小鼠髓核特异性标志物的鉴定和表达分析

doi:10.12307/2022.349

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (11): 1669-1674.doi: 10.12307/2022.349

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小鼠髓核特异性标志物的鉴定和表达分析

张磊1，修春美1，倪莉2，陈建权1，2

1苏州大学医学部骨科研究所，江苏省苏州市 215008；2苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2021-03-02 修回日期:2021-03-04 接受日期:2021-04-28 出版日期:2022-04-18 发布日期:2021-12-11
通讯作者: 陈建权，博士，教授，苏州大学医学部骨科研究所，江苏省苏州市 215008；苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006 倪莉，博士，副研究员，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:张磊，女，1996年生，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事椎间盘生长发育及退变方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81902248)，项目负责人：倪莉

Identification and expression analysis of mouse nucleus pulposus specific markers

Zhang Lei1, Xiu Chunmei1, Ni Li2, Chen Jianquan1, 2

1Institute of Orthopedics, Medical College of Soochow University, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2021-03-02 Revised:2021-03-04 Accepted:2021-04-28 Online:2022-04-18 Published:2021-12-11
Contact: Chen Jianquan, MD, Professor, Institute of Orthopedics, Medical College of Soochow University, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Ni Li, MD, Associate researcher, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Zhang Lei, Master candidate, Institute of Orthopedics, Medical College of Soochow University, Suzhou 215008, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81902248 (to NL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
椎间盘退变：腰椎退变指的是关节软骨发生退变，继发以关节边缘和软骨下骨质增殖形成的一种关节病变。衰老、压迫、炎症等因素均会诱发椎间盘退变。
髓核：髓核组织是椎间盘的重要成分，是由纵横交错的纤维网状结构即髓核细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。随着年龄的增长，髓核中的蛋白多糖解聚增多，水分逐渐减少，与周围椎间盘组织界限不清晰，极易发生椎间盘突出。所以特异且明确的髓核标志物可为辨别髓核和其余组织提供良好的研究基础。

背景：椎间盘退变是下腰痛的主要诱因，而髓核细胞在椎间盘退变中起着至关重要的作用。小鼠模型是研究椎间盘稳态和退变的重要动物模型，然而对小鼠髓核特异性标志物目前还缺乏较为系统的分析。
目的：验证细胞角蛋白19、葡萄糖转运蛋白1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3这3种蛋白在不同时期小鼠椎间盘内的表达情况及其细胞特异性；探讨上述蛋白作为小鼠髓核特异性标志物的可行性。
方法：10只6周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为2月龄组及12月龄组(n=5)，分别饲养至相应月龄时收取椎间盘样本进行后续分析。采用苏木精-伊红染色和番红固绿染色评估椎间盘组织学完整形态；利用免疫荧光或免疫组化染色检测细胞角蛋白19、葡萄糖转运蛋白1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3这3种蛋白在两组小鼠椎间盘冠状位切片上的表达情况，并通过统计学方法分析各蛋白在不同年龄小鼠椎间盘中的表达变化。
结果与结论：①在2月龄小鼠椎间盘内，上述3种标志物均可明显区分髓核与其他组织；②在12月龄老年小鼠椎间盘内，只有细胞角蛋白19仍旧特异性表达于髓核组织，而葡萄糖转运蛋白1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3除在髓核细胞表达外，在软骨终板的钙化处亦有出现；③提示细胞角蛋白19、葡萄糖转运蛋白1和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3均在小鼠髓核细胞表达，其中细胞角蛋白19可作为年轻及老龄小鼠的髓核特异性标志物。
缩略语：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3：glypican-3，Gpc3

https://orcid.org/0000-0001-5471-3741 (张磊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 髓核, 细胞角蛋白19, 葡萄糖转运蛋白1, 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3, 椎间盘退变, 小鼠, 髓核标志物

