大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型的建立及评价

doi:10.12307/2022.694

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (18): 2854-2861.doi: 10.12307/2022.694

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大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型的建立及评价

贾麒钰1，郭建1，魏琴2，3，郭晓斌4，陈东生1，冯东伟1，刘彦士1，马创1

新疆医科大学第一附属医院骨科中心，1显微修复外科，4关节外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054； 2新疆医科大学动物实验中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；3新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2021-08-19 接受日期:2021-10-11 出版日期:2022-06-28 发布日期:2022-01-29
通讯作者: 马创，博士，主任医师，硕士生导师，新疆医科大学第一附属医院骨科中心显微修复外科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:贾麒钰，男，1995年生，浙江省金华市人，汉族，新疆医科大学第一附属医院骨科中心显微修复外科在读硕士，主要从事动物实验研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81760397)，项目负责人：马创；新疆维吾尔自治区自然科学基金(2020D01C263)，项目负责人：郭晓斌

Establishment and evaluation of a validation model for the efficacy of external femoral fixator screws in rats

Jia Qiyu1, Guo Jian1, Wei Qin2, 3, Guo Xiaobin4, Chen Dongsheng1, Feng Dongwei1, Liu Yanshi1, Ma Chuang1

1Department of Microprosthetic Surgery, 4Department of Joint Surgery, Orthopaedic Center, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Animal Experiment Center, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Key Laboratory for Research on New Medical Animal Models, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2021-08-19 Accepted:2021-10-11 Online:2022-06-28 Published:2022-01-29
Contact: Ma Chuang, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Microprosthetic Surgery, Orthopaedic Center, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Jia Qiyu, Master candidate, Department of Microprosthetic Surgery, Orthopaedic Center, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760397 (to MC); the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2020D01C263 (to GXB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨外固定支架：一种固定骨骼的器具，需要在患者骨骼上打入数枚钢针，再安装特制的支架以资固定。其可用于开放性骨折及延长骨骼。
钉道感染：是外固定最常见的并发症，其原因主要是固定钉松动，钉-骨界面和钉-皮肤界面不稳定。钉道周围软组织受周期性动态应力刺激和对炎性反应处理不当，亦是造成钉道感染的原因。单平面半钉固定和骨断端间隙存在者，固定钉-骨界面应力明显大于单平面双侧及双平面外固定，固定钉松动和钉道感染发生率亦明显高于后者。

背景：为了解决外固定螺钉的诸多并发症，各种改性螺钉层出不穷，但缺少合适的动物模型及评价方法用于验证其效能，尤其是模拟真实载荷。
目的：探讨构建一种简单合理高效的SD大鼠外固定架螺钉效能验证模型及评价方法。
方法：雄性成年SD大鼠30只，行右侧股骨截骨术，安装自制外固定架系统，在术后当天以及术后1，2，4，6周行常规X射线摄片。期间观察大鼠活动，术后6周统一取材，进行右侧大腿股骨带钉标本大体观察、生物力学测定、micro CT、钉道环境三维重建分析和组织学观察。
结果与结论：①大鼠股骨骨折外固定模型造模时长为(20±5) min；②实验过程中大鼠一般情况及活动情况良好；③大体观察，30只股骨带钉标本中28只(93%)实现骨性愈合；1只(3%)愈合不良假关节形成，伴螺钉严重松动合并近端钉道周围大面积骨溶解；1只(3%)螺钉轻度松动合并严重钉道感染；1只(3%)仅出现严重钉道感染；模型总体一致满意率为90%(27/30)；④X射线片显示，术后6周大鼠右侧股骨螺钉均固定在位、无松动，骨形态恢复，原断端位线良好，周围未见游离体，右侧髋膝在位；⑤Micro CT 3D分析，术后6周，模型大鼠内钉道周围骨密度(0.426 7±0.088 7) mg/cm2，骨体积分数(3.125 2±1.004 2)%，骨小梁数目(0.000 3±0.000 1) /μm；大鼠各参数分布情况进行正态性检验，总体趋于稳定，呈正态性分布；⑥苏木精-伊红染色显示，钉道周围区域被大量增生的肉芽组织修复，边缘可见新生的骨组织；Von Kossa 染色显示，钉道周围均存在广泛的黑色或棕黑色的钙盐沉积；⑦生物力学测定，螺钉拔出力为(130.416 7±35.008 0) N，总体趋于稳定，呈正态性分布(P=0.2456)；⑧结果表明，构建的SD大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型及评价方法，从组织学、影像学、生物力学3个层次进行评价分析，可对钉道情况进行全面的测评，且设计科学合理、手术过程简单、成功率高，具有较好的科研、临床应用价值。

