-Smad2 and p-Smad3 in the disc and osteophyte samples, a semi-quantitative immunohistochemistry method was used to compare the difference between the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: All the disc tissues could be clearly divided into the outer annulus fibrosus, the inner annulus fibrosus and the nucleus pulposus. Mature trabeculae and bone marrow cavities were detected in all ossification samples. Histologically, the number of disc cells in the ossification group was significantly higher than that of the non-ossification group (P < 0.05). However, the content of proteoglycan in the matrix was significantly lower than that in the non-ossification group (P < 0.05). Transforming growth factor β1/Smad2/3 was detected in all the disc and osteophyte tissues. Local content of transforming growth factor β1, p-Smad2 and p-Smad3 in the ossification group was significantly higher than that of the non-ossification group (P < 0.05). All the findings indicate that, compared with the non-ossification group, cervical degenerative ossification in patients in the ossification group is more severe. Higher expression of transforming growth factor β1 in the local microenvironment may promote the development of degenerative ossification. However, downstream-activated p-Smad2 and p-Smad3 may play different roles in the development of degenerative ossification.

Key words: cervical spondylosis, cervical intervertebral disc, intervertebral disc degeneration, degenerative ossification, osteophyte, histology, transforming growth factor β1, Smad2/3

中图分类号:

熊洋, 杨莹骊, 高誉珊, 王秀梅, 杨永栋, 赵丁岩, 赵赫, 李传鸿, 杨凯坦, 俞兴. 颈椎成骨性退变间盘组织学改变及局部骨化灶的潜在形成机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(18): 2868-2873.

Xiong Yang, Yang Yingli, Gao Yushan, Wang Xiumei, Yang Yongdong, Zhao Dingyan, Zhao He, Li Chuanhong, Yang Kaitan, Yu Xing. Histological changes of cervical disc tissue and underlying ossification mechanism in patients with cervical degenerative ossification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(18): 2868-2873.

图/表（结果） 4

2.1 一般组织学染色见图2，3。

苏木精-伊红染色结果显示(图2A，B及3A)，椎间盘内从外层纤维环到内层纤维环再到髓核各部分组织结构具有明显差异。由外到内，胶原纤维束排列由相互平行、致密逐渐变为紊乱交错、稀疏。同时，细胞数量逐渐减少。外层纤维环中细胞细长呈梭形，整体形态类似于成纤维细胞，排列多与胶原纤维走向平行或连接成串。内层纤维环中细胞大多散在分布，形态呈卵圆形或球形，整体类似于软骨细胞。髓核中细胞稀疏，部分软骨样细胞散在分布，另有部分聚集呈脊索样细胞，胞外基质中纤维结构模糊不清。成骨组骨赘中可见到成熟的骨结构，包括骨小梁、骨髓腔及骨陷窝，髓腔中可见成骨细胞及破骨细胞或其前体单核巨噬细胞。Masson三色染色结果显示(图2C，3C)，椎间盘内纤维及骨赘均呈蓝染，椎间盘内纤维排列由外到内亦具有减少趋势，结果同苏木精-伊红染色。改良番红O-固绿软骨染色可见(图2D， 3E)，外层纤维环以绿色为主，内层纤维环为红绿相间，髓核则以红色为主，反映出椎间盘基质中蛋白多糖主要分布于内层纤维环与髓核中。成骨组骨赘染色可见骨小梁呈绿色或灰绿色，骨髓腔中可见大量空泡，细胞外基质红绿相间，在近骨小梁处，可见红染、增生、肥大的类软骨细胞，这表明局部骨组织或通过软骨内化骨形成。
半定量检测显示(图3B，D，F)，成骨组椎间盘各部分细胞数量均显著高于非成骨组，差异有显著性意义(外层纤维环中P < 0.001，内层纤维环及髓核中P=0.04，0.01)。椎间盘组织从外到内，胶原纤维含量逐渐减少，但组间比较差异无显著性意义(外层纤维环、内层纤维环及髓核中P=0.83，0.17，0.11)。椎间盘基质中蛋白多糖含量逐渐增加，组间比较可见，成骨组内层纤维环和髓核中蛋白多糖含量著低于非成骨组，差异有显著性意义(外层纤维环、内层纤维环及髓核中P=0.40，0.02，0.04)。
2.2 免疫组织化学染色所有退变椎间盘组织及骨赘中均可见转化生长因子β1、p-Smad2及p-Smad3的阳性表达，这表明转化生长因子β1/Smad2/3参与到了椎间盘的退变及骨赘的形成过程中。半定量检测显示，与非成骨组比较，成骨组外层纤维环和髓核中的转化生长因子β1含量显著更高，差异有显著性意义(外层纤维环、内层纤维环中P=0.001，0.09，髓核中P < 0.001)。成骨组内层纤维环中p-Smad2及外层纤维环中p-Smad3表达量均显著高于非成骨组，差异有显著性意义(p-Smad2：外层纤维环、内层纤维环及髓核中P=0.07，0.04，0.31；p-Smad3：外层纤维环、内层纤维环及髓核中P=0.02，0.15，0.28)，见图4，5。

