可注射性甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒复合水凝胶支架的制备及生物相容性

doi:10.12307/2022.244

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (16): 2480-2486.doi: 10.12307/2022.244

• 组织工程软骨材料Tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

可注射性甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒复合水凝胶支架的制备及生物相容性

黄波1，陈明学2，彭礼庆1，罗旭江1，李获1，王皓1，田沁玉1，鲁晓波1，刘舒云3，郭全义1，3

1西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000；2北京积水潭医院矫形骨科，北京市 100035；3中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853

收稿日期:2020-09-19 修回日期:2020-09-21 接受日期:2020-11-09 出版日期:2022-06-08 发布日期:2021-10-29
通讯作者: 郭全义，博士，主任医师，教授，西南医科大学附属医院骨与关节外科，四川省泸州市 646000；中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所，骨科再生医学北京市重点实验室，全军骨科战创伤重点实验室，北京市 100853
作者简介:黄波，男，1993年生，四川省资阳市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事软骨组织工程研究
基金资助:
国家重点研发计划课题(2019YFA0110600)，项目负责人：郭全义；国家自然科学基金(81772319)，项目负责人：郭全义

Fabrication and biocompatibility of injectable gelatin-methacryloyl/cartilage-derived matrix particles composite hydrogel scaffold

Huang Bo1, Chen Mingxue2, Peng Liqing1, Luo Xujiang1, Li Huo1, Wang Hao1, Tian Qinyu1, Lu Xiaobo1, Liu Shuyun3, Guo Quanyi1, 3

1Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Department of Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China

Received:2020-09-19 Revised:2020-09-21 Accepted:2020-11-09 Online:2022-06-08 Published:2021-10-29
Contact: Guo Quanyi, MD, Chief physician, Professor, Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Institute of Orthopedics, First Medical Center, Chinese PLA General Hospital, Beijing Key Lab of Regenerative Medicine in Orthopedics, Key Laboratory of Musculoskeletal Trauma & War Injuries, PLA, Beijing 100853, China
About author:Huang Bo, Master candidate, Department of Bone and Joint Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Key Research and Development Plan Project, No. 2019YFA0110600 (to GQY); the National Natural Science Foundation of China, No. 81772319 (to GQY)

摘要/Abstract

摘要： 文题释义：
软骨源性基质微粒：是将新鲜猪关节软骨通过脱细胞、粉碎、过筛等一系列工艺制成的一种天然生物材料，主要成分为Ⅱ型胶原和糖胺多糖，接近天然软骨，它可以支持细胞的附着和增殖，并促进干细胞的软骨分化。
甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶：是采用甲基丙烯酸酐对明胶进行改性得到的一种改性明胶水凝胶，它既含有明胶中的整合素-细胞结合位点和蛋白酶裂解位点，同时含有化学活性取代基可通过紫外照射快速聚合，使其具有良好的可复制性和理化性能可调节的特性，这些特性的结合使其具有良好的生物相容性，并提供了控制水凝胶的机械和生化特性的能力，被视为良好的可注射性材料。

背景：关节软骨的再生修复目前仍是充满挑战的医学难题，构建可仿生细胞生长微环境的可注射水凝胶支架对关节软骨的再生具有重要意义。
目的：制备可注射甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒(gelatin-methacryloyl/cartilage-derived matrix particles，GelMA/CDMPs)复合水凝胶支架，并评价其生物相容性。
方法：①通过物理粉碎和化学酶法制备软骨源性基质微粒，通过甲基丙烯酸酐接枝明胶制备甲基丙烯酸酐改性明胶，并以两者为原料，制备5种不同质量浓度的GelMA/CDMPs复合水凝胶支架(其中软骨源性基质微粒的质量浓度分别为0，5，10，20，30 g/L)，通过力学测试确定力学性能最佳的软骨源性基质微粒质量浓度用于细胞实验；②将兔骨髓间充质干细胞接种至GelMA/CDMPs复合水凝胶支架中，置于成软骨培养基中共培养(实验组)；将兔骨髓间充质干细胞接种至甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶支架中，置于成软骨培养基共培养(对照组)，通过细胞死活染色和CCK-8细胞增殖实验评估两组支架内的细胞活性及细胞增殖能力；通过细胞骨架荧光染色观察支架内细胞的形态和伸展扩散能力；通过组织学染色和糖胺多糖定量评估支架促进细胞分泌软骨基质的能力。