https://orcid.org/0000-0003-1835-6665 (贾麒钰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 螺钉, 股骨, 外固定, SD大鼠, 动物模型

Abstract: BACKGROUND: In order to solve the complications of external fixation screws, various modified screws have emerged, but there is a lack of suitable animal models and evaluation methods for validating their efficacy, especially for simulating real loads.
OBJECTIVE: To construct a simple, rational and efficient model that can be used to validate the efficacy of external fixator screws in Sprague-Dawley rats and establish the corresponding evaluation methods.
METHODS: Thirty male adult Sprague-Dawley rats underwent the right femoral osteotomy, followed by fixation with a homemade external fixator system. Routine X-ray films were taken on the day after operation and 1, 2, 4, and 6 weeks after operation. During this period, the activity of rats was observed. At 6 weeks after operation, the rats were euthanized, and the right thigh femur with screw specimens were taken for general observation, biomechanical measurement, micro-CT, three-dimensional reconstruction analysis of the screw path and histological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: The modeling time of external fixation model of rat femoral fracture was (20±5) minutes. The general condition and activity of rats were good during the experiment. In general, 28 (93%) of the 30 femoral specimens with screws achieved bone healing; 1 case (3%) had poor pseudoarthrosis formation with severe screw loosening accompanied by large osteolysis around the proximal screw path; 1 case (3%) had mild screw loosening combined with severe screw path infection; 1 case (3%) only had severe screw path infection. The overall satisfactory rate of the model was 90% (27/30). Radiological findings revealed that the right femoral screws were fixed in place without loosening, the bone morphology was restored, the broken end was well aligned, no free body was seen around the broken end, and the right hip and knee were in position at 6 weeks after operation. Micro-CT three-dimensional analysis showed that body mineral density, bone volume fraction, and the number of bone trabeculae around the internal screw path were (0.426 7±0.088 7) mg/cm2, (3.125 2±1.004 2)%, and (0.000 3±0.000 1) /μm respectively, at 6 weeks after operation. Intra-model group distribution and normality test were performed, and all the data tended to be stable and normally distributed. Hematoxylin-eosin staining showed that the area around the screw path was repaired by a large amount of proliferating granulation tissue, and new bone tissue was visible at the edges. Von Kossa staining revealed the presence of extensive black or brownish-black calcium deposition around the screw path. Biomechanically, the screw extraction force was (130.416 7±35.008 0) N, which tended to be generally stable and normally distributed (P=0.245 6). To conclude, the validation model and evaluation method for the efficacy of external femoral fixator screws in Sprague-Dawley rats can be evaluated from three aspects: histology, imaging and biomechanics, and the screw path can be comprehensively evaluated. The design is scientific and reasonable, the procedure is simple, and the success rate is high. Therefore, this validation model has good value for scientific research and clinical application.

Key words: screw, femur, external fixation, Sprague-Dawley rat, animal model

中图分类号:

贾麒钰, 郭建, 魏琴, 郭晓斌, 陈东生, 冯东伟, 刘彦士, 马创. 大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型的建立及评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(18): 2854-2861.