Abstract: BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration is the main cause of low back pain, and nucleus pulposus cells play a vital role in intervertebral disc degeneration. A mouse model is an important animal model for studying the homeostasis and degeneration of the intervertebral disc. However, there is still a lack of systematic analysis of mouse nucleus pulposus specific markers.
OBJECTIVE: To verify the expression and cell specificity of cytokeratin 19, glucose transporter 1, and glypican 3 in the intervertebral discs of mice at different stages and to explore the feasibility of the above proteins used as specific markers of the mouse nucleus pulposus.
METHODS: Ten 6-week-old C57BL/6 male mice were randomly divided into a 2-month-old group and a 12-month-old group (n=5), and intervertebral disc samples were collected for subsequent analysis when the mice were raised to the corresponding months. Hematoxylin-eosin staining and Safranin O&Fast Green staining were used to evaluate the histological integrity of the intervertebral discs. Immunofluorescence or immunohistochemical staining was used to detect the protein expression of cytokeratin 19, glucose transporter 1, and glypican 3 on the coronal slices of the intervertebral discs, and protein expression changes in mice of different ages were statistically analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Cytokeratin 19, glucose transporter 1, and glypican 3 were specifically expressed in the nucleus pulposus tissues of 2-month-old mice. Only cytokeratin 19 was specially expressed in the nucleus pulposus tissues of 12-month-old mice, whereas glucose transporter 1 and glypican 3 appeared in the nucleus pulposus cells as well as in the endplate. Therefore, cytokeratin 19, glucose transporter 1, and glypican 3 can all be expressed in the nucleus pulposus tissues from 2- and 12-month-old mice, but only cytokeratin 19 can serve as the nucleus pulposus-specific marker for both young and aged mice.

Key words: nucleus pulposus, cytokeratin 19, glucose transporter 1, glypican 3, intervertebral disc degeneration, mouse, nucleus pulposus specific marker

中图分类号:

张磊, 修春美, 倪莉, 陈建权. 小鼠髓核特异性标志物的鉴定和表达分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(11): 1669-1674.

Zhang Lei, Xiu Chunmei, Ni Li, Chen Jianquan. Identification and expression analysis of mouse nucleus pulposus specific markers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(11): 1669-1674.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 2月龄及12月龄两组小鼠各5只，饲养过程至收取样本的过程中，未出现小鼠死亡的情况，即2月龄和12月龄两组结果各包括5个样本。
2.2 小鼠椎间盘组织学染色首先通过组织学染色分析年轻小鼠(2月龄)和老年(12月龄)小鼠椎间盘组织的形态结构。苏木精-伊红染色结果显示，2月龄和12月龄小鼠椎间盘结构完整且大体相同，纤维环和髓核界限均清楚，见图1A-D；但两组小鼠也出现一些不同之处：①2月龄小鼠软骨终板无骨性结构，而12月龄小鼠软骨终板处已出现部分钙化，见图1B(箭头所示)；②2月龄小鼠髓核细胞呈圆形和椭圆形，含囊泡样结构；而12月龄小鼠髓核细胞多为细长型，见图1C，D。番红固绿染色结果显示，2月龄和12月龄小鼠椎间盘均含有丰富的细胞外基质，见图1E-H。

2.3 细胞角蛋白19在小鼠椎间盘中的表达情况为了观察细胞角蛋白19在小鼠椎间盘内的表达情况，对2月龄和12月龄小鼠分别进行了免疫荧光染色，结果见图2。2 月龄小鼠椎间盘中，细胞角蛋白19阳性信号(红色荧光信号)仅出现于椎间盘中间髓核位置，见图2A，C；而在纤维环和软骨终板内未观察到任何细胞角蛋白19阳性信号，见图2E，G；定量结果进一步显示约99%的髓核细胞表现为细胞角蛋白19阳性，见图2I。与2 月龄小鼠类似，12 月龄小鼠椎间盘内，约99%的髓核组织细胞表达细胞角蛋白19阳性，见图2B，D， J；而在纤维环和软骨终板内仍未见明显的细胞角蛋白19阳性信号，见图2F，H。综上，细胞角蛋白19可特异性识别年轻及老龄小鼠的髓核细胞。

2.4 葡萄糖转运蛋白1在小鼠椎间盘中的表达情况为了检测葡萄糖转运蛋白1在小鼠髓核中的特异性表达情况，随后对其进行了免疫荧光染色，见图3。免疫荧光结果显示，2月龄小鼠椎间盘内，葡萄糖转运蛋白1阳性信号主要位于椎间盘中间髓核组织处，见图3A，C；而在纤维环和软骨终板处则无明显的葡萄糖转运蛋白1表达，见图3A，E，G，统计结果进一步显示，葡萄糖转运蛋白1阳性细胞在髓核、纤维环和软骨终板中的占比分别为100%，0%和2%，见图3I。而12月龄小鼠椎间盘内，葡萄糖转运蛋白1仍大量表达在髓核内，见图3B，D；但在软骨终板钙化处也可观察到葡萄糖转运蛋白1阳性信号的出现，见图3H；而纤维环处始终未有阳性信号，见图3F，统计结果进一步确认了上述观察，见图3J。因此综上，葡萄糖转运蛋白1可特异性识别年轻小鼠的髓核细胞，但在老龄小鼠中，其髓核特异性有所下降。

