高糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子

doi:10.12307/2022.016

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (1): 96-100.doi: 10.12307/2022.016

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

高糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子

胥雪玲1 ，刘军1 ，杨爱华2，王惠芳1 ，郭丹丹1 ，刘雪梅1 ，徐岩1

青岛大学附属医院，1肾病科，2检验科，山东省青岛市 266003

收稿日期:2020-09-07 修回日期:2020-09-08 接受日期:2020-10-24 出版日期:2022-01-08 发布日期:2021-10-25
通讯作者: 刘雪梅，博士，主任医师，青岛大学附属医院肾病科，山东省青岛市 266003
作者简介:胥雪玲，女，1994年生，湖北省襄阳市人，汉族，青岛大学在读硕士，主要从事慢性肾脏病研究。
基金资助:
青岛市民生科技计划项目(19-6-1-18-nsh)，项目负责人：刘雪梅；青岛大学医学部“临床医学+X”工程科研项目(2018-21)，项目负责人：刘雪梅

High glucose induces high expression of stem cell factor in human renal tubular epithelial cells

Xu Xueling1, Liu Jun1, Yang Aihua2, Wang Huifang1, Guo Dandan1, Liu Xuemei1, Xu Yan1

1Department of Nephrology, 2Laboratory Medicine, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Received:2020-09-07 Revised:2020-09-08 Accepted:2020-10-24 Online:2022-01-08 Published:2021-10-25
Contact: Liu Xuemei, MD, Chief physician, Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Xu Xueling, Master candidate, Department of Nephrology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
Supported by:
Project of Science and Technology of Qingdao People’s Livelihood, No. 19-6-1-18- nsh (to LXM); the Scientific Research Project “Clinical Medicine+X” of Medical Department of Qingdao University, No. 2018-21 (to LXM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
肾小管上皮细胞(HK-2细胞)：是肾小管间质最活跃的细胞之一，在肾脏的生理功能和组织结构方面发挥重要作用，当肾脏受到炎症、缺氧、中毒等损伤因素作用后，肾小管发生一系列变化，包括肾小管上皮细胞活化、增生，进而肾小管出现扩张，最终可导致肾小管出现萎缩、凋亡和纤维化等变化。
干细胞因子：又称肥大细胞生长因子，是1990年来发现的一种重要的造血生长因子，主要由骨髓基质细胞产生。干细胞因子与肥大细胞的c-kit受体结合，可发挥调节肥大细胞增殖、分化、成熟和活化的作用。研究发现，干细胞因子/c-kit信号通路促进肥大细胞在糖尿病肾脏疾病肾间质中募集及活化，从而促进糖尿病肾脏疾病肾间质纤维化，并与肥大细胞的分布密度及肾间质纤维化呈显著正相关。

背景：糖尿病肾脏疾病是糖尿病最严重和最常见的慢性并发症之一，已经成为导致终末期肾衰竭的重要原因，但其确切的发生发展机制目前尚不清楚，也缺乏精准有效的防治措施。
目的：探讨高渗葡萄糖对人肾小管上皮细胞表型变化及干细胞因子表达的影响。
方法：体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)，分为正常糖组、高糖刺激组、甘露醇对照组，分别于0，12，24，48 h时间点收集各组细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，采用实时定量PCR和Western blot检测干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白mRNA及蛋白的表达。
结果与结论：①与正常糖组相比，高糖刺激组肾小管上皮细胞形态发生明显改变，但甘露醇对照组细胞形态与正常生长的肾小管上皮细胞相比无明显改变；②高糖刺激组肾小管上皮细胞中干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白mRNA及蛋白表达明显高于正常糖组，且呈时间依赖性增加；③肾小管上皮细胞中干细胞因子mRNA及蛋白的表达量与α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达量呈正相关关系；④结果表明，高渗葡萄糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子，并呈时间依赖性；同时高糖刺激肾小管上皮细胞高表达α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白，说明高糖刺激肾小管上皮细胞转分化并产生大量细胞外基质，促进肾间质纤维化。
https://orcid.org/0000-0002-2134-4879(胥雪玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 肾小管上皮细胞, 干细胞因子, 细胞外基质, 肾间质纤维化, 糖尿病肾脏疾病, 高糖