结果与结论：①力学测试表明，GelMA/CDMPs 10 g/L复合水凝胶支架的压缩模量高于其他组(P < 0.05)，后续实验选择该质量浓度；②活死染色显示，两组支架内培养1，5 d的细胞活性均在90%以上；CCK-8细胞增殖实验显示，实验组培养3，5 d的细胞增殖快于对照组(P < 0.05)；③培养7 d的细胞骨架荧光染色显示，对照组的细胞为球形形态，只有少部分细胞形成丝状伪足，实验组的细胞呈伸展的不规则多边形；④培养21 d的组织学与免疫组化染色显示，两组支架内的细胞形态与软骨细胞相似，实验组可见更多的软骨基质分泌；⑤实验组培养7，21 d的糖胺多糖含量高于对照组(P < 0.05)；⑥结果表明，GelMA/CDMPs复合水凝胶支架可更好地模拟软骨细胞生长微环境，进而促进骨髓间充质干细胞的生长、增殖和成软骨分化。

https://orcid.org/0000-0002-6271-9008 (黄波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 软骨, 材料, 组织工程, 软骨源性基质, 水凝胶, 甲基丙烯酸酐改性明胶, 可注射性, 间充质干细胞, 生物相容性

Abstract: BACKGROUND: Articular cartilage regeneration and repair is still a challenging medical problem. The injectable hydrogel scaffold that constructs a biomimetic microenvironment for cell growth is of great significance for the regeneration of articular cartilage.
OBJECTIVE: To prepare injectable gelatin-methacryloyl/cartilage-derived matrix particles (GelMA/CDMPs) composite hydrogel scaffold, and evaluate its biocompatibility.
METHODS: (1) CDMPs were prepared by physical pulverization and chemical enzymatic methods, and GelMA was prepared by the reaction of methacrylic anhydride grafted gelatin. The two were used as raw materials to prepare five different GelMA/CDMP composite hydrogel scaffolds (where the CDMP mass concentrations were 0, 5, 10, 20, and 30 g/L), and the mass concentration of CDMPs with the best mechanical properties was determined through mechanical tests. (2) Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were encapsulated in the GelMA/CDMPs composite hydrogel scaffolds (as the experimental group); bone marrow mesenchymal stem cells were encapsulated in GelMA hydrogel scaffolds (as the control group); both of which were cultured in the chondrogenic medium. The cell viability and cell proliferation of the two groups of stents were evaluated through cell live/dead staining and CCK-8 cell proliferation experiments. The morphology and spreading ability of cells in the scaffolds were observed by cytoskeleton fluorescence staining. The secretion of cartilage matrix of bone marrow mesenchymal stem cells in the scaffolds was evaluated by histological staining and quantitative glycosaminoglycan test.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Mechanical tests showed that compressive modulus of GelMA/CDMPs 10 g/L composite hydrogel scaffolds was significantly higher than that of other groups (P < 0.05). And this concentration was selected for the subsequent experiments. (2) The cell live/dead staining demonstrated that cell viability of bone marrow mesenchymal stem cells in the two groups of scaffolds was above 90% after 1 and 5 days of culture. After 3- and 5-day culture, the cell proliferation of the experimental group was faster than that of the control group (P < 0.05). (3) Fluorescence staining of the cytoskeleton after culture for 7 days showed that the cell morphology in the control group was spherical; and only a small part of the cells formed filopodia. The cell morphology in the experimental group was stretched and showed irregular polygons. (4) After 21 days of culture, histological and immunohistochemical staining showed that the cell morphology of bone marrow mesenchymal stem cells in the two groups of scaffolds was similar to chondrocytes morphology; and more cartilage matrix was secreted by bone marrow mesenchymal stem cells in the experimental group. (5) After 7- and 21-day culture, the content of glycosaminoglycan was significantly higher in the experimental group than that in the control group (P < 0.05). (6) These results suggest that GelMA/CDMPs composite hydrogel scaffold can better mimic the microenvironment of chondrocyte growth, and then promote the growth, proliferation and chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: cartilage, material, tissue engineering, cartilage-derived matrix, hydrogel, GelMA, injectability, mesenchymal stem cell, biocompatibility

中图分类号:

黄波, 陈明学, 彭礼庆, 罗旭江, 李获, 王皓, 田沁玉, 鲁晓波, 刘舒云, 郭全义. 可注射性甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒复合水凝胶支架的制备及生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2480-2486.

Huang Bo, Chen Mingxue, Peng Liqing, Luo Xujiang, Li Huo, Wang Hao, Tian Qinyu, Lu Xiaobo, Liu Shuyun, Guo Quanyi . Fabrication and biocompatibility of injectable gelatin-methacryloyl/cartilage-derived matrix particles composite hydrogel scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(16): 2480-2486.

图/表（结果） 8

2.1 GelMA的合成及表征甲基丙烯酸酐改性明胶的制备方案，见图1A。质子核磁共振谱光谱分析显示，与明胶的光谱图相比，GelMA的光谱在5.4，5.6 ppm处出现新信号，见图1B黑色箭头所指，表明甲基丙烯酸基团与明胶接枝成功。根据文献所述计算方法[28]，计算得实验制备的GelMA中甲基丙烯酰基的取代度约为79%。
2.2 CDMPs的大体观和成分大体观图和体视镜图显示，CDMPs为不规则形状的微米级小颗粒(图1C、D)。DAPI染色显示，脱细胞前的软骨微粒含有大量软骨细胞(图1E)，经脱细胞处理后软骨微粒内未见残留的软骨细胞(图1F)。CDMPs天狼星红染色偏正光为弱折光性，呈黄绿色的疏松网状排布(图1G)，表明Ⅱ型胶原到了很好地保留。CDMPs番红-O染色呈阳性(图1H)，表明其同时也很好地保留了糖胺多糖。