2.5 Gpc3在小鼠椎间盘中的表达情况同样地，也利用免疫组化的方法观测了Gpc3的表达情况，见图4。2月龄小鼠椎间盘内，Gpc3阳性信号主要位于椎间盘中间髓核组织处，见图4A，C；而在纤维环和软骨终板处则无明显的Gpc3表达，见图4E，G；统计结果进一步显示，Gpc3阳性细胞在髓核、纤维环和软骨终板中的占比分别为99%，2%和2%，见图4I。12月龄小鼠椎间盘内，Gpc3仍大量表达在髓核内，见图4B，D；且在纤维环内侧细胞和软骨终板钙化处细胞中也有大量表达，见图4F，H；定量分析结果显示，Gpc3阳性细胞在髓核、纤维环和软骨终板中的占比分别为99%，29%和51%，见图4J。上述结果表明，Gpc3阳性可特异性识别年轻小鼠的髓核细胞，但在老龄小鼠中，其髓核特异性有所下降。

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引言

下腰痛是现代人群中发病率较高、覆盖范围较广的常见疾病[1]。随着社会发展和人民生活方式的改变，下腰痛发病率呈逐年增高的趋势[2-3]，且患者趋于年轻化[4]。有数据表明，全球约84%的人口罹患下腰痛，其中有10%的患者会因此致残[5-6]。因此，下腰痛不仅严重影响了患者的身心健康和生活质量，也对家庭和社会造成了沉重的经济负担[7]，仅2016年下腰痛相关的医疗保健就给美国造成高达1 345亿美元的花费[8]。大量的研究已证明椎间盘退变是诱发下腰痛的主要原因[9-10]，目前临床上对椎间盘退变引起下腰痛的治疗方法包括保守治疗和手术治疗等[11-13]，这些方法可以在一定程度上改善疼痛等临床症状，但无法从根本上延缓椎间盘退变的发生发展，甚至有可能加速病变相邻椎间盘的退变[14]，造成上述局面的根本原因在于对椎间盘退变的机制还缺乏深入的了解。
椎间盘是一种位于相邻椎体之间的大型纤维软骨复合物，在支撑脊柱负重及协助躯体运动方面起着极其重要的作用[15]，由外周的纤维环、上下软骨终板和中间的髓核组织3部分所组成[16]。尽管椎间盘退变的确切机制尚不完全清楚，越来越多的证据表明，异常的髓核细胞功能是促成椎间盘退变的关键因素[17]，其具体表现为髓核细胞减少、凋亡增加以及软骨样细胞出现等[18-19]。鉴于髓核在椎间盘退变中的重要作用，如何特异性识别髓核细胞显得尤为关键。此外，由于髓核细胞的活性维持是椎间盘发挥功能的基础，目前一些生物治疗方法也致力于逆转髓核的退变以延缓椎间盘的退变，包括为退变椎间盘补充健康的髓核细胞和利用诱导间充质干细胞或其他来源的干细胞分化成为髓核细胞[20-22]。因此，髓核细胞的鉴定同时也是后续评估上述髓核靶向治疗方法的必要条件。
迄今为止，对不同动物体内髓核组织特异性标志物的研究结果已有零星报道。例如，在先天软骨不良的犬只椎间盘内，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，Gpc3)、细胞角蛋白18在髓核组织内的表达量明显高于其在周围纤维环内的表达[23]，但细胞角蛋白18的免疫荧光结果显示其在纤维环组织内也有较多表达，无法完全区分髓核与纤维环。此外，LEE等[24]在对比了老年大鼠关节软骨与髓核组织的差异基因后，发现Gpc3、细胞角蛋白19在髓核内的表达量高于关节软骨组织的5倍以上。而在人类椎间盘组织中，则有研究发现葡萄糖转运蛋白1在髓核及纤维环的表达差异巨大，因此除了表明椎间盘在代谢特性上存在区域差异外，也将葡萄糖转运蛋白1作为髓核标志物的一种[25]。
小鼠是复制人类疾病动物模型和研究基因功能的重要模式动物。尽管小鼠椎间盘和人类椎间盘所处力学环境不尽相同[26]，但两者结构相似[27]；同样地，小鼠和人类椎间盘在增龄过程中，其髓核组织均会发生类似的病理改变，包括脊索样髓核细胞的减少或消失和软骨样细胞的出现；此外，小鼠基因组与人类基因组高度同源，且小鼠具有其他脊椎动物模型不具备的基因修饰模型，包括转基因、基因敲除/敲入和自然突变模型[28-30]。然而，对小鼠髓核特异性标志物目前还缺乏较为系统的研究，上述蛋白在小鼠椎间盘中的表达情况尚不完全可知，一定程度上影响了小鼠模型在椎间盘退变机制研究中的进一步应用。