Abstract: BACKGROUND: Diabetic kidney disease is one of the most serious and common chronic complications of diabetes. It has become an important cause of end-stage renal failure. However, the exact mechanism of its occurrence and development is still unclear, and precise and effective prevention and treatment measures are lacking.
OBJECTIVE: To investigate the effect of hypertonic glucose on the phenotype changes of human renal tubular epithelial cells and the expression of stem cell factor.
METHODS: Human renal tubular epithelial cells were cultured in vitro and divided into normal glucose group, high glucose stimulation group, and mannitol control group. The cells of each group were separately collected at 0, 12, 24 and 48 hours for detection. The cell morphology was observed under an inverted microscope. Real-time quantitative PCR and western blot assay were used to detect the expression of mRNA and protein of stem cell factor, α-smooth muscle actin, type I collagen, and fibronectin.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the normal glucose group, the renal tubular epithelial cell morphology of the high glucose stimulation group changed significantly, but the cell morphology of the mannitol control group did not change significantly compared with renal tubular epithelial cells that grow normally. (2) The expression levels of mRNAs and proteins of stem cell factor, α-smooth muscle actin, type I collagen, and fibronectin of renal tubular epithelial cells in high glucose stimulation group were significantly higher than those of the normal glucose group, and increased in a time-dependent manner. (3) The expression levels of stem cell factor mRNA and protein in renal tubular epithelial cells were positively correlated with α-smooth muscle actin, type I collagen, and fibronectin. (4) These findings indicate that hypertonic glucose can up-regulate the expression of stem cell factor in renal tubular epithelial cells in a time-dependent way, meanwhile up-regulating the expression of α-smooth muscle actin, type I collagen and fibronectin, indicating that hypertonic glucose stimulates the transdifferentiation of renal tubular epithelial cells and the production of a large number of extracellular matrix, which promotes renal interstitial fibrosis.

Key words: renal tubular epithelial cell, stem cell factor, extracellular matrix, renal interstitial fibrosis, diabetic kidney disease, high glucose

中图分类号:

胥雪玲, 刘军, 杨爱华, 王惠芳, 郭丹丹, 刘雪梅, 徐岩. 高糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(1): 96-100.

Xu Xueling, Liu Jun, Yang Aihua, Wang Huifang, Guo Dandan, Liu Xuemei, Xu Yan. High glucose induces high expression of stem cell factor in human renal tubular epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(1): 96-100.

图/表（结果） 7

2.1 高糖对肾小管上皮细胞形态的影响培养24 h后，光镜下观察正常糖组和甘露醇对照组细胞呈铺路石样生长、排列规则、细胞边缘整齐、胞核清晰，而高糖刺激组细胞逐渐变大变长，呈长梭形改变，排列紊乱，见图1；与正常糖组比较，随着培养时间延长，高糖刺激组肾小管上皮细胞形态由铺路石样逐渐向梭形改变，见图2。

2.2 高糖刺激不同时间肾小管上皮细胞中干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白 mRNA及蛋白的表达实时定量PCR结果显示，随着高糖作用于肾小管上皮细胞时间逐渐延长，干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达呈逐渐上升趋势，在12 h明显高于0 h，在24 h达高峰，48 h较24 h未再继续增加。与对照组(0 h)比较，作用12，24，48 h时干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白 mRNA表达量明显增高，差异均有显著性意义(P < 0.01)，即高糖刺激后干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白 mRNA表达呈时间依赖性增加，见图3。Western blot结果显示，与高糖刺激0 h相比，12 h时干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白表达明显增加；24 h时表达量显著增加并达高峰，48 h与24 h比较，各因子表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)，即高糖刺激后，干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白表达呈时间依赖性增加，见图4。

2.3 不同处理组之间肾小管上皮细胞中干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白 mRNA及蛋白的表达实时定量PCR结果显示，培养24 h后，与正常糖组及甘露醇对照组相比，高糖刺激组肾小管上皮细胞中干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白 mRNA表达均明显上调；甘露醇对照组与正常糖组之间差异无显著性意义
(P > 0.05)，见图5。Western blot检测结果显示，培养24 h后，正常糖组干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白表达较少。与正常糖组及甘露醇对照组相比，高糖刺激可以显著增加干细胞因子、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白表达(P < 0.01)；正常糖组与甘露醇对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。