2.3 GelMA/CDMPs复合水凝胶支架的大体观及力学性能不同CDMPs质量浓度浓度的复合水凝胶支架均呈圆柱形的凝胶状，单纯GelMA水凝胶支架为无色透明状，加入CDMPs后GelMA水凝胶的透明度随CDMPs质量浓度的升高逐渐降低，且CDMPs均匀分布于其中，见图2A-D。支架力学结果显示，复合水凝胶支架的压缩模量随着CDMPs质量浓度的增加而升高，但当CDMPs的质量浓度超过10 g/L后开始下降，其中 10 g/L复合水凝胶支架的压缩模量显著高于其他复合水凝胶支架(P < 0.05)；此外，5 g/L复合水凝胶支架的压缩模高于0 g/L复合水凝胶支架(P < 0.05)，20，30 g/L复合水凝胶支架与0 g/L复合水凝胶支架的压缩模量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2E。为实现在复合支架力学性能最佳的条件下使CDMPs对支架内细胞发挥最大的生物学作用，因此选择CDMPs质量浓度为10 g/L的GelMA/CDMPs复合水凝胶支架进行后续实验(图2F)，作为实验组。

2.4 GelMA/CDMPs复合水凝胶的溶胀性能两组水凝胶的动态溶胀曲线如图3所示，两组干凝胶均在初始4 h内快速吸水溶胀增重，然后溶胀速度减缓，直到10 h后达到溶胀平衡。达到溶胀平衡后，GelMA/CDMPs复合水凝胶的平衡溶胀比低于GelMA水凝胶支架(6.58±0.19，7.54±0.23，P < 0.05)。

2.5 两组支架内的细胞死活染色结果共聚焦显微镜下显示，培养1 d后，两组支架内部均可见大量存活的骨髓间充质干细胞，形态均呈圆形形状，见图4A、B。培养5 d后，两组支架内均未观察到死亡细胞，可见大量增殖的活性较高的骨髓间充质干细胞，对照组中大部分细胞仍是圆形形状(图4C)，实验组中大部分的细胞呈树突状伸展(图4D)。第3代骨髓间充质干细胞在培养瓶中贴壁生长呈梭形形态，见图4E。通过计算得到在培养1，5 d时两组支架内的细胞存活率，两组支架内的细胞存活率均大于90%(图4F)，且两组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，表明实验组的CDMPs对骨髓间充质干细胞存活率无显著影响。

2.6 两组支架内的细胞增殖评估 CCK-8实验结果显示，随着培养时间的延长，两组支架内的骨髓间充质干细胞的增殖能力均逐渐增强，实验组第3，5天的吸光度值均高于对照组(P < 0.05)，见图5，表明GelMA/CDMPs复合水凝胶支架具有良好的生物相容性和生物活性，CDMPs对复合水凝胶支架内骨髓间充质干细胞的生长、增殖具有良好的促进作用。

2.7 两组支架内的细胞骨架染色鬼笔环肽染色后共聚焦显微镜下可见，对照组内骨髓间充质干细胞的形态仍是类似于悬浮细胞的球形形态，只有少部分细胞形成丝状伪足，见图6A；实验组内大部分的骨髓间充质干细胞明显伸展呈现出各向异性和多边形形态，见图6B，表明实验组中的CDMPs能增强骨髓间充质干细胞在复合水凝胶支架内的伸展或扩散。

2.8 两组细胞-支架复合体组织学染色结果图7为两组培养21 d后的组织学染色结果，苏木精-伊红、番红-O、阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色显示，两组的骨髓间充质干细胞周围均可见分泌的软骨基质，但实验组的软骨基质染色强度明显强于对照组，表明实验组提供的生长环境更利于骨髓间充质干细胞的软骨分化，产生更多的糖胺多糖和Ⅱ型胶原。

2.9 两组细胞-支架复合体糖胺多糖含量测定结果随着培养时间的延长，两组支架沉积的糖胺多糖含量均增加，提示随着时间的延长，两组支架中骨髓间充质干细胞分泌的软骨细胞外基质成分越来越多。实验组不同时间点的糖胺多糖含量显著高于对照组(P < 0.05)，见图8，说明实验组内骨髓间充质干细胞成软骨分化强于对照组，从而合成更多的软骨细胞外基质成分。