此次实验选取细胞角蛋白19、葡萄糖转运蛋白1及Gpc3三种在其他物种内已报道的髓核标志物，在小鼠2月龄及12 月龄时分别探究其表达位置和特异性，来确定这些髓核标志物在小鼠椎间盘组织内的表达情况，探讨其作为小鼠髓核特异性标志物的可行性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，不同组别样品间采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年8月至2020年12月在苏州大学医学部骨科研究所实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选择苏州大学实验动物中心提供的6周龄C57BL/6雄性小鼠10只，许可证号：SYXK(苏)2017-0043。待适应性饲养至2月龄时，按随机数字表法取出5只小鼠作为2月龄组，剩余5只为12月龄组，两组体质量分别为(20.2± 0.9) g和(20.4±0.6) g，两组间相比差异无显著性意义(P > 0.05)。
所有C57BL/6小鼠饲养于苏州大学SPF级实验动物中心，食物水源充足，未有其他外部环境干扰，100%存活至相应分析时间点(2月龄或12月龄)。所有动物在适龄时被注射麻醉剂后处死，收取样本及时固定并处理后进行后续分析。其中2 月龄组小鼠在分组当天麻醉后处死，并收取椎间盘样本；而12 月龄组小鼠则饲养至12月龄时再收取样本。所有实验操作均严格按照实验动物手术操作规范进行，并已通过医院伦理委员会的审批。
1.3.2 主要试剂及设备仪器多聚甲醛、抗荧光淬灭剂(Sigma，美国)，蔗糖、中性树脂、DAPI(生工生物工程上海股份有限公司，中国)，细胞角蛋白19一抗(Abcam公司，美国)，葡萄糖转运蛋白1抗体(Servicebio，中国)，Gpc3抗体(Abcam公司，美国)，兔SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)，兔647荧光二抗(Life公司，美国)，组织包埋剂(OCT)(Leica，德国)，正置显微镜(蔡司公司，德国)。
1.4 方法
1.4.1 样本收取及处理
(1)样本收取：分别在C57BL/6小鼠成熟期(2月龄)及中老年期(12月龄)时，按照小鼠体质量以50 mg/kg的剂量腹腔注射氯胺酮混合麻醉剂，随后处死小鼠。收取新鲜腰椎组织浸泡入预冷40 g/L多聚甲醛内，于4 ℃摇床上固定过夜。次日，用预冷1×PBS清洗样本后，浸泡入14%EDTA(pH 7.4)脱钙液内，于4 ℃脱钙14 d后，依次浸泡入15%蔗糖、30%蔗糖各24 h后即可进行OCT包埋。
(2)冰冻切片：已处理好的样本，用OCT进行包埋，随后放入液氮中速冻定型即可切片，冰冻切片厚度为7 μm，保存于-80 ℃冰箱内以备后续实验用。
1.4.2 细胞角蛋白19及葡萄糖转运蛋白1免疫荧光染色将冰冻切片自然晾干后，用1×PBS清洗3次，每次5 min。抗原修复液为10 mmol/L Tris-EDTA(pH 9.0)，修复结束后待其恢复至室温，再次进行清洗。利用体积分数10%山羊血清封闭1 h后，一抗(浓度1∶200)4 ℃过夜孵育。次日，1×PBS清洗切片3次，每次5 min，之后孵育荧光二抗(浓度1∶200) 1 h和DAPI 5 min。孵育结束后进行清洗，并用抗荧光淬灭剂进行封固，自然避光晾干后进行观察与拍照。
1.4.3 Gpc3免疫组化染色冰冻切片在58 ℃烘箱内烘烤1 h以防掉片，晾凉至室温后用1×PBST清洗3次，5 min/次。柠檬酸钠缓冲溶液65 ℃修复3 h，随后滴加3%过氧化氢阻断15 min，清洗后利用中杉金桥试剂盒内的封闭液进行封闭15 min，滴加一抗4 ℃孵育过夜。次日，1×PBST清洗3次，每次5 min，并滴加试剂盒内二抗，室温孵育1 h，孵育结束后1×PBST清洗4次并滴加辣根过氧化物酶标记的工作液，10 min后清洗，DAB显色并用水终止，苏木精复染后梯度脱水后中性树脂封固。
1.5 主要观察指标 ①免疫荧光法检测细胞角蛋白19、葡萄糖转运蛋白1是否为小鼠椎间盘髓核特异性标志物；②免疫组化法检测Gpc3是否为小鼠椎间盘髓核特异性标志物；③细胞角蛋白19、葡萄糖转运蛋白1和Gpc3是否能在髓核细胞存在时稳定表达。
1.6 统计学分析利用ZEN软件观察、拍摄及处理图像；不同组别样品间采用独立样本t检验，且每组样本至少有3次结果重复，结果统计P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