Jia Qiyu, Guo Jian, Wei Qin, Guo Xiaobin, Chen Dongsheng, Feng Dongwei, Liu Yanshi, Ma Chuang. Establishment and evaluation of a validation model for the efficacy of external femoral fixator screws in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(18): 2854-2861.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析实验选择大鼠30只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 大鼠造模时长大鼠股骨骨折外固定模型造模时长为(20±5) min。
2.3 大鼠活动情况围术期大鼠精神、饮食、睡眠及活动均正常。术后第3周大鼠右侧股部创面愈合良好，无红肿、溢液现象。愈合处被新生毛发遮盖，皮温可。外固定器固定在位，4枚克氏针无松动、脱落现象，见图3。钉道已结痂，周围皮肤无红肿、溢脓等炎症反应，见图3B。将大鼠置于平地、可见大鼠步态正常、爬行时稍有负重感，见图3A。大鼠膝、踝关节活动无显著异常。

2.4 X射线片观察及标本大体观察结果于术后当日行X射线摄片，可见右侧股骨干完全离断，断端略分离，对位、对线良好，图4A；术后1周骨折线清晰，右股骨干断端表面未见明显骨痂，周围软组织轻度肿胀，图4B；术后2周骨折线较模糊，右股骨干断端表面骨痂生成，软组织未见明显肿胀，图4C；术后4周骨折线模糊，进一步愈合，髓腔呈再通趋势，图4D；术后6周右侧股骨外固定置留，克氏针均固定在位、无松动，骨形态恢复，原断端位线良好，周围未见游离体，右侧髋膝在位，图4E。

于6周时进行取材，将股骨标本置于无菌单进行大体观察，见图5，共30只股骨带针标本，均实现取材前存活，其中28只(93%)实现骨愈合；1只愈合不良假关节形成，伴螺钉严重松动合并近端钉道周围大面积骨溶解；2只(7%)螺钉轻度松动；1只(3%)出现严重钉道感染。模型总体一致满意率为90%(27/30)。

2.5 组织学观察结果
2.5.1 苏木精-伊红染色显示钉道周围区域被大量增生的肉芽组织修复，伴有弥散的淋巴细胞与中性粒细胞浸润，少见肉芽肿形成，可见多核巨细胞，边缘可见新生的骨组织，见图6A，B。
2.5.2 Von Kossa 染色纵切及横切图钉道周围均存在显示为黑色或棕黑色的广泛钙盐沉积，见图6C，D。

2.6 Micro CT结果分析通过Micro CT 对股骨标本进行重建，见图7，并通过3D分析对外固定螺钉周围的小梁微结构进行评估，见图8。

定量分析表明，术后6周，模型大鼠内钉道周围骨密度(0.426 7±0.088 7) mg/cm2，骨体积分数(3.125 2±1.004 3)%，骨小梁数目(0.000 3±0.000 1) /μm。进行模型大鼠骨参数分布情况分析和正态性检验，骨密度(P=0.897)，骨体积分数(P=0.690 2)，骨小梁数目(P=0.368 3)总体趋于稳定，呈正态性分布，见图9。

2.7 生物力学测定对24枚螺钉行螺钉拔出实验，螺钉拔出力为(130.416 7±35.008 0) N，进行模型大鼠分布情况分析和正态性检验，P=0.245 6，总体趋于稳定，呈正态性分布，见图10。

2.8 材料生物相容性及不良反应 1只大鼠愈合不良假关节形成，伴螺钉严重松动合并近端钉道周围大面积骨溶解；1只大鼠螺钉轻度松动合并严重钉道感染；1只仅出现严重钉道感染。模型总体一致满意率为90%。

