芍药苷对脂多糖干预骨髓间充质干细胞的作用机制

doi:10.12307/2022.324

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (13): 2000-2005.doi: 10.12307/2022.324

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

芍药苷对脂多糖干预骨髓间充质干细胞的作用机制

李敏，于洋，程基焱

西南医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，四川省泸州市 646000

收稿日期:2020-12-02 修回日期:2020-12-05 接受日期:2020-12-25 出版日期:2022-05-08 发布日期:2021-12-18
通讯作者: 程基焱，教授，硕士，西南医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，四川省泸州市 646000
作者简介:李敏，女，1994年生，辽宁省阜新市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞与纤维化方面的研究。
基金资助:
四川省科技厅项目(2014，LY-05)，项目负责人：程基焱；四川省教育厅项目(13ZB0258)，项目负责人：程基焱

Mechanism of paeoniflorin on bone marrow mesenchymal stem cells intervened by lipopolysaccharide

Li Min, Yu Yang, Cheng Jiyan

Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2020-12-02 Revised:2020-12-05 Accepted:2020-12-25 Online:2022-05-08 Published:2021-12-18
Contact: Cheng Jiyan, Professor, Master, Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Li Min, Master candidate, Department of Histology and Embryology, Basic Medical College, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Science and Technology Department of Sichuan Province, No. 2014,LY-05 (to CJY); the Education Department of Sichuan Province, No. 13ZB0258 (to CJY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
芍药苷：传统中药芍药的主要单体活性成分，据报道有抗炎、抗菌、抗氧化等特性，广泛应用于神经系统、免疫系统、肿瘤等疾病研究治疗中。
脂多糖：革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，细菌死亡后释放出来，当其作用于人类或动物等其他生物细胞时，激活炎症相关信号通路。

背景：骨髓间充质干细胞在组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面具有强大的应用前景，有效提升骨髓间充质干细胞移植存活率与治疗效果成为研究热点。
目的：探讨芍药苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移能力以及对脂多糖干预下骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、ERK1/2表达的影响。
方法：CCK-8实验检测不同浓度芍药苷对骨髓间充质干细胞的增殖作用，划痕实验检测10 μmol/L芍药苷对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响，实时荧光定量PCR检测10 μmol/L芍药苷干预后骨髓间充质干细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ki67 mRNA表达量。将骨髓间充质干细胞分为对照组、脂多糖组(1 mg/L)、脂多糖+芍药苷组(1 mg/L脂多糖+80 μmol/L芍药苷)，干预72 h后荧光定量PCR、蛋白免疫印迹检测细胞中转化生长因子β1、ERK1/2(MAPK3/1)基因与蛋白表达水平，免疫荧光法对骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1蛋白进行定位与半定量分析。
结果与结论：①一定浓度(6.25-12.5 μmol/L )芍药苷能促进骨髓间充质干细胞增殖；②与对照组比较，10 μmol/L芍药苷组空白划痕面积缩小，差异有显著性意义(P < 0.05)；③与对照组比较，10 μmol/L芍药苷组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ki67 mRNA相对表达量上调，差异有显著性意义(P < 0.01)；④脂多糖刺激后骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、MAPK1、MAPK3 mRNA表达量与转化生长因子β1、p-ERK1/2蛋白表达量上调，差异有显著性意义(P < 0.01)，芍药苷与脂多糖联合干预后，上述基因与蛋白表达量降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；⑤实验结果表明，芍药苷能促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移以及损伤修复相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ki67表达，下调脂多糖干预的骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、ERK1/2(MAPK3/1)基因与蛋白表达。

https://orcid.org/0000-0002-0072-2412(李敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 芍药苷, 脂多糖, 转化生长因子β1, 细胞外调节蛋白激酶