2.4 干细胞因子 mRNA和蛋白表达与其他指标的相关性高糖刺激组肾小管上皮细胞中干细胞因子 mRNA和蛋白的表达与α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白呈正相关关系，见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照体外细胞观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3至10月在青岛大学附属医院中心实验室完成。
1.3 材料人肾小管上皮细胞株(HK-2)由青岛大学附属医院中心实验室惠赠；DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司)；D-葡萄糖、甘露醇(美国Sigma公司)；兔抗人干细胞因子抗体、兔抗人α-平滑肌肌动蛋白抗体、兔抗人Ⅰ型胶原抗体、兔抗人纤维连接蛋白抗体(美国Santa Cruz公司)；实时定量PCR引物(上海生物工程有限公司)；Trizol试剂、DNA marker、RT-PCR试剂盒、SYBR Premix Ex Taq(日本Takara公司)；超速离心机(德国Heraeus公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养与实验分组人肾小管上皮细胞用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中进行培养，待细胞生长至80%-90%融合状态时消化传代。以约5×108 L-1细胞浓度均匀接种于25 cm2培养瓶中，采用无血清培养基同步化12 h后随机分为以下3组：①正常糖组(含D-葡萄糖5.5 mmol/L)；②高糖刺激组(含D-葡萄糖30 mmol/L)；③甘露醇对照组(含D-葡萄糖

5.5 mmol/L+甘露醇24.5 mmol/L)，各组作用0，12，24，48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照、提取总RNA、总蛋白。

1.4.2 实时定量PCR检测按照Trizol说明书提取各组人肾小管上皮细胞总RNA，采用紫外分光光度计检测提取的RNA样品的纯度和浓度，按反转录试剂盒说明书反转录获得cDNA。由上海生物工程公司合成引物，干细胞因子：上游引物5'-ATG AAG AAG ACA CAA ACT TGG-3'，下游引物5'-CAA CAA TGA CTT GGC AAA ACA T-3'；α-平滑肌肌动蛋白：上游引物5'-ATG TGC GAC GAA GAC GAG AC-3'，下游引物5'-ACC TCT CTT GCT CTG AGC CTC GTC-3'；Ⅰ型胶原：上游引物5'-ATG TTC AGC TTT GTG GAC CTC-3'，下游引物5'-AAC ACC TTG CCG TTG TCG C-3'；纤维连接蛋白：上游引物5'-ATC TAC CTG TAC ACC TTG AA-3'，下游引物5'-GGG ACC ACT TCT CTG GGA GG-3'；内参GAPDH：上游引物5'-ATG GGG AAG GTG AAG GTC GGA G-3'，下游引物5'-GAT GAC AAG CTT CCC GTT CTC A-3'。利用SYBR GREEN对各组基因进行实时定量PCR检测，每个样本设5个复孔。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。采用2-ΔΔCT法计算目的基因表达量。
1.4.3 Western blot检测按照全细胞裂解液说明书冰上提取各组人肾小管上皮细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取60-100 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗4 ℃
过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗，室温孵育1 h，洗膜后ECL显色，依次进行曝光、显影、定影，以β-actin作为内参计算各蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①肾小管上皮细胞在高糖作用下的形态变化；②高糖刺激不同时间肾小管上皮细胞中干细胞因子、
α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白 mRNA及蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 26.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，干细胞因子 mRNA和蛋白表达与其他指标的相关性采用Pearson积矩相关分析，P < 0.05为差异有显著性意义。以上实验均重复3次。