参考文献

[1] MADEIRA C, SANTHAGUNAM A, SALGUEIRO JB, et al. Advanced cell therapies for articular cartilage regeneration. Trends Biotechnol. 2015;33(1): 35-42.
[2] MAKRIS EA, GOMOLL AH, MALIZOS KN, et al. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 2015;11(1):21-34.
[3] 刘奕,谢林.组织工程技术修复损伤关节软骨的研究与应用[J].中国组织工程研究,2013,17(41):7310-7316.
[4] CAI L, DEWI RE, HEILSHORN SC. Injectable Hydrogels with In Situ Double Network Formation Enhance Retention of Transplanted Stem Cells. Adv Funct Mater. 2015;25(9):1344-1351.
[5] LI J, CHEN G, XU X, et al. Advances of injectable hydrogel-based scaffolds for cartilage regeneration. Regen Biomater. 2019;6(3):129-140.
[6] VEGA SL, KWON MY, BURDICK JA. Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering. Eur Cell Mater. 2017;33:59-75.
[7] PUPKAITE J, ROSENQUIST J, HILBORN J, et al. Injectable Shape-Holding Collagen Hydrogel for Cell Encapsulation and Delivery Cross-linked Using Thiol-Michael Addition Click Reaction. Biomacromolecules. 2019;20(9): 3475-3484.
[8] YING G, JIANG N, PARRA-CANTU C, et al. Bioprinted Injectable Hierarchically Porous Gelatin Methacryloyl Hydrogel Constructs with Shape-Memory Properties. Adv Funct Mater. 2020;30(46):2003740.
[9] SUN M, SUN X, WANG Z, et al. Synthesis and Properties of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels and Their Recent Applications in Load-Bearing Tissue. Polymers (Basel). 2018;10(11):1290.
[10] SPILLER KL, MAHER SA, LOWMAN AM. Hydrogels for the repair of articular cartilage defects. Tissue Eng Part B Rev. 2011;17(4):281-299.
[11] NICHOL JW, KOSHY ST, BAE H, et al. Cell-laden microengineered gelatin methacrylate hydrogels. Biomaterials. 2010;31(21):5536-5544.
[12] WANG Y, MA M, WANG J, et al. Development of a Photo-Crosslinking, Biodegradable GelMA/PEGDA Hydrogel for Guided Bone Regeneration Materials. Materials (Basel, Switzerland). 2018;11(8):1345.
[13] SHIN SR, BAE H, CHA JM, et al. Carbon nanotube reinforced hybrid microgels as scaffold materials for cell encapsulation. ACS Nano. 2012;6(1):362-372.
[14] SHIN H, OLSEN BD, KHADEMHOSSEINI A. The mechanical properties and cytotoxicity of cell-laden double-network hydrogels based on photocrosslinkable gelatin and gellan gum biomacromolecules. Biomaterials. 2012;33(11):3143-3152.
[15] ZHU W, CUI H, BOUALAM B, et al. 3D bioprinting mesenchymal stem cell-laden construct with core-shell nanospheres for cartilage tissue engineering. Nanotechnology. 2018;29(18):185101.
[16] SHIN SR, ZIHLMANN C, AKBARI M, et al. Reduced Graphene Oxide-GelMA Hybrid Hydrogels as Scaffolds for Cardiac Tissue Engineering. Small. 2016; 12(27):3677-3689.
[17] NAVAEI A, SAINI H, CHRISTENSON W, et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomater. 2016;41:133-146.
[18] 肖统光,张一民,郭维民,等.细胞外基质来源支架在软骨组织工程中的应用[J].中国组织工程研究,2016,20(38):5737-5744.
[19] YIN H, WANG Y, SUN X, et al. Functional tissue-engineered microtissue derived from cartilage extracellular matrix for articular cartilage regeneration. Acta Biomater. 2018;77:127-141.
[20] YIN H, WANG Y, SUN Z, et al. Induction of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and functional cartilage microtissue formation for in vivo cartilage regeneration by cartilage extracellular matrix-derived particles. Acta Biomater. 2016;33:96-109.
[21] ALMEIDA HV, ESWARAMOORTHY R, CUNNIFFE GM, et al. Fibrin hydrogels functionalized with cartilage extracellular matrix and incorporating freshly isolated stromal cells as an injectable for cartilage regeneration. Acta Biomater. 2016;36:55-62.
[22] CHANG CH, CHEN CC, LIAO CH, et al. Human acellular cartilage matrix powders as a biological scaffold for cartilage tissue engineering with synovium-derived mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 2014; 102(7):2248-2257.
[23] SUTHERLAND AJ, DETAMORE MS. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromol Biosci. 2015;15(7):979-989.
[24] ABRAMS GD, MALL NA, FORTIER LA, et al. BioCartilage: Background and Operative Technique. Oper Tech Sports Med. 2013;21(2):116-124.
[25] LOESSNER D, MEINERT C, KAEMMERER E, et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nat Protoc. 2016;11(4):727-746.
[26] 杨俊丽,韩霞,孙明启,等.兔骨髓间充质干细胞的生物学特征及原代培养[J].中国组织工程研究,2015,19(50):8043-8047.
[27] ROTHRAUFF BB, SHIMOMURA K, GOTTARDI R, et al. Anatomical region-dependent enhancement of 3-dimensional chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by soluble meniscus extracellular matrix. Acta Biomater. 2017;49:140-151.
[28] KILIC BEKTAS C, HASIRCI V. Mimicking corneal stroma using keratocyte-loaded photopolymerizable methacrylated gelatin hydrogels. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(4):e1899-e1910.
[29] PEPELANOVA I, KRUPPA K, SCHEPER T, et al. Gelatin-Methacryloyl (GelMA) Hydrogels with Defined Degree of Functionalization as a Versatile Toolkit for 3D Cell Culture and Extrusion Bioprinting. Bioengineering (Basel, Switzerland). 2018;5(3):55.
[30] YUE K, TRUJILLO-DE SANTIAGO G, ALVAREZ MM, et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 2015;73:254-271.
[31] VISSER J, GAWLITTA D, BENDERS KE, et al. Endochondral bone formation in gelatin methacrylamide hydrogel with embedded cartilage-derived matrix particles. Biomaterials. 2015;37:174-182.
[32] GU L, LI T, SONG X, et al. Preparation and characterization of methacrylated gelatin/bacterial cellulose composite hydrogels for cartilage tissue engineering. Regen Biomater. 2020;7(2):195-202.
[33] FRANTZ C, STEWART KM, WEAVER VM. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 2010;123(Pt 24):4195-4200.
[34] FERNANDES H, MORONI L, VAN BLITTERSWIJK C, et al. Extracellular matrix and tissue engineering applications. J Mater Chem. 2009;19(31):5474-5484.
[35] LIU Y, CHAN-PARK MB. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 2010;31(6):1158-1170.