Abstract: BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells have strong potential application prospects in tissue engineering, cell therapy and gene therapy. More and more researches have focus on the effective improvement of survival rate and biological effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the effects of paeoniflorin on bone marrow mesenchymal stem cell proliferation, migration and the transforming growth factor-β1, ERK1/2 genes and proteins expression in bone marrow mesenchymal stem cells intervened by lipopolysaccharide.
METHODS: The effect of paeoniflorin at different concentrations on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells was detected by cell counting kit-8 assay. Scratch test was used to detect the effect of 10 μmol/L paeoniflorin on the migration ability of bone marrow mesenchymal stem cells. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of collagen I, collagen III and Ki67 mRNA under the intervention of 10 μmol/L paeoniflorin. Bone marrow mesenchymal stem cells were divided into control group, lipopolysaccharide group (1 mg/L) and lipopolysaccharide (1 mg/L) + paeoniflorin (80 μmol/L) group. After 72 hours of intervention, real-time fluorescence quantitative PCR and western blot assay were used to detect the transforming growth factor-β1 and ERK1/2 (MAPK3/1) expression of genes and proteins in cells. Transforming growth factor-β1 protein location and semi-quantitative analysis in bone marrow mesenchymal stem cells were detected by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Paeoniflorin increased the proliferation rate of bone marrow mesenchymal stem cells within a certain concentration (6.25-12.5 μmol/L). (2) The blank scratch area of the 10 μmol/L paeoniflorin group was significantly narrowed compared with the control group (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the expression levels of collagen I, collagen III and Ki67 mRNA were significantly increased in the 10 μmol/L paeoniflorin group (P < 0.01). (4) Lipopolysaccharide significantly promoted transforming growth factor-β1, MAPK1, MAPK3 genes and transforming growth factor-β1, p-ERK1/2 protein expression (P < 0.01). After the addition of paeoniflorin, the up-regulated amount was significantly reduced (P < 0.01). (5) Based on the above experimental results, this study concludes that paeoniflorin can promote the proliferation, migration and the expression of collagen I, collagen III and Ki67 genes in bone marrow mesenchymal stem cells. Meanwhile, paeoniflorin can decline the expression of transforming growth factor-β1, ERK1/2 (MAPK3/1) genes and proteins in bone marrow mesenchymal stem cells intervened by lipopolysaccharide.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, paeoniflorin, lipopolysaccharide, transforming growth factor-β1, extracellular regulated protein kinases

中图分类号:

李敏, 于洋, 程基焱. 芍药苷对脂多糖干预骨髓间充质干细胞的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(13): 2000-2005.

Li Min, Yu Yang, Cheng Jiyan. Mechanism of paeoniflorin on bone marrow mesenchymal stem cells intervened by lipopolysaccharide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(13): 2000-2005.

图/表（结果） 8

2.1 芍药苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响统计3.125，6.25，12.5，25，50，100，200 μmol/L芍药苷给药组在24，48，72 h的细胞增殖率，见图1。由图可见，72 h各浓度组细胞增殖率最高，其中12.5 μmol/L芍药苷组达到峰值，后续细胞迁移能力与目的基因检测实验设置芍药苷干预剂量为整数值10 μmol/L。

2.2 芍药苷对大鼠骨髓间充质干细胞迁移能力的影响细胞划痕实验观察0，10 μmol/L芍药苷作用24 h后对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响，见图2。由图可见，10 μmol/L芍药苷组迁移距离缩小，对照组迁移距离变化不明显。应用ImageJ软件对两组划痕面积百分比统计分析，对照组划痕面积百分比大于芍药苷组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 芍药苷对大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原、Ki67基因表达的影响 10 μmol/L芍药苷作用72 h后实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原、Ki67基因表达，见图3。由图可见，10 μmol/L芍药苷组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ki67 mRNA相对表达量与对照组相比升高(P < 0.01，P < 0.01，P < 0.001)。

2.4 芍药苷与脂多糖对大鼠骨髓间充质干细胞的细胞毒性 CCK-8实验检测芍药苷对骨髓间充质干细胞的细胞毒性，24，48，72 h时100 μmol/L芍药苷组与对照组相比细胞存活率降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4A。CCK-8实验检测脂多糖组(1 mg/L)、脂多糖+芍药苷组(1 mg/L脂多糖+ 80 μmol/L芍药苷)干预72 h对骨髓间充质干细胞的细胞毒性，脂多糖组以及脂多糖+芍药苷组与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4B。

2.5 芍药苷对脂多糖干预的大鼠骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、ERK1/2(MAPK3/1)基因表达的影响脂多糖组骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、MAPK1、MAPK3 mRNA相对表达量与对照组相比升高(P < 0.001)，脂多糖+芍药苷组与脂多糖组相比下降(P < 0.001)，见图5。

2.6 Western blot检测大鼠骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、ERK1/2蛋白表达的影响脂多糖组骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、p-ERK1/2相对蛋白表达量与对照组相比升高(P < 0.01)，脂多糖+芍药苷组与脂多糖组相比下降(P < 0.01)，见图6。