讨论

随着全球糖尿病发病率的上升，糖尿病肾脏疾病已经成为导致终末期肾脏病的首要病因[6-7]。终末期肾脏病有一共同途径：肾小球硬化和肾小管间质纤维化。既往研究认为糖尿病肾脏疾病的病变部位主要在肾小球，而近年研究提示肾间质病变的严重程度与肾脏疾病进展速度密切相关[8-9]。因此，探究肾小管上皮细胞损伤及间质纤维化发生发展的机制对糖尿病肾脏疾病的治疗具有十分重要的临床意义。
肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的主要病理基础和共同途径，以肾小管萎缩、间质成纤维细胞增生及细胞外基质过度积聚为特征病理改变[10-11]。大量研究发现，高血糖是引起糖尿病肾病发生及发展的关键因素，持续高血糖状态及其伴随的葡萄糖毒性会导致自由基在肾小管细胞中积聚，近端和远端肾小管上皮细胞凋亡率增加[12-14]。研究表明，由持续高血糖状态和晚期糖基化终末产物增加引起的氧化应激是糖尿病肾脏疾病早期发病机制之一[15-16]。在糖尿病的高血糖状态下可产生大量活性氧，这些活性氧可通过激活一系列信号通路而导致肾功能异常和组织学改变，最终导致氧化应激状态，氧化应激反应过度是促进肾纤维化发生的主要环节之一[17-18]。此外，高糖能使一些重要致纤维化细胞因子生成增加，进一步诱导肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化[19]。肾小管上皮细胞的转分化是糖尿病肾病进展到终末期肾病的主要病理基础和共同途径，α-平滑肌肌动蛋白是上皮-间充质转化的主要标记蛋白，肾脏固有细胞向肌成纤维细胞转化的重要指标之一[20]。近些年研究显示，病理状态下的肾小球壁层内皮细胞、上皮细胞、系膜细胞、肾小管间质细胞可转化为肌成纤维细胞而使α-平滑肌肌动蛋白表达，所以α-平滑肌肌动蛋白能促进肾纤维化的发展，可以预测肾纤维化进展的程度[21-22]。纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原是目前公认的主要细胞外基质成分，其异常增高提示细胞外基质过度积聚，是糖尿病肾病肾间质纤维化的主要表现之一。在该实验中观察到，高糖刺激24 h后肾小管上皮细胞活性显著下降，细胞出现了凋亡形态学改变，包括胞质皱缩、胞核形态不清、贴壁生长不良、细胞边缘不整齐等。RT-PCR及Western blot结果显示，经高糖刺激后，上皮细胞间充质表型α-平滑肌肌动蛋白和细胞外基质重要组成成分——纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原表达明显升高，且随着刺激时间延长表达量逐渐增加，这说明高糖可以诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，并促进细胞外基质沉积，从而促进肾小管间质纤维化的进展。
干细胞因子又称肥大细胞生长因子，是1990年来发现的一种重要的造血生长因子，主要由骨髓基质细胞产生[23]。干细胞因子与肥大细胞的c-kit受体结合，可发挥调节肥大细胞增殖、分化、成熟和活化的作用[24]。已有研究表明，肥大细胞在包括肾脏在内的多种器官组织纤维化过程中发挥重要作用[25]。OTSUBO等[26]首次报道了肾病患者肾小管间质中存在肥大细胞，且与肾组织中干细胞因子的表达量呈正相关，而正常肾脏几乎无干细胞因子，但在肾脏病变时显著上调。YIN等[2]研究发现干细胞因子/c-kit信号通路促进肥大细胞在糖尿病肾脏疾病肾间质中募集及活化，从而促进糖尿病肾脏疾病肾间质纤维化，并与肥大细胞的分布密度及肾间质纤维化呈显著正相关。作者前期研究及文献报道显示，肥大细胞及其重要的影响因子干细胞因子在糖尿病肾病患者肾小管间质中也有浸润和表达增加[27]，但是干细胞因子高表达的原因尚不清楚，因此该研究首次探索了高浓度葡萄糖对肾小管上皮细胞表达干细胞因子的影响。结果发现，与正常糖组相比，高糖诱导组肾小管上皮细胞中干细胞因子基因及蛋白表达明显增多，且随着时间的延长，干细胞因子表达量逐渐增多，24 h达高峰，证实高糖呈时间依赖的方式诱导体外培养的人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子。另外研究还发现，干细胞因子与α-平滑肌肌动蛋白、纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原的表达呈显著正相关关系。由此推测，高糖刺激人肾小管上皮细胞在转录和蛋白水平高表达干细胞因子，并呈时间依赖性，可能是引起糖尿病肾脏疾病肾间质纤维化的机制之一：①高糖刺激肾小管上皮细胞高表达干细胞因子，趋化肥大细胞在糖尿病肾间质中募集、增殖、活化，肥大细胞通过脱颗粒释放活性物质及分泌细胞因子等促进肾间质纤维化；②干细胞因子可以刺激体外培养的人肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化，同时诱导人近曲肾小管上皮细胞高表达转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白和细胞外基质纤维粘连蛋白，进而促进肾间质纤维化的发生发展[28]；③干细胞因子是否通过其他途径，如趋化、激活其他炎症细胞或肾脏固有细胞，诱导产生更多其他的促纤维化因子等，有待进一步研究。
总之，该研究证实高糖可以诱导肾小管上皮细胞发生转分化，诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子，并呈时间依赖性，且与肌成纤维细胞标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白和细胞外基质典型代表——纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原呈正相关，这表明干细胞因子很可能是糖尿病肾脏疾病肾间质纤维化进程中的一个重要参与者。因此，进一步深入研究干细胞因子在肾间质纤维化中的作用机制，有望为糖尿病肾脏疾病的治疗提供新的方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

高糖诱导人肾小管上皮细胞高表达干细胞因子

High glucose induces high expression of stem cell factor in human renal tubular epithelial cells

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