引言

关节软骨缺乏神经、血管，一旦损伤难以自我修复，进而导致关节退变，最终导致骨关节炎[1]。传统的治疗方式如微骨折术、马赛克移植等效果非常有限，常形成质量比天然关节软骨差的纤维组织，远期临床效果不理想[2]。组织工程技术的发展为软骨再生提供了新的方向和治疗策略[3]，而支架材料的选择仍是软骨组织工程面临的巨大挑战。可注射水凝胶支架将治疗细胞直接注射到体内损伤组织的缺损部位进行创伤修复和组织再生，显示出良好的组织再生潜力[4-5]。由于水凝胶的高含水量和与天然关节软骨基质相似的结构，为细胞和组织生长提供了适宜的环境及支撑[6-7]；此外，将充满细胞的水凝胶前驱液注射到体内缺损处，能够根据缺损的大小、形状形成契合的水凝胶填充支架，避免了直接注射治疗细胞到缺损部位导致的细胞流失[8]。甲基丙烯酸酐改性明胶(gelatin-methacryloyl，GelMA)是由明胶通过化学修饰制备的一种半合成生物材料[9]，其结合了明胶的生物活性和理化性能可调节性，已成为生物材料的研究热点。加入引发剂的GelMA溶液在紫外光照射下立即交联，形成的水凝胶具有良好的生物力学、溶胀和润滑性能，与天然软骨相似[10]。
同时，GelMA水凝胶保留了明胶中的RGD和MMP活性肽段[11]，能支持细胞的生长，具有良好的生物相容性。因此，GelMA水凝胶被广泛用于再生医学，其作为组织工程支架已被用于多种组织修复研究，如骨[12-13]、软骨[14-15]、心脏组织等[16-17]。然而，GelMA水凝胶作为一种通用性的水凝胶支架材料缺乏与关节软骨相关的化学和生物学信号，单纯GelMA水凝胶不能维持其内部软骨细胞或干细胞的形态和软骨表型，因此需要进一步功能化修饰，以优化其在软骨修复治疗中的效用。
软骨源性基质是一种由软骨脱细胞得到的天然生物材料，常作为支架移植物用于组织工程软骨再生，并取得了良好的软骨修复效果[18]。作者所在团队前期研究发现，将软骨源性基质微粒(cartilage-derived matrix particles，CDMPs)作为负载细胞的微载体能促进骨髓间充质干细胞的增殖和软骨分化[19-20]。此外，CDMPs还被用于功能化其他生物材料以增强软骨形成[21-23]，例如：将CDMPs与纤维蛋白胶结合开发出了用于修复局部软骨缺损的可注射水凝胶支架产品[24]。因此，这种用CDMPs功能化的水凝胶支架能为治疗细胞提供利于其增殖和软骨分化的微环境，可能是一种有前景的新型软骨组织工程支架。实验的目的是采用CDMPs功能化GelMA水凝胶构建模拟软骨细胞外基质微环境的新型可注射水凝胶支架，并探究其作为软骨组织工程支架的可行性，为此制备了不同CDMPs质量浓度的GelMA/CDMPs复合水凝胶支架，并通过力学性能测试确定力学性能最佳的复合水凝胶支架，随后将兔骨髓间充质干细胞接种至该复合水凝胶支架内，进行细胞相容性和生物学性能评估。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年9月在中国人民解放军总医院第一医学中心骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 2月龄新西兰大白兔4只，雌雄不拘，体质量约1.5 kg，均购自中国人民解放军总医院实验动物中心，许可证号：SYXK(京)2019-0015。实验方案经中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 实验主要试剂 A型明胶、甲基丙烯酸酐、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、氘水(Sigma公司，美国)；光引发剂 Irgacure 2959(BASF公司，德国)；DMEM细胞培养液、胎牛血清(Gibco公司，美国)；成软骨诱导分化培养基试剂盒(苏州赛业生物公司)；DAPI染液(Molecular Probes公司，美国)；细胞死活荧光染色试剂(Biovision公司，美国)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)；罗丹明鬼比环肽(Cytoskeleton公司，美国)；苏木精-伊红染色、番红-O及阿利新蓝染色所用染色剂(北京索莱宝科技有限公司)；小鼠抗兔Ⅱ型胶原一抗、二抗(abcam公司，美国)；糖胺多糖含量测定试剂盒(Invitrogen公司，美国)。