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引言

随着现代社会的发展，因意外导致的骨损伤正逐年増加，越来越多的患者因骨关节创伤和脊柱疾病接受了手术治疗，骨外固定支架因其具有操作简便、构造灵活、对组织损伤小的特点，在临床上得到广泛应用，特别是当面对软组织条件较差的四肢骨折时更能凸显其治疗优势[1-2]，起到不可替代的作用。
不幸的是，外固定支架在治疗患者的同时也带来了许多的并发症，尤其是需要长期带架的患者[3]。螺钉松动和钉道感染是外固定术的常见并发症[4-6]，钉-骨界面是外固定系统中最薄弱的环节，钛基螺钉因其表面存在生物惰性氧化层，无法与骨组织产生稳定的化学键性结构，钉骨界面易形成纤维组织隔层，使螺钉发生松动，导致手术失败。另有一系列研究指出，采用外固定支架治疗的患者中，钉道感染的发生率甚至可达到100%，也就是说钉道感染几乎是使用外固定支架时不可避免的问题[7-9]，如果感染仅局限于皮肤的表面，往往不需要做过多的干预，如细菌一旦侵入深层软组织或骨组织，则会引起固定螺钉松动，导致骨折复位丢失，甚至骨髓炎的发生。这些严重的并发症是导致外固定治疗失效的主要原因，也极大地限制了外固定支架的临床应用。
为了提高螺钉稳定性和减少并发症的发生，学者们尝试采用新型材料或是在医用螺钉表面进行改性的方式加以解决[10]。由此，羟基磷灰石、生物活性肽等各种涂层螺钉应运而生[11-15]。而研究外固定螺钉效能需要合适的动物模型加以验证。因此，建立合适的螺钉效能验证动物模型有着十分重要的意义。
常见的螺钉效能验证动物模型有绵羊、大耳兔的股骨外固定模型及大耳兔股骨、大鼠长骨单钉植入模型等[16-19]。大鼠股骨外固定螺钉效能验证模型的报道较少，现有的外固定模型大部分着重于骨折区域的分析[20-21]，而对螺钉周围骨皮质的研究并未重视。且大多数传统的螺钉效能验证局限于单枚螺钉，即将单枚类螺钉内植物植入骨内[22]，并未构建完整的外固定系统，忽略了实际载荷的影响，亦或是评价体系不够全面[23-25]。经课题组研究发现大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型成功率高，造模过程简单、耗时短，且评价体系更为全面科学，有利于科学研究。此次课题组制作SD大鼠右侧股骨外固定架螺钉效能验证模型，为进一步研究提供基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计动物造模及验证实验，采用D’Agostino & Pearson test法行正态性检验。
1.2 时间及地点实验于2020年8月至2021年3月在新疆医科大学实验室与设备管理处完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康成年SD大鼠30只，雄性，体质量400-450 g，清洁级，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK( 新 )2013-0001。均单笼饲养，室温18-20 ℃，湿度50%-60%，通风良好，自由摄食进水，并按照实验动物的3R原则给予人道关怀。
在实验过程中严格按照中国动物医学伦理学标准及新疆医科大学动物中心实验室动物医学伦理学标准实施(伦理审批号：LACUC-20170222054)。
1.3.2 主要器械和设备

(1)主要器械：简易外固定器由新疆大学工程技术学院重点实验室设计并改进[26]，见图1。整体框架主要材质为钛合金，长、宽、高分别为50.0 mm，10.0 mm及10.0 mm；尾部为调节螺母，配备内四角扳手旋转调节使用。调节螺母转动360°可使滑动块沿轨道平移0.5 mm，用于调试外固定2组螺钉之间的间距。该实验中固定螺钉组间间距为10 mm，组内间距为5 mm。外固定器由4枚1.2 mm×250.0 mm自攻型钛合金螺纹克氏针固定，末端螺纹长12.0 mm。为方便下文叙述，将外固定器相对应的钉道用1-4进行表示，见图1C。

(2)实验试剂及设备：外科手术器械(上海金钟)；舒泰50(Virbac，法国)；40 g/L多聚甲醛(北京白鲨易)；苏木素染液、甲苯胺蓝染液、Von-Kossa 染液(武汉塞维尔)；伊红水溶液(Sigma，美国)；中性树脂(国药集团)；X射线机(柯达DR7500，美国)；Micro CT机(Bruker SkyScan 1176，德国)；硬组织切片机(LEICA HistoCore AUTOCUT，德国)；微型摆锯(苏州保力康)等。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠股骨骨折外固定模型的构建大鼠术前禁食水6 h，按50 mg/kg腹腔注射舒泰50进行麻醉，待麻醉生效后采用动物剃毛刀于右后肢完成备皮，取左侧卧位，术区皮肤表面采用碘伏3次消毒，并铺无菌单。于大鼠右后肢股骨上方取一约30 mm纵形切口。切开皮肤后，可见一白线，为肌间隔标志，钝性分离股外侧肌和股后肌之间的肌间隔，直至骨面，充分显露股骨；期间用拉钩牵拉周围软组织，对周围神经、血管、肌肉等予以保护。于简易外固定器上装配4枚20 mL注射器的注射头作为套筒，滑块间距为5 mm，由近端向远端依次钻入4枚钛克氏螺钉，见图2。