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引言

颈椎退变主要涉及椎间盘、小关节及周围韧带组织，可随着年龄的增长而逐渐进展，严重病变或可导致脊髓或神经受压而产生相应临床症状。椎间盘突出是神经受累的最常见因素，而局部韧带的肥厚、骨化或骨性关节增生或可进一步加重神经受累，极大增加手术风险。椎间盘退变是一个极为复杂的过程，大量体内外实验基于不同的动物、尸体或有限元模型对椎间盘退变的潜在机制进行了探索，但其具体机制目前仍不清楚[1-5]。椎间盘与局部韧带及骨性关节相毗邻，局部微环境亦具有相互影响[6]，那么椎间盘组织的退变与韧带骨化及骨性关节增生等成骨性退变是否具有潜在联系？针对该问题目前国内外尚无相关报道。
颈椎成骨性退变可包括：突出椎间盘的骨(钙)化、前后纵韧带或黄韧带的骨化、椎体缘骨刺及钩椎关节增生骨赘形成等，其中后纵韧带骨化的防治已成为近年临床研究热点[7-9]。此外，人工颈椎间盘置换后异位骨化的形成亦可归属于术后的成骨性退变，重度异位骨化可限制手术节段活动，或增加再手术风险[10-12]。无论骨性关节增生骨赘形成或软组织异位骨形成，其实质均为骨生成。骨生成可受多种因素影响，尤其局部成骨微环境中相关生长因子对其形成及发展具有重要促进作用。已有研究显示，转化生长因子β/Smads通路参与到了椎间盘的生长发育及退变中[13-15]，但其对颈椎成骨性退变中椎间盘及骨赘的作用尚无报道。
此次研究目的在于观察颈椎成骨性退变中椎间盘退变的组织学改变，并探索局部微环境中转化生长因子β/Smads相关信号因子对局部骨化灶的潜在作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计前瞻性队列实验，采用独立样本t检验方法比较成骨组与非成骨组之间椎间盘的组织学差异。
1.2 时间及地点试验于2016年8月至2019年6月在北京中医药大学东直门医院骨科完成。
1.3 对象
纳入标准：①临床明确诊断颈椎病，经6周保守治疗无效，于北京中医药大学东直门医院初次行手术治疗；②术式为颈椎前路减压椎体间融合或(联合)人工颈椎间盘置换；③术中可获得足够有效组织标本。
排除标准：①患者局部具有骨折、出血或活动性感染；②患者具有肿瘤、结核等病史；③术前影像学提示病变椎间隙完全塌陷。

自2016年8月至2019年6月共纳入患者63例，男29例，女34例，平均年龄56.4岁。患者于术前签署知情同意书，在手术治疗中采集退变椎间盘(共102例)及骨赘(共36例)样本，大小不小于4 mm×4 mm×1.5 mm。所有椎间盘样本根据术前颈椎X射线片和CT检查分为成骨组(n=47)和非成骨组(n=55)，共两组。成骨组术前影像学可见：前、后纵韧带或黄韧带骨化、钩椎关节增生或椎体缘骨刺形成、病变节段前后方局灶性骨赘。典型成骨性退变见图1。非成骨组影像学无上述表现。