2.7 大鼠骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1蛋白定位与半定量分析图7A显示脂多糖组的荧光强度较对照组与脂多糖+芍药苷组强，应用Image-Pro Plus软件计算红色荧光面积后进行统计学分析，脂多糖组转化生长因子β1蛋白相对表达量与对照组相比增加(P < 0.001)，脂多糖+芍药苷组与脂多糖组相比降低(P < 0.001)，见图7B。

2.8 生物相容性 SD大鼠骨髓间质干细胞购买于赛业生物科技公司，经过了常规细菌、支原体等检测与分化能力检测，具有较高的存活率与复苏贴壁率。CCK-8实验检测脂多糖组(1 mg/L)、脂多糖+芍药苷组(1 mg/L脂多糖+80 μmol/L芍药苷)干预72 h对骨髓间充质干细胞的细胞毒性，脂多糖组以及脂多糖+芍药苷组与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，可用此剂量进行后续实验检测目的基因与蛋白。

参考文献

[1] 荣为为,韩明子,金世柱,等.骨髓间充质干细胞在组织工程研究中的应用新进展[J].现代生物医学进展,2017,17(5):982-984.
[2] 雷蓉,罗勇.骨髓间充质干细胞移植入心脏后存活率的研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,7(14):182-183.
[3] LAKE D, CORRÊA SA, MÜLLER J. Negative feedback regulation of the ERK1/2 MAPK pathway. Cell Mol Life Sci. 2016;73(23):4397-4413.
[4] 贾骏麒,赵路,陈媛丽,等.TGF-β1 在放射性颌骨骨髓炎发病过程中对骨髓间充质干细胞的影响及其分子机制的体外研究[J].实用口腔医学杂志,2020,36(3):428-432.
[5] 郑世存,李晓宇,欧阳兵,等.芍药苷药理作用研究新进展[J].中国药物警戒,2012,9(2):100-103.
[6] XIU GH, ZHOU X, LI XL, et al. Role of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells in Attenuating Inflammatory Reaction in Lipopolysaccaride-induced Acute Kidney Injury of Rats Associated with TLR4-NF-κB Signaling Pathway Inhibition. Ann Clin Lab Sci. 2018;48(6): 743-750.
[7] 李晓峰,赵劲民,苏伟,等.大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究,2011,15(10):1721-1725.
[8] 张婉,符伟国,史振宇.过表达 FOSL1 改善骨髓间充质干细胞增殖和迁移能力[J].老年医学与保健,2020,26(2):187-190.
[9] ZHOU Y, HU X, ZHENG X, et al. Differentiation Potential of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue vs Bone Marrow Toward Annulus Fibrosus Cells In vitro. Curr Stem Cell Res Ther. 2017;12(5): 432-439.
[10] ZHANG Y, NAGURO I, HERR AE. In Situ Single-Cell Western Blot on Adherent Cell Culture. Angew Chem Int Ed Engl. 2019;58(39): 13929-13934.
[11] PARRA ER, URAOKA N, JIANG M, et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Sci Rep. 2017;7(1):13380.
[12] LUO Z, WU F, XUE E, et al. Hypoxia preconditioning promotes bone marrow mesenchymal stem cells survival by inducing HIF-1α in injured neuronal cells derived exosomes culture system. Cell Death Dis. 2019; 10(2):134.
[13] DENG YB, YE WB, HU ZZ, et al. Intravenously administered BMSCs reduce neuronal apoptosis and promote neuronal proliferation through the release of VEGF after stroke in rats. Neurol Res. 2010;32(2):148-156.
[14] HAN S, WANG B, LI X, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells in three-dimensional culture promote neuronal regeneration by neurotrophic protection and immunomodulation. J Biomed Mater Res A. 2016;104(7):1759-1769.
[15] JU S, TENG GJ, LU H, et al. In vivo MR tracking of mesenchymal stem cells in rat liver after intrasplenic transplantation. Radiology. 2007; 245(1):206-215.
[16] CHEN S, SHI J, ZHANG M, et al. Mesenchymal stem cell-laden anti-inflammatory hydrogel enhances diabetic wound healing. Sci Rep. 2015;5:18104.
[17] GONG DJ, WANG L, YANG YY, et al. Diabetes aggravates renal ischemia and reperfusion injury in rats by exacerbating oxidative stress, inflammation, and apoptosis. Ren Fail. 2019;41(1):750-761.
[18] LIU X, ZHENG L, ZHOU Y, et al. BMSC Transplantation Aggravates Inflammation, Oxidative Stress, and Fibrosis and Impairs Skeletal Muscle Regeneration. Front Physiol. 2019;10:87.