1.3.3 实验用主要仪器组织粉碎机DJ13B-C669SG(济南九阳公司，中国)；100 μm和300 μm实验筛(VWR公司，美国)；Beckman Allegra X-22R离心机(Beckman公司，美国)；冻干机(北京博医康技术有限公司)；体视显微镜SMZ25(Nikon公司，日本)；透析袋(截留分子质量12-14 kD，美国)；核磁共振波谱仪Bruker Avance III HD(Bruker公司，德国)；紫外线UV固化仪(北京五环通达公司)；instron 5969力学分析仪(美国 instron公司)；TCS SP8共聚焦显微镜(德国Leica公司)；EPOCH TAKE 3酶标仪(Bio Tek公司，美国)；IX 70型显微镜
(日本Olympus公司)；CO2 培养箱(Heraeus 公司，德国)。
1.4 实验方法
1.4.1 构建可注射性GelMA/CDMPs复合水凝胶支架
GelMA的制备：GelMA的制备参考之前报道中的方法[25]，具体步骤如下：将A型猪皮明胶以100 g/L的质量浓度溶解于PBS中，50 ℃下搅拌至明胶完全溶解，缓慢加入甲基丙烯酸酐使其加入量为所溶解明胶质量的0.6倍，50 ℃下持续搅拌2 h，4倍体积的超纯水稀释后转移至透析袋中，在40 ℃超纯水中透析，每天换2次水。透析1周后将透析袋中溶液冻干制得GelMA大分子固体，-20 ℃保存备用。通过质子核磁共振谱(1H NMR)表征了GelMA的分子结构，并计算GelMA中甲基丙烯酰基的取代度。
CDMPs的制备：于本地屠宰场购置新鲜的猪关节软骨，进行湿法粉碎、脱细胞、清洗、过筛等处理，成功制备得CDMPs。具体而言，在无菌环境下打开新鲜的猪膝关节腔，用刀片小心将膝关节软骨取出，置于无菌PBS中，随后将关节软骨放入组织粉碎机中粉碎得到软骨小颗粒，以增加其对下列化学处理的接触。将软骨颗粒浸没于1%SDS溶液中，置于恒温摇床中4 ℃下振荡8 h，加入50 U/mL DNA酶和1 U/mL
RNA酶37 ℃处理4 h，以去除残留的细胞核碎片。用大量PBS冲洗去残留化学试剂，将含有软骨颗粒的PBS悬浮液冻干过夜，然后在再次放入组织粉碎机中粉碎，分别过筛孔为300，100 µm的不锈钢筛，得到直径为100-300 µm的软骨微粒。60Co γ射线(6 kGy)照射灭菌，4 ℃下保存备用。体视显微镜观察CDMPs的大体观，DAPI染色观察CDMPs的细胞残留情况，番红-O、天狼星红染色评估CDMPs的主要成分。
构建可注射性复合水凝胶支架：将GelMA/CDMPs复合水凝胶支架以Irgacure 2959为光引发剂通过紫外照射引发光聚合至凝。简言之，将冻干后的GelMA以100 g/L的质量浓度溶于PBS中，70 ℃水浴至完全溶解，加入光引发剂Irgacure
2959(其最终质量浓度为0.5 g/L)，得到GelMA水凝胶前驱液，经过滤除菌后加入CDMPs得到含不同CDMPs质量浓度的复合水凝胶前驱液(CDMPs质量浓度分别为0，5，10，20，30 g/L)，
混匀后注入圆柱形磨具中(直径5 mm，高2 mm)，紫外光(365 nm，5 W)交联2 min，形成含不同CDMPs质量浓度的GelMA/CDMPs复合水凝胶支架。
1.4.2 复合水凝胶支架的表征
力学性能测定：测定圆柱形复合水凝胶支架的高度和直径后，将复合水凝胶支架样本(n=3)固定于Instron 5969力学分析仪的载物台上，开始记录之前在测试样本预加载一个
0.06 N的力，然后以2 mm/min的速率下压直到支架破裂。在压缩过程中记录位移和施加的力，根据样品的初始大小转换为应力和应变，绘制应力应变曲线，在10%-20%的应变区间计算各样本的压缩模量。通过力学测试筛选最佳的CDMPs质量浓度用于以下实验。