术前影像学评估由2名研究者独立评估，结果不一致交第3名研究者裁定。
此次试验获得北京中医药大学东直门医院医学伦理委员会批准，批准号：DZMEC-KY-2019-94。
1.4 方法
1.4.1 样本准备所有样本取材后用甲醛溶液进行固定，骨赘样本经充分脱钙处理。椎间盘及脱钙后骨赘样本经常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明后采用石蜡包埋，最后进行组织切片。
1.4.2 一般组织学及免疫组织化学染色通过苏木精-伊红染色试剂盒(G1120，Solarbio)对组织一般病理学改变进行观察；通过改良Masson三色染色试剂盒(G1345，Solarbio)对椎间盘中的胶原进行观察；通过改良番红O-固绿软骨染色(Safranin O/fast green staining)试剂盒(G1371，Solarbio)对椎间盘软骨基质中蛋白多糖的分布和含量进行观察。
椎间盘及骨赘样本中转化生长因子β1及p-Smad2，p-Smad3表达的检测采用免疫组织化学染色标准实验方案。组织切片分别于转化生长因子β1(1∶200，ab92486，Abcam)，p-Smad2 (1∶200，AF3449，Affinity)及p-Smad3(1∶120，AF3362，Affinity)一抗孵育，4 ℃过夜；二抗采用即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTM SP 检测试剂盒(兔)(KIT-9706，福州迈新)。每个样本重复3次染色。
1.4.3 组织学半定量检测所有组织染色结果采用Leica DM4B显微镜观察并在同一参数设置下进行拍照留存(Leica DMC5400数字镜头)。每张切片随机选取3处，应用Image-Pro Plus 6.0软件测定相应平均吸光度值，最后取平均值进行统计学检验。
1.5 主要观察指标所有样本于取材后3周内完成相应处理并制作石蜡切片，经一般组织学染色检测椎间盘组织内细胞数量、胶原及蛋白多糖含量，同时观察成骨组骨赘组织结构特征，并应用免疫组织化学方法检测椎间盘及骨赘中转化生长因子β1、p-Smad2及p-Smad3蛋白表达情况。
1.6 统计学分析使用SPSS 22.0统计软件包，所有实验数据采用x±s表示，两组间比较采用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