[19] 陈谱,阮安民,周俊,等.基于NF-kB信号通路探讨芍药苷对LPS诱导的人软骨细胞炎症及退变的作用机制[J].北京中医药大学学报,2020,43(11):903-909.
[20] ZHANG YC, CHEN BX, XIE XY, et al. Role of Tenascin-X in regulating TGF-β/Smad signaling pathway in pathogenesis of slow transit constipation. World J Gastroenterol. 2020;26(7):717-724.
[21] MULDER KM. Role of Ras and Mapks in TGFbeta signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 2000;11(1-2):23-35.
[22] FEZZA M, MOUSSA M, AOUN R, et al. DKK1 promotes hepatocellular carcinoma inflammation, migration and invasion: Implication of TGF-β1. PLoS One. 2019;14(9):e0223252.
[23] JI Y, DOU YN, ZHAO QW, et al. Paeoniflorin suppresses TGF-β mediated epithelial-mesenchymal transition in pulmonary fibrosis through a Smad-dependent pathway. Acta Pharmacol Sin. 2016;37(6):794-804.
[24] BLOBE GC, SCHIEMANN WP, LODISH HF. Role of transforming growth factor beta in human disease. N Engl J Med. 2000;342(18):1350-1358.
[25] 陈彩云,许秋霞,张吟,等.水飞蓟素对急性胰腺炎大鼠急性肺损伤及MAPK/NF-κB信号通路的影响[J].中国药理学通报,2019,35(2): 192-197.
[26] BEI Y, TIANQIAN H, FANYUAN Y, et al. ASH1L Suppresses Matrix Metalloproteinase through Mitogen-activated Protein Kinase Signaling Pathway in Pulpitis. J Endod. 2017;43(2):306-314.e2.
[27] PIRELLI L, YU PJ, GULKAROV I, et al. Inhibition of Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) as a Strategy to Prevent Intimal Hyperplasia Following Cardiovascular Interventions. Vascular Disease Prevention. 2008;3(1):173-183.
[28] SEGER R, KREBS EG. The MAPK signaling cascade. FASEB J. 1995;9(9): 726-735.
[29] QIANG Y, MA F, WANG Z, et al. LukS-PV induces cell cycle arrest and apoptosis through p38/ERK MAPK signaling pathway in NSCLC cells. Biochem Biophys Res Commun. 2020;521(4):846-852.
[30] HAWKE LG, MITCHELL BZ, ORMISTON ML. TGF-β and IL-15 Synergize through MAPK Pathways to Drive the Conversion of Human NK Cells to an Innate Lymphoid Cell 1-like Phenotype. J Immunol. 2020;204(12): 3171-3181.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年10月在西南医科大学基础医学院形态学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 SD大鼠骨髓间质干细胞购买于赛业生物(货号：RASMX-01101；批号：130815L01)，经过了细菌/真菌、支原体、内毒素检测，以及细胞复苏活力检测与分化能力、表面标记物鉴定。将生长状态良好的5-8代细胞用于后续实验。
1.3.2 实验试剂和仪器芍药苷(普思，中国)；脂多糖(Sigma，美国)；α-MEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、GAPDH单克隆抗体(碧云天，中国)；PCR引物(生工，中国)；RNA提取试剂盒、第一链cDNA合成预混体系Master Premix(For qPCR)试剂盒、荧光定量PCR试剂盒-SYBR Green Ⅰ染料法(福际，中国)；重组抗转化生长因子β1抗体、重组抗ERK1(phospho T202)+ERK2 (phospho T185)抗体、重组抗ERK1+ERK2抗体(Abcam，英国)。多功能酶标仪(Spectra Max M3，美国)；荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)；荧光倒置相差显微镜(AMG，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的培养细胞复苏后应用α-MEM培养液培养，每2 d换液1次，待细胞融合至90%左右传代，取状态良好的细胞消化制成细胞悬液并计数备用[7]。
1.4.2 CCK-8试剂盒检测细胞增殖率培养皿中的细胞(第5-8代)消化重悬计数，以2×103个/孔接种到96孔板，每孔0.1 mL，24 h后给予芍药苷处理，芍药苷终浓度分别为3.125，6.25，12.5，25，50，100，200 μmol/L，每个浓度均设置6个复孔，继续培养24，48，72 h后取出96孔板，弃培养基，每孔加含10%CCK-8溶液的α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱中孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值，计算细胞增殖率[8]。细胞增殖率=[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)] ×100%。
1.4.3 划痕实验检测细胞迁移能力将骨髓间充质干细胞(第5-8代)以2×104个/孔接种于6孔板，每孔2 mL，细胞铺满孔底，采用200 μL枪头垂直于孔板底部进行划痕，PBS洗细胞3次，将细胞分为对照组、芍药苷组(10 μmol/L)，放入培养箱培养24 h后取出，PBS洗细胞3次，40 g/L多聚甲醛固定，光学显微镜下拍照记录。