钻孔完毕，此时用拉钩牵拉周围组织，对术区软组织予以保护，同时应注意不破坏骨膜，于两滑块及两组螺钉间等分点，用摆锯截断股骨，截骨时采用低温生理盐水对截骨区持续冲洗，避免产生热损伤[24，27]。用内四角扳手顺时针旋转外固定器末端螺母，调节滑动块，直视下可见股骨完全截断、两端分离。将股骨重新闭合，构建的大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型造模成功。依次用双氧水、碘伏、生理盐水冲洗创面，逐层缝合伤口，无菌纱布包扎，并对纱布缝扎固定，防止大鼠噬咬脱落，造模完成，记录造模所需时长。

1.4.2 术后护理术后将大鼠置于保温毯上，复苏后禁食禁水6 h，随即正常饮食。术后连续3 d予以抗生素预防感染、止疼药止痛。术后每2 d采用碘伏棉球对创面进行消毒、针道护理，更换无菌纱布，直至创面愈合。
观察记录每只大鼠情况，若出现创面严重感染时，及时清创或补充大鼠模型。
1.4.3 X射线片检査在术后当天以及术后1，2，4，6周行常规X射线摄片。
1.4.4 大鼠股骨标本取材及处理在术后6周骨折愈合后，通过腹腔注射过量的戊巴比妥钠将实验动物诱导安乐死，采集大鼠右侧股骨带钉标本。小心将外固定架与克氏针分离，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，新鲜标本小心剔除骨表面软组织后，冰袋储存并根据随机抽样法随机抽取6枚股骨带钉标本于当天行生物力学检测。其余的大鼠股骨标本用40 g/L多聚甲醛浸泡储存，并做好标记。经48 h固定后，用PBS反复清洗大鼠股骨标本，之后置于体积分数75%乙醇中保存。
1.4.5 大鼠股骨标本后续处理将洗净的股骨标本依次放入体积分数 60%-70%-80%-90%-95%乙醇脱水，每梯度 24-72 h，100%Ⅰ12-24 h，100%Ⅱ12-24 h，二甲苯8-24 h。浸塑液Ⅰ4 ℃浸塑24-72 h，浸塑液Ⅱ4 ℃浸塑 24-72 h，浸塑液Ⅲ4 ℃浸塑24-72 h。将组织放入包埋瓶，加适量包埋液，抽真空5 h，37 ℃水浴聚合。硬组织切片机切片10 µm， 60 ℃过夜烤片。
1.4.6 Micro CT 固定保存的组织样本，采用德国Bruker公司SkyScan 1176 小动物Micro-CT扫描影像系统进行扫描，分辨率为18 μm，并采用系统分析软件对目的区域骨组织进行微结构参数分析，所有标本的分析范围保持一致。采用多水平阈值程序将骨与其他组织进行区分，后对包括骨密度、骨体积分数(BV/TV%)、骨小梁数目(Tb.N)在内的多项螺钉周围骨组织指标进行检测。
1.4.7 钉道环境三维重建分析整体骨重建采用DataView软件将经CT扫描重建的样本调整到同一角度后，使用CTvox软件将植入钢钉及附近骨组织进行3D重建。钉道环境分析采用DataView软件将经CT扫描重建的样本(扫描条件对应在原始数据txt文件)调整到同一角度，使用CTan软件将植入螺钉及附近骨组织进行3D模块分割，使用CTan-Ctvol渲染模块得到重建结果。
1.4.8 苏木精-伊红染色依次将切片乙二醇乙醚乙酸酯Ⅰ6 h，37 ℃，乙二醇乙醚乙酸酯Ⅱ过夜，37 ℃，乙二醇乙醚乙酸酯Ⅲ室温10-15 min，乙二醇乙醚乙酸酯Ⅳ室温10-15 min，体积分数100%，95%乙醇梯度脱水各2次每次10 min，80%乙醇 10 min，蒸馏水洗。苏木素染液染色切片8-10 min，蒸馏水洗，分化液分化，蒸馏水洗，返蓝液返蓝，蒸馏水冲洗。切片依次放入体积分数85%，95%的梯度乙醇脱水各5 min，放入伊红染液中染色8-10 min。切片依次放入无水乙醇3次，每次各5 min，二甲苯浸泡2次各 5 min透明，使用中性树胶封固，置于显微镜下观察。