颈椎间盘退变是临床颈椎病患者脊髓、神经根受压最常见的因素，而在退变过程中，局部的韧带骨化或关节骨质增生可严重增加神经受累程度，增加手术减压风险。此次研究首次从组织学水平对颈椎成骨性退变患者椎间盘组织进行了观察，结果发现，与非成骨性退变的椎间盘组织相比，颈椎成骨性退变椎间盘细胞显著增生，细胞外基质中蛋白多糖含量显著降低，说明成骨组椎间盘退变程度更为严重。在骨赘组织中，除了成熟的骨小梁、骨髓腔及其中的成骨细胞和破骨细胞，在局部骨小梁边缘亦可观察到增生肥大的软骨细胞，这说明颈椎局部骨化灶可能是一个经软骨内成骨而形成的动态改变过程。在所有椎间盘及骨赘组织中均可观察到转化生长因子β1/Smad2/3的阳性表达，但成骨组椎间盘中表达量显著高于非成骨组，说明转化生长因子β1/Smad2/3参与到了椎间盘的退变及骨赘形成中，而局部过多的转化生长因子β1/Smad2/3表达或加速了椎间盘退变及局部骨化灶的形成。
椎间盘退变是一个极为复杂的过程，主要包括基质中蛋白多糖减少、水分丢失、Ⅱ型胶原减少，同时Ⅰ型胶原逐渐增加 [16]。此次研究中，与非成骨组相比，成骨组椎间盘组织中细胞显著增加，这表明在椎间盘退变过程中，细胞或出现代偿性增生以维持椎间盘局部代谢功能。成骨组基质中蛋白多糖含量显著减少，胶原纤维含量虽然没有出现统计学差异但具有增加的趋势。GULLBRAND等[17]基于大型动物模型对人椎间盘退变进行评估指出，更严重的椎间盘退变可表现为纤维化更为明显，且蛋白多糖染色显著降低，这与此次研究中成骨组椎间盘基质改变基本一致。进一步通过RUTGES等[18]对椎间盘退变进行的量化评分可见，此次研究中，与非成骨组(评分4分：纤维环裂隙、髓核边界模糊、髓核细胞簇状分布、髓核基质结构丢失4项，各1分)相比，成骨组患者椎间盘具有更显著的组织学改变(评分8分：纤维环裂隙、髓核细胞簇状分布、髓核基质结构丢失3项，各2分；同时髓核边界模糊及髓核Safranin O染色红色减少，绿色增多各1分)，主要包括：①纤维环层状结构中裂隙增多；②髓核细胞簇状分布，呈软骨细胞巢穴样；③髓核基质结构丢失；④髓核Safranin O染色红色减少，绿色增多。综合来看，此次研究中成骨组患者椎间盘组织退变较非成骨组更为严重。由此提示，对临床中存在成骨性退变患者的治疗方案、术式选择及神经减压操作或应更加谨慎。
研究已证实转化生长因子β/Smads信号通路参与到了椎间盘的生长、发育及退变过程中，但基于不同动物、尸体及有限元模型或实验方法的差异，转化生长因子β/Smad信号通路在椎间盘退变中的具体作用仍未明确。部分研究指出转化生长因子β或是椎间盘的合成代谢因子[13]：一方面可诱导间充质干细胞分化为软骨细胞，促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成与分泌；另一方面，一定程度上又抑制了细胞外基质的降解[14-15]，当转化生长因子β表达被人为阻断时，可导致椎体、椎间盘及软骨终板异常缩小或缺失[13，19]，由此，转化生长因子β介导的合成作用减少或加速了椎间盘的退变。LI等[20-21]研究发现转化生长因子β1在退变椎间盘中的含量上调，局部高水平的转化生长因子β可加速椎间盘退变，转化生长因子β的异常表达可加速Ⅱ型胶原的减少与Ⅰ型胶原的增加[22-25]。HU等[26]研究亦发现，通过姜黄素降低转化生长因子β1/2表达后可显著抑制大鼠椎间盘的退变。一定强度的机械刺激，可使椎间盘内转化生长因子β浓度维持在一定范围，但BIAN等[27]研究发现，在椎间盘退变早期，节段失稳致机械负荷增加，诱导转化生长因子β过度表达，最终可导致终板的肥大及硬化，抑制转化生长因子β1的活性或可削弱椎间盘的退变。进一步研究发现，退变椎间盘中，过度的机械负荷或通过整合素介导了转化生长因子β1的过度表达[28-35]。此外，ZHEN等[36]在小鼠骨关节炎模型中发现，过度的转化生长因子β信号表达可诱导骨髓间充质干细胞簇的形成，加速软骨退变及异常的骨形成。当阻断转化生长因子β1/结缔组织生长因子/整合素-α5β1信号通路表达，可缓解过度机械负荷诱导的软骨纤维化[37]。
在此次研究中，在所有退变椎间盘及骨赘组织中均发现了转化生长因子β1 及其下游活化p-Smad2与p-Smad3的表达，这说明转化生长因子β信号通路参与到椎间盘的退变及骨赘形成中，与目前已有研究结果基本一致[38-41]。进一步组间比较发现，成骨组椎间盘的外层纤维环和髓核中转化生长因子β1的表达显著高于非成骨组，其原因可能为：组织内细胞出现代偿性增殖，使得成骨组椎间盘中细胞分泌转化生长因子β1的水平上调；此外，成骨组受到过度应力负荷，或成为局部转化生长因子β1表达增高的另一重要因素。转化生长因子β1在椎间盘组织尤其纤维环中的高表达，对相邻椎体缘骨刺发生发展及韧带骨化或具有潜在促进作用。骨赘中的转化生长因子β1主要源自于髓腔中相关基质细胞的分泌，转化生长因子β1的表达不仅可向局部募集髓腔中的间充质干细胞，并诱导干细胞成骨向分化[42]；同时，基于对成(破)骨细胞活性的调节，影响骨代谢平衡，最终促使局部骨化灶的产生[43]。在退变椎间盘及骨赘样本中均可见p-Smad2/3的表达，但两者的分布及含量并不一致，成骨组p-Smad2在内层纤维环中表达增加，而p-Smad3仅在外层纤维环中表达增加，该结果显示，p-Smad2与p-Smad3对颈椎间盘退变及局部骨化灶形成可能产生不同的作用[44-45]。由此，对转化生长因子β1/Smad2/3的表达进行调控或可为临床防治椎间盘退变相关疾病提供新思路。
综上所述，与非成骨性退变相比，颈椎成骨性退变患者的椎间盘组织退变更为严重。局部微环境中更多含量的转化生长因子β1可能促进了椎间盘退变及局部骨化灶的形成与发展，但下游p-Smad2/3或具有不同的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

颈椎成骨性退变间盘组织学改变及局部骨化灶的潜在形成机制

Histological changes of cervical disc tissue and underlying ossification mechanism in patients with cervical degenerative ossification

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