溶胀性能测试：将复合水凝胶支架与单纯GelMA水凝胶支架冷冻干燥后称质量，记录干水凝胶的原始质量m0，然后将干水凝胶支架置于37 ℃的PBS中，在预定的时间点(1，2，4，6，10，24 h)取样，用滤纸擦试水凝胶表面的水分后，再次记录水凝胶的质量mt。每组3个重复样。水凝胶的质量溶胀比计算公式：λ=(mt-m0)∕m0。
1.4.3 骨髓间充质干细胞接种至支架
骨髓间充质干细胞的原代培养：无菌条件下抽取2月龄新西兰大白兔髂骨骨髓血，采用Percoll密度梯度离心法结合贴壁法获取骨髓间充质干细胞[26]，取第3代骨髓间充质干细胞进行实验。
细胞接种至支架和三维培养：将第3代骨髓间充质干细胞经胰酶消化、离心后，以1×109 L-1的细胞浓度分别重悬于GelMA水凝胶前驱液和GelMA/CDMPs复合水凝胶前驱液中，紫外照射凝胶后转移至12孔板内，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，置于细胞培养箱中培养，每隔2 d换一次液，用于细胞死活染色和增殖检测。将第3代骨髓间充质干细胞以15×109 L-1的细胞浓度分别重悬于两组水凝胶前驱液中，紫外照射凝胶后置于成软骨诱导培养基中培养，用于体外构建组织工程软骨实验。GelMA/CDMPs复合水凝胶支架作为实验组，单纯GelMA水凝胶支架为对照组。
1.4.4 死活染色骨髓间充质干细胞接种至两组支架中培养1，5 d后进行死活染色，观察支架内细胞的活性和数量。将样本置于死活染液中浸染20 min，PBS漂洗3次后置于共聚焦显微镜下观察，活细胞显示为绿色荧光，死细胞显示为红色荧光。
1.4.5 CCK-8细胞增殖实验骨髓间充质干细胞接种至两组支架中培养1，3，5 d后，加入CCK-8试剂与培养基以1∶9比例配制的工作液0.5 mL，37 ℃下孵育2 h，取100 μL移入96孔板中，在450 nm测定吸光度(A值)。每组有5个平行样本。
1.4.6 细胞骨架染色骨髓间充质干细胞接种至两组支架培养7 d后，利用鬼笔环肽-DAPI分别染细胞骨架和细胞核，观察两组细胞形态和空间伸展情况。具体方法如下：将两组支架样本置于40 g/L多聚甲醛中固定10 min；PBS洗3次，置于1%TritonX-100细胞破膜剂中5 min；PBS洗3次，置于
100 nmol/L鬼笔环肽工作液中避光浸染30 min；PBS洗3次，置于100 nmol/L的DAPI染液中浸染30 min；PBS漂洗后置于共聚焦显微镜下观察，蓝色为细胞核，红色为细胞骨架微丝。
1.4.7 组织学和免疫组织化学染色骨髓间充质干细胞接种至支架21 d后进行组织学和免疫组织化学染色，观察支架内骨髓间充质干细胞的软骨基质分泌情况。将样本置于100 g/L
多聚甲醛中固定24 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，将样本切成6 μm，苏木精-伊红染色观察细胞形态，番红-O和阿利新蓝染色用于确定是否存在糖胺多糖，Ⅱ型胶原免疫组化染色方法根据之前的报道进行[27]。
1.4.8 糖胺多糖含量测定骨髓间充质干细胞接种至支架培养0，7，21 d后，各时间点分别取3个平行样本，剪碎后加入500 μL木瓜蛋白酶裂解液，60 ℃下消化过夜，使用二甲基亚甲蓝法测定样本的糖胺多糖含量，具体实验步骤依据糖胺多糖总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒说明书进行。支架中骨髓间充质干细胞分泌糖胺多糖的含量为培养7，21 d后的糖胺多糖含量减去培养0 d的糖胺多糖初始含量。
1.5 主要观察指标 GelMA/CDMPs复合水凝胶支架的生物相容性。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。数据以x±s表示。组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验；检验水准α=0.05。