1.4.9 Von Kossa 染色切片脱塑至水，用组化笔画圈圈住组织，切片放置于透明湿盒中，立即滴加 Von Kossa 染液于组织上，加盖，用紫外灯连续照射 5-20 min，蒸馏水洗多次。切片入苏木素染液染3-5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。体积分数85%，95%的乙醇梯度脱水各 5 min，放入伊红染液 5 min；切片依次放入无水乙醇3次，每次5 min透明，中性树胶封固。置于显微镜下观察，采集图像并对结果进行分析。
1.4.10 生物力学测定将大鼠股骨放置于依照骨形态设计与制备的夹具中，螺钉穿过特制的螺钉导向孔并放置螺钉固定套，将螺钉两侧夹紧。固定套和夹具固定在万能拉伸试验机(3005T)的上下夹头，精度0.01 N，以1 mm/s 的加载速度，在股骨正中施加竖直向上的拉力载荷至克氏针从骨内拉出时实验结束，系统每 0.13 s记录载荷、变形数据1次，通过完整数据对每一具股骨标本的载荷-形变曲线进行绘制，记录载荷-变形曲线，从而计算出最大载荷等力学指标(实验全过程骨标本均在相同湿度及温度下进行)。
1.5 主要观察指标 ①大鼠造模时长；②大鼠活动观察；③大鼠右侧股骨X射线检查及标本大体观察；④组织学观察；⑤Micro CT结果分析；⑥生物力学测定结果。
1.6 统计学分析釆用SPSS 26.0统计学软件进行数据的统计学分析，数据使用x±s表示，采用D’Agostino & Pearson test法行正态性检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 既往他人在该领域研究的贡献和存在的问题近年来，伴随组织工程和生物材料等技术的蓬勃发展，更多的前沿技术被应用于骨科内植物和外固定螺钉改性中。文献报道了大量改性螺钉被研制，并通过各种动物模型实现对螺钉周围微环境的研究[28-31]。
Glatt和Matthys等[20]报告了一种外固定器的设计和使用，以研究大段骨缺损或截骨术的愈合。该装置不仅可以在骨损伤愈合时控制其轴向刚度，还可以在体内愈合过程中改变刚度，实现了改变大鼠体内大骨缺损和各种大小截骨术的力学环境并取得了良好的效果，但未针对钉道问题进行进一步的探索。ZHAO等[28]将单枚螺钉植入SD大鼠股骨后，于6周内进行了各项螺钉稳定性及成骨指标的观测，并得到了用Si-TiO2纳米管对钛基螺钉进行表面修饰可以增强早期骨整合的结论，然而受限于单钉植入的造模方式，导致该模型无法直接良好的应用于验证外固定改性螺钉的效能。SCHELL等[18]通过绵羊截骨模型，对螺钉周围骨组织的生物反应进行了分析，以确定螺钉的稳定性、感染发生率和组织学外观之间的关系，但其未对螺钉周围骨密度等螺钉周围感兴趣区域指标进行详细分析，且实验成本较高，在需进行大量动物模型制备的医用材料学领域存在一定的限制。因此，在外固定支架广泛应用于临床治疗的今天，建立一种高度支持外固定螺钉研制且评价方法全面、科学的动物模型尤为重要。