1.4.4 实时荧光定量PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原与Ki67基因表达量将骨髓间充质干细胞(第5-8代)接种于6孔板，培养24 h后将细胞分为对照组、芍药苷组(10 μmol/L)，加药干预72 h后取出培养板，按照试剂盒说明提取RNA，反转录为cDNA，然后进行扩增，扩增条件为95 ℃反应3 min，40个循环的95 ℃反应10 s，60 ℃反应10 s，72 ℃反应20 s[9]，按照2-ΔΔCt公式计算Ⅰ、Ⅲ型胶原与Ki67基因表达量。各基因引物序列见表1。

1.4.5 CCK-8试剂盒检测芍药苷、脂多糖细胞毒性将消化重悬后的骨髓间充质干细胞(第5-8代)以5×103个/孔接种于2块96孔板，每孔0.1 mL，一块培养板检测不同浓度芍药苷的细胞毒性，设芍药苷终浓度分别为12.5，25，50，100 μmol/L；另一块培养板检测脂多糖以及脂多糖联合芍药苷的细胞毒性，将细胞分为对照组、脂多糖组(1 mg/L)、脂多糖+芍药苷组(1 mg/L脂多糖+80 μmol/L芍药苷)。每个浓度均设置6个复孔，72 h后取出2块96孔板，弃培养基，每孔加含10%CCK-8溶液的α-MEM培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱中孵育1 h，酶标仪测定450 nm波长处的吸光度值。
1.4.6 实时荧光定量PCR检测转化生长因子β1、MAPK1、MAPK3基因表达量将消化重悬后的骨髓间充质干细胞(第5-8代)以5×103个/孔接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h后分为对照组、脂多糖组(1 mg/L)、脂多糖+芍药苷组(1 mg/L 脂多糖+80 μmol/L芍药苷)，培养72 h后采用实时荧光定量PCR检测转化生长因子β1、MAPK1、MAPK3基因表达量。各基因引物序列见表2。

1.4.7 Western blot检测转化生长因子β1、p-ERK1/2蛋白表达量将消化重悬后的骨髓间充质干细胞(第5-8代)以5×103个/孔接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h后分为对照组、脂多糖组(1 mg/L)、脂多糖+芍药苷组(1 mg/L脂多糖+80 μmol/L芍药苷)，干预72 h后取出培养板，用预冷PBS冰上洗3次，每孔加入裂解液80 μL，冰上裂解30 min后收集样品，低温离心20 min，取部分上清进行BCA法测定蛋白质量浓度，剩余上清加入5×loading buffer，100 ℃煮沸10 min后用于后续实验或置于-80 ℃冰箱保存。制备10% SDS-PAGE凝胶，上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜转膜，脱脂牛奶封闭1 h，加入抗转化生长因子β1、ERK1/2、p-ERK1/2抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗6次，每次5 min，加入二抗(稀释1∶1 000)，室温孵育1 h，TBST洗6次，每次5 min，于凝胶成像系统下成像[10]，采用ImageJ软件对目的条带进行分析。
1.4.8 细胞免疫荧光染色进行转化生长因子β1蛋白定位及半定量分析将骨髓间充质干细胞爬片铺于24孔板中，培养24 h后分为对照组、脂多糖组(1 mg/L)、脂多糖+芍药苷组(1 mg/L脂多糖+80 μmol/L芍药苷)，干预72 h细胞融合至70%-80%后弃培养基，PBS洗3次，每次5 min，40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗6次，每次5 min，0.1% Triton X-100通透15 min，PBS洗6次，每次5 min，BSA封闭1 h，加入抗转化生长因子β1抗体4 ℃孵育过夜，PBS洗6次，每次5 min，加入荧光标记二抗，室温孵育1 h，PBS洗6次，每次5 min，含DAPI的封片剂封固[11]，荧光显微镜下观察拍照记录。激发红色荧光的二抗与细胞内转化生长因子β1特异性结合后荧光显微镜拍摄结果显示为红色，细胞核显示为蓝色。采用Image-Pro Plus对红色荧光进行分析。
1.5 主要观察指标 ①芍药苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移以及Ⅰ、Ⅲ型胶原、Ki67基因表达的影响；②芍药苷对脂多糖诱导的炎性损伤大鼠骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、ERK1/2(MAPK3/1)基因与蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析将各实验独立重复6次后取得的结果，应用GraphPad Prism 5软件，采用t检验、单因素方差分析以及重复测量单因素方差分析进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