下腰痛在不同程度上影响了全球一半以上的人口[31]，在造成下腰痛的众多因素中，遗传因素、衰老、力学改变或炎症引起的椎间盘退变是其最主要诱因[28，32-35]。目前主要治疗策略集中于减轻疼痛等症状，但这并不会延缓椎间盘退变[14]。因此，深入研究椎间盘退变机制，并由此找到具有预防或推迟椎间盘退变潜力的治疗方法显得尤为迫切。
小鼠动物模型是揭示人类疾病发病机制和检验新疗法的重要工具。近年来，国内外学者利用各种小鼠模型，在椎间盘退变的分子机制方面取得了一系列成果。例如，NAKAMICHI等[30]利用Mohawk(Mkx)基因敲除鼠揭示了Mkx在椎间盘外侧纤维化稳态维持和再生修复中的重要作用；DUDEK等[36]的实验室使用椎间盘特异的Bmal1基因敲除模型，首次发现椎间盘内在生物钟，并揭示其在椎间盘退变中的作用机制；SAKAI等[37]利用小鼠模型发现了髓核组织中存在着Tie2+GD2+髓核前体细胞亚群。与此同时，国内学者在运用小鼠模型研究椎间盘方面也取得了不少进展。例如，空军军医大学西京医院罗卓荆和杨柳团队通过早衰症转基因小鼠模型，揭示了早衰引起椎间盘退变的分子机制[28]；东南大学陆军团队利用过表达和敲除小鼠模型，首次阐明了miR-141通过靶向SIRT1/核因子κB信号轴促进髓核细胞凋亡，从而导致椎间盘退变的机制；并验证了靶向miR-141治疗椎间盘退变的可行性[38]。
上述研究成果极大鼓舞了科研工作人员进一步应用小鼠模型研究椎间盘退变机制的信心。椎间盘退变的病理特征包括软骨终板钙化、纤维环结构紊乱出现裂缝以及髓核细胞的减少和变性等，其中髓核退变被视为促成整个椎间盘退变的关键因素[17]。因而，如何从髓核退变入手研究椎间盘退变发病机制，已成为该领域的一个重大课题。幸运的是，在椎间盘退变过程中，小鼠和人类髓核组织均表现为髓核细胞减少、凋亡增加以及软骨样细胞出现等表型[18-19]，因此，小鼠有望成为研究髓核退变和相关治疗的首选动物模型。然而，目前还缺乏能可靠稳定鉴定小鼠髓核细胞的特异性标志物，这在一定程度上影响了小鼠模型在椎间盘退变尤其是髓核退变机制研究中的进一步应用。为了解决这一问题，此次研究详细分析了细胞角蛋白19、Gpc3和葡萄糖转运蛋白1这3种可在其他种属动物髓核细胞中表达的蛋白分子，在2月龄和12月龄小鼠椎间盘中的表达和分布情况，探讨其作为小鼠髓核特异性标志物的可行性。
细胞角蛋白19属于角蛋白家族，已被证明在牛科动物、大鼠和人类的髓核中均有极高的表达水平[39-41]，但在小鼠髓核中的表达情况还没有系统的研究。此次结果显示，在小鼠2月龄时，细胞角蛋白19仅表达在髓核组织内，而在椎间盘的其他组织包括纤维化和软骨终板内则未观察到任何细胞角蛋白19阳性信号；同样地，在小鼠12月龄时，细胞角蛋白19也特异性的表达在髓核组织处；表明细胞角蛋白19在小鼠椎间盘内可以持续稳定的表达，且可以特异性的表征髓核。