3.2 作者研究区别于他人他篇的特点目前存在的各类动物模型都有其优缺点，此次研究制作的大鼠股骨外固定架改性螺钉效能验证模型有以下优势：①大鼠生命力强，造模成功率高，抗感染能力优越，不易发生麻醉意外，术前、术后易护理，此次造模大鼠均实现术后6周存活。②选用的外固定装置构造简单，制备模型时相较于大型实验动物而言[18，32]，手术过程相对简单，术中出血量少，对周围软组织创伤小，手术时间较短，能在短时间完成批量造模。③大鼠愈合能力强，啮齿动物作为一种快速愈合的动物，比大型物种有明显的优势(例如，快速筛选的研究时间将明显缩短)[33-34]，这将极大缩短实验的周期。ZHAO 等[28]建立的大鼠单钉植入模型中选定了6周作为终末观测点，进行了相关钉道周围骨参数分析，该研究显示在6周内，不同改性螺钉组间的稳定性已出现了统计学上的显著性差异；GUO等[35]也在6周时，得到了其改性涂层具有显著促骨整合功能的结论。且SD大鼠性格较温顺、智力有限，较少发生破坏外固定装置的现象，给实验的成功提供了便利。④相对于山羊、大耳兔等动物，大鼠方便获取，成本较低且容易饲养。⑤在选择大鼠为模型的研究中[23-25]，只有很少的研究考虑了外固定器的单个部件或整个框架结构所贡献的机械作用。此次研究区别于以往的单螺钉内植物模型，通过人工截骨，在骨折模型塑造的基础上进一步通过自制的外固定架复位固定，模拟轴向载荷，使其更符合人体佩戴外固定架的力学状态。⑥另外，动物模型和人类之间的姿势、体位的差异是骨组织工程研究的一个重要考虑因
素[36-37]，尽管直立动物更接近真实载荷，但考虑到动物来源的易获取性和诸多便利因素，啮齿类动物仍然是初期实验室动物模型的优选。当进行临床安全性及有效性的最终实验时，可再次选择在较大的动物(狗、小型反刍动物、猪、非人类原种)中证明其有效性。⑦对比于传统单钉植入模型的另一个优势为，可一次同时检测4个钉道，亦或是感兴趣区域，更好地控制混杂因素，使实验结果更准确。⑧也可以选择不同实验个体间的相同位置的钉道进行比较，排除了螺钉在股骨轴线上植入位置不同所带来的干扰，使其更具有纵向比较的准确性。⑨可在同一只老鼠上进行改性与非改性螺钉的对比，但是这可能会受到螺钉位置不同的轻微影响。⑩在检测钉道周围环境的同时，可对骨折端进行观察、评估。⑪通过组织学和影像学观察螺钉周围骨结合情况，间接验证螺钉促稳定效能；后通过螺钉拔出实验直接验证螺钉稳定性，通过直接和间接相结合的方法可对螺钉的效能进行全面的评估。⑫对钉道微环境进行重建分析可更直观地观测钉-骨界面的骨结合情况，以及螺钉周围的骨小梁情况，更好地分析相关螺钉的促骨整合能力。⑬基因敲除和转基因啮齿动物模型是植入物生物学相关阶段研究的关键资源[38-40]，大鼠基因功能图谱较为完善，有利于开展各类后续实验，在进行分子生物学、免疫学等研究时获取相应的实验耗材相对便捷。⑭大鼠股骨的皮下定位简单、明确，术式简洁，切开皮肤后，沿股骨走行，可见一肌间筋膜白线，沿其切开，钝性分离，通过肌间筋膜入路可减少术中出血。⑮大鼠质量较轻，便于搬运，方便术后检査及拍摄X射线片等。
此次研究使用的外固定装置设计合理，质量约20 g，末端置旋转螺母，可用配套四角扳手进行调节。每旋转螺母1周能使2，3螺钉间距延长0.5 mm。该外固定装置具有以下优点：①外固定装置选择了单臂外固定架系统，其质量轻，对大鼠活动影响较小；②相较于针距固定的组合式外固定架[21，41]，此次研究使用的外固定架可自行调节两组螺钉之间的间距，这就使研究者可以根据具体实验要求自行调节螺钉的间距，使得实验动物模型的制备更为个体化，可达到不同研究目的的造模要求；③单臂外固定装置结构较为简易，使得造模过程更为简单，降低了手术难度，缩短了造模时间，可用于实验模型的大批量制备；④外固定装置侧面标有刻度便于査看两组螺钉之间的间距，利于同批次标准化造模的实现(图2)。