讨论

可注射性水凝胶支架可直接将治疗细胞或生物活性分子注射至体内损伤组织的缺损处，在原位填充形成支架，具有微创、手术操作简便等优点，成为研究的热点[5]。理想的软骨组织工程支架应具有仿生软骨细胞外基质的三维结构和微环境，支持治疗细胞生长和新生软骨基质的合成，并具有一定的生物力学性能。GelMA水凝胶是一种半合成改性明胶水凝胶，被广泛应用于三维细胞培养和生物打印[29]，具有良好的生物相容性，同时理化性质可调控，可塑性强，是一种理想的可注射水凝胶材料[9，30]。前期研究发现，CDMPs能支持骨髓间充质干细胞的附着和增殖，促进其成软骨分化[20]，为此提出利用具有软骨诱导活性的CDMPs功能化GelMA水凝胶作为组织工程软骨支架材料的设想，试图更好地模拟软骨细胞生长的天然微环境，利于维持间充质干细胞的活性，同时促进间充质干细胞成软骨分化进而形成新生软骨。
GelMA和CDMPs两种材料的特性表征结果显示成功制备了取代度较高的GelMA(约79%)和保留了软骨基质成分(Ⅱ胶原和糖胺多糖)的软骨源性微粒。有研究表明，较高的取代度GelMA可减少紫外光照射量和光引发剂的用量，使GelMA水凝胶支架具有更好的细胞相容性[29]，这可能是单纯GelMA水凝胶支架中骨髓间充质干细胞存活率> 90%的原因。然后联合这两种材料制备了不同质量浓度的复合水凝胶支架，力学测试结果显示，CDMPs质量浓度为5-10 g/L的复合水凝胶支架压缩模量显著增加，但CDMPs的质量浓度超过10 g/L后复合水凝胶支架的压缩模量逐渐降低，这可能是由于CDMPs颗粒尺寸较大，过多的CDMPs阻碍GelMA水凝胶中聚合链的有效聚合所致。之前有研究发现，加入微米级颗粒的质量浓度大于15 g/L后水凝胶支架的压缩模量不再增加[31]，然而当加入纳米级颗粒后GelMA水凝胶支架的压缩模量随着颗粒的浓度升高而升高[32]。溶胀测试结果显示，加入CDMPs后对GelMA水凝胶的溶胀性能影响不大，这可能是由于复合水凝胶中CDMPs的含量较低。
随后作者将骨髓间充质干细胞接种至两种水凝胶支架内，并对骨髓间充质干细胞的活性、形态及生物学性能进行检测。细胞死活染色显示，随着培养时间延长，骨髓间充质干细胞在两组水凝胶支架内均保持较高的增殖活性，而且细胞在实验组中具有更高的活性，提示两组支架均具有较好的细胞相容性，这可能与两种材料均来源于天然生物材料相关。细胞骨架染色显示，实验组细胞的伸展和扩散明显高于对照组，提示CDMPs促进了细胞与复合水凝胶支架的结合，这可能与CDMPs中保留的胶原有关。研究发现，细胞外基质中胶原形成的纤维微丝结构可为细胞提供丰富的锚定位点或其他的细胞受体蛋白，以调节复杂的内在信号转导[33-34]。对照组中也有少量细胞出现局部伸展，这可能与GelMA水凝胶聚合链上存在细胞黏附序列RGD有关。大量研究显示，GelMA保留了明胶分子链上的RGD细胞黏附序列，因此GelMA具有一定的细胞黏附性能[11，35]。众所周知，增强细胞在支架三维空间中的伸展、扩散和与邻近细胞连接的能力，对新生的工程组织重塑为原生组织至关重要。CCK-8细胞增殖实验结果也证实了复合水凝胶支架能促进细胞的增殖，尤其在培养3，5 d后更为显著，这可能与复合支架中的CDMPs有关。前期实验发现CDMPs中含胶原和糖胺多糖等多种活性成分，能有效促进骨髓间充质干细胞的增殖[20]。组织学染色和糖胺多糖定量结果表明，两组支架在软骨诱导培养条件下均能促进骨髓间充质干细胞的软骨分化及分泌胶原和糖胺多糖，而实验组明显高于对照组，这说明复合支架提供了更有利于骨髓间充质干细胞软骨分化、分泌软骨基质的微环境。
综上所述，GelMA/CDMPs复合水凝胶支架具有如下优点：良好的生物相容性和仿生软骨微环境，其中GelMA水凝胶提供了仿生软骨细胞外基质的结构，以天然软骨源性基质微粒作为软骨诱导活性成分，模拟软骨细胞生存的微环境；骨髓间充质干细胞在复合水凝胶支架内能保持更高的活性、更强的伸展能力及更好的成软骨分化能力，进而合成更多的软骨基质成分。因此，GelMA/CDMPs复合水凝胶可作为一种良好的可注射性支架在软骨组织工程方面具有很好的应用潜力。下一步实验将继续完善该支架材料的免疫原性评估及评价体内修复动物软骨缺损的效果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

可注射性甲基丙烯酸酐改性明胶/软骨源性基质微粒复合水凝胶支架的制备及生物相容性

Fabrication and biocompatibility of injectable gelatin-methacryloyl/cartilage-derived matrix particles composite hydrogel scaffold

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[2]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[3]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[4]	李志一, 贺鹏程, 边天月, 肖玉霞, 高璐, 刘华胜. 铁死亡机制研究的文献计量学与可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1202-1209.
[5]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[6]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[7]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[8]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[9]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.
[10]	郭嘉, 丁琼桦, 刘泽, 吕思懿, 周泉程, 高玉花, 白春雨. 间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1093-1101.
[11]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[12]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.