葡萄糖转运蛋白1是一种葡萄糖转运蛋白，参与葡萄糖的转运，且有研究表明葡萄糖转运蛋白1可在免疫细胞内表达[42]。此次研究的葡萄糖转运蛋白1免疫荧光染色结果显示，小鼠2月龄时葡萄糖转运蛋白1可以特异性的表达在髓核组织内，在纤维环和软骨终板内几乎观察不到任何阳性信号；在小鼠12月龄时，葡萄糖转运蛋白1仍可以在髓核内大量表达，且在纤维环内无表达，但在软骨终板钙化处的细胞中，也出现了大量的葡萄糖转运蛋白1阳性信号。软骨终板钙化是椎间盘退变的一种表现，当软骨终板出现钙化时，椎间盘的完整性受到破坏，使得血管更易入侵[43]。另外，软骨终板是椎间盘的营养运输枢纽，软骨终板的钙化会使其渗透能力受到阻碍[44]，这提示葡萄糖转运蛋白1除了可标记髓核组织外，也可在一定程度上反映椎间盘营养物质的转运能力，并且也可解释葡萄糖转运蛋白1在软骨终板钙化处脉管系统中大量表达的现象[45]。虽然葡萄糖转运蛋白1在软骨终板内存在表达，但在2月龄和12月龄的小鼠纤维环中均未检测到其表达，提示着葡萄糖转运蛋白1可以作为区分髓核和纤维环的一种标志物。
Gpc3是一种硫酸肝素糖蛋白，被检测到在多种动物的髓核组织内均有较高的表达水平，但此文的结果显示，Gpc3虽然确实在髓核内有很高的表达，但在其他椎间盘部分也存在表达，这种现象在软骨终板钙化处尤为明显，而这也恰巧是葡萄糖转运蛋白1表达的位置。有研究表明，Gpc3可以显著促进肺癌细胞中葡萄糖代谢的重新编程，且可以通过上调葡萄糖转运蛋白1等糖酵解基因来增强肺癌细胞的糖酵解作用[46]，这提示在小鼠椎间盘内，髓核细胞以及软骨终板细胞可能通过Gpc3和葡萄糖转运蛋白1的相互作用来进行营养物质的循环。但此次研究表明，Gpc3在纤维环和软骨终板中均存在一定程度的表达，并不能作为小鼠髓核特异性的标志物。
综上，此次研究首次系统比较了细胞角蛋白19、葡萄糖转运蛋白1和Gpc3在小鼠髓核细胞中的表达情况，证实细胞角蛋白19可作为年轻及老龄小鼠的髓核特异性标志物。上述发现将有助于推进小鼠模型在椎间盘退变，尤其是髓核退变机制研究中的进一步应用，为评估各种细胞疗法对髓核的恢复情况提供重要鉴定方法。与此同时也必须承认，此次研究还存在着不少缺陷。首先，采用了免疫荧光/组化这单一手段来分析细胞角蛋白19、Gpc3和葡萄糖转运蛋白1在椎间盘中的表达，可能无法精确检测上述蛋白的实际表达情况。后续实验将综合运用定量PCR、Western blot和细胞流式等技术手段，进一步确定上述基因在椎间盘各个组分中的mRNA和蛋白表达水平。其次，尽管在一定程度上明确了细胞角蛋白19，Gpc3和葡萄糖转运蛋白1在椎间盘中的分布情况，但没有对上述蛋白开展功能方面的研究。在这方面，作者计划利用可诱导的Agc1-CreERT2和K19-CreERT2分别在整个椎间盘和髓核细胞中特异性敲除上述基因[47-49]，从而确定其在椎间盘稳态维持和退变发生中的生理和病理作用及机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

小鼠髓核特异性标志物的鉴定和表达分析

Identification and expression analysis of mouse nucleus pulposus specific markers

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