相较于其他实验动物，大鼠体格相对较小，这要求手术更为精细；同时由于大鼠好动的天性，导致更容易出现钉道感染、螺钉松动等并发症，若是对骨折区域进行研究时上述皆为缺点，但进行钉道区域的研究时，例如改性螺钉对于预防外固定支架螺钉松动和感染实验时，则转化为了优点，可以更好地反映干预措施的差异性和有效性。作者认为，总体上来看基于大鼠股骨骨折的外固定架螺钉模型更适用于改性螺钉效能验证的实验研究。
大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型建立时需注意的点：①实验大鼠应统一选择雄性，这可避免雌激素对最终结果产生影响；②为使大鼠对术后环境预适应，应在术前一两周将其饲养于适宜环境，最好单笼饲养，避免术后大鼠互相啃噬伤口，或饲养环境过于狭小导致的外固定架频繁磕碰，并提供充足食物及洁净饮水；③大鼠股骨较小，术中易出现造模导致的骨裂、骨折，增加了手术操作的难度，宜取体质量为400-450 g的大鼠，这一体质量的大鼠股骨长度约为45.0 mm，直径约为4.0 mm，有利于提高造模的成功率；④术前应禁食水6 h，术前、术后予适量抗生素预防感染；术后预防性予止疼药，防止大鼠因疼痛撕咬创面；⑤术后每2 d予以创面碘伏棉球换药，并更换无菌纱布；⑥骨膜对于骨愈合十分重要[42-43]，所以术中应注意尽量保留骨膜组织；⑦当克氏针钻入第一层骨皮质后，可选择换用制式套筒将克氏针手动拧入，以降低裂缝骨折的发生率；⑧克氏针在钻入时一定要贯穿双层皮质，通过增大克氏针螺纹与股骨的接触面积以确保固定的稳固性。有学者建议在固定时，克氏针应贯穿股骨，并露出一两个螺纹[44]。
随着科学技术的发展，越来越多的外固定螺钉表面改性涂层推陈出新，基础研究层面迫切需要合适且稳定的动物模型以验证其效能，对于改性螺钉效能的验证离不开可靠的模型和标准的评价体系。此次研究构建的大鼠股骨模型及评价方法契合外固定螺钉效能验证的需求，通过影像学、组织学、力学稳定性3个层面对螺钉效能进行全方位的评价，且外固定器和外科手术的简单性以及通过肌间筋膜入路造成的最小软组织损伤，使得模型的复制简单可靠，具有很高的修改潜力，成功率高，可在短时间批量造模，是一种实用且有推广价值的动物模型。
3.3 研究的局限性理想化状态应做到每周进行X射线摄片，并再进一步更精确地观测螺钉情况及骨折愈合过程；此次研究中仅选择了终末时间点即术后6周时进行分析，进一步的理想化实验应扩大大鼠样本量，并在1，2，4周也对螺钉周围情况进行分析，终末观测点的选择也可延长至8周甚至12周；缺乏对照组进行比较，这将在后期的研究中开展，并进一步丰富数据结果后进行统计，以更好地支持结论。
3.4 研究的重要意义建立可靠的动物模型对于任何用于最终临床用途的实验治疗都至关重要。此次研究的动物模型及评价方法适用于但不仅限于外固定支架钉道问题的研究。希望通过使用该模型，研究人员将能够设计出预防骨外固定支架钉道并发症产生的新材料及新方法。这将有助于避免目前采用的长期外固定架佩戴而导致治疗效果下降的结局，并减轻带架患者所承受的痛苦和经济负担。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

大鼠股骨外固定架螺钉效能验证模型的建立及评价

Establishment and evaluation of a validation model for the efficacy of external femoral fixator screws in rats

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