研究证明骨髓间充质干细胞可以诱导分化为软骨细胞、神经细胞和成纤维细胞等多种细胞协助修复受损组织[12-13]，进而广泛应用于基础与临床疾病治疗研究[14]，如脊神经损伤、缺血性脑卒中、心肌梗死、肝硬化以及病理性瘢痕等[15-17]，但单纯的骨髓间充质干细胞移植治疗效果不佳，移植率很低，其主要原因为损伤局部炎症因子的大量释放，形成不利于骨髓间充质干细胞增殖并发挥生物学效应的微环境[18]。该实验研究中药单体芍药苷是否有促骨髓间充质干细胞增殖的作用以及芍药苷对脂多糖干预的骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、ERK1/2基因与蛋白表达的影响。
芍药苷因其毒副作用小、抗炎、抗菌、免疫调节等特性在临床研究中广泛应用[5]。陈谱等[19]报道芍药苷能够通过抑制NF-κB信号通路激活，抑制脂多糖诱导的人软骨细胞炎症，延缓软骨退变。该实验初步探索了芍药苷对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移及相关基因表达的影响，结果表明芍药苷可以促进骨髓间充质干细胞增殖、迁移，同时上调了组织损伤修复相关基因Ⅰ、Ⅲ型胶原、Ki67的mRNA表达量。
研究发现，机体损伤后TGF-β1/Smads通路以及MAPK-ERK信号通路被激活[20-21]。TGF-β1/Smads信号通路在组织损伤修复的炎症期可以趋化大量炎症细胞向创面聚集，诱导强烈的单核细胞炎症反应[22]，新生血管形成，影响到组织损伤愈合过程各个阶段[23]。如脊髓损伤后TGF-β1/Smads通路被激活，转化生长因子β1蛋白表达量上调，最终形成胶原瘢痕，使轴突很难再生[24]。MAPK-ERK信号通路在急性肺损伤、急性牙髓炎、病理性瘢痕增殖等疾病中也可被激活[25-27]，MAPK-ERK信号通路可将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内[28]，引起细胞增殖、分化、转化及凋亡等一系列生物学反应[29-30]。该实验中脂多糖上调了炎症损伤相关细胞因子转化生长因子β1的表达，同时使ERK1/2磷酸化水平增加，芍药苷能有效下调脂多糖诱导的ERK1/2磷酸化蛋白表达水平以及转化生长因子β1基因与蛋白的表达量。
综上，体外实验表明，芍药苷可促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖、迁移以及与组织损伤修复相关基因Ⅰ、Ⅲ型胶原、Ki67表达，下调脂多糖干预的骨髓间充质干细胞中转化生长因子β1、ERK1/2基因与蛋白表达量。该实验为芍药苷联合骨髓间充质干细胞移植治疗各种器官损伤提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

芍药苷对脂多糖干预骨髓间充质干细胞的作用机制

Mechanism of paeoniflorin on bone marrow mesenchymal stem cells intervened by lipopolysaccharide

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[2]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[3]	王琴, 沈呈, 廖静, 杨烨. 达格列净干预改善糖尿病肾病模型大鼠的肾脏损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1216-1222.
[4]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[5]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[6]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.
[7]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[8]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[9]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[10]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[11]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[12]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[13]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[14]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[15]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.