GOLM1基因敲除对单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化的影响

doi:10.12307/2021.115

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (26): 4162-4167.doi: 10.12307/2021.115

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

GOLM1基因敲除对单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化的影响

覃健芳，王欢，吴冰冰，马小京

上海交通大学生命科学技术学院，上海市 200240

收稿日期:2020-04-21 修回日期:2020-04-25 接受日期:2020-06-12 出版日期:2021-09-18 发布日期:2021-05-10
通讯作者: 马小京，教授，上海交通大学生命科学技术学院，上海市 200240
作者简介:覃健芳，女，1997年生，广西壮族自治区平乐县人，2020年上海交通大学毕业，硕士，主要从事免疫学研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(31670913)，项目负责人：马小京

Effect of GOLM1 gene knockout on renal fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction

Qin Jianfang, Wang Huan, Wu Bingbing, Ma Xiaojing

School of Life Science and Technology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

Received:2020-04-21 Revised:2020-04-25 Accepted:2020-06-12 Online:2021-09-18 Published:2021-05-10
Contact: Ma Xiaojing, Professor, School of Life Science and Technology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China
About author:Qin Jianfang, Master, School of Life Science and Technology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31670913 (to MXJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
高尔基体膜蛋白1(Golgi membrane protein 1，GOLM1)：是存在于高尔基体的一种跨膜蛋白，它在人体组织中广泛存在，与多种疾病密切相关，如肝癌、肝纤维化、肾癌及前列腺癌等。
肾纤维化：是指在各种致病因子如炎症、肾组织微环境改变等作用下，细胞外基质过度积聚，导致正常肾组织结构被破坏的病理过程，是各种肾脏疾病发展到肾衰竭的共同通路。

背景：高尔基体膜蛋白1在人体组织中广泛存在，它的异常表达与癌症、病毒感染等多种疾病密切相关。研究表明，高尔基体膜蛋白1可调控一些纤维化细胞因子，但关于其在肾纤维化中的作用尚不清楚。
目的：研究高尔基体膜蛋白1对单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化的影响。
方法：选取6-8周龄的高尔基体膜蛋白1敲除小鼠(KO小鼠)和C57BL/6野生型小鼠(WT小鼠)各12只，分别对小鼠左侧肾脏行单侧输尿管结扎(单侧输尿管梗阻)手术，其右侧肾脏作为对照。单侧输尿管梗阻术后4 d取小鼠肾脏，采用苏木精-伊红染色和Masson染色观察肾组织病理、肾纤维化程度；流式细胞术检测肾脏巨噬细胞浸润比例；qRT-PCR检测肾组织细胞外基质成分及炎症因子mRNA表达。实验方案经上海交通大学动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①WT-单侧输尿管梗阻组和KO-单侧输尿管梗阻组均可见明显肾损伤和肾纤维化，细胞外基质成分Ⅰ型胶原蛋白α1 和纤维连接蛋白表达量显著升高，且KO-单侧输尿管梗阻组肾损伤、肾纤维化程度及细胞外基质表达量均高于WT-单侧输尿管梗阻组(P < 0.05)；WT-对照组和KO-对照组肾脏均未出现明显的肾损伤、肾纤维化及细胞外基质沉积；②与WT-单侧输尿管梗阻组相比，KO-单侧输尿管梗阻组的巨噬细胞浸润比例显著增多(P < 0.05)，其炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β以及趋化因子 CCL5、单核细胞趋化蛋白1 mRNA表达明显升高(P < 0.05)。WT-对照组和KO-对照组肾脏巨噬细胞浸润较少，炎症递质表达量低；③结果说明，高尔基体膜蛋白1在肾纤维化发展中起保护作用，其机制可能与巨噬细胞浸润、炎症递质的调控有关。

https://orcid.org/0000-0002-1935-3928 (覃健芳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 基因, 敲除, 蛋白, 输尿管阻梗, 肾纤维化, 细胞外基质, 炎症反应, 巨噬细胞

Abstract:

BACKGROUND: Golgi membrane protein 1 (GOLM1) is widespread in human tissues, and its abnormal expression is closely related to cancer, viral infections and other diseases. Studies have shown that GOLM1 can regulate some fibrotic cytokines, but its role in renal fibrosis is unclear.

OBJECTIVE: To study the potential effects of GOLM1 on renal fibrosis in mice.
METHODS: Twelve 6-8-week-old GOLM1 knockout mice and 12 C57BL/6 wild type mice were selected and received an operation with left ureteral obstruction. The right kidney served as a control. The mice were sacrificed on the 4th day after the operation. The kidneys of the mice were divided into four groups: WT-C, WT-UUO, KO-C and KO-UUO. Hematoxylin-eosin staining and Masson staining were used to observe the renal tissue pathology and the degree of renal fibrosis. The mRNA expression of extracellular matrix components such as type I collagen α1 and fibronectin were detected by qRT-PCR. Flow cytometry was used to detect the proportion of macrophages. The expressions of inflammatory factors were detected by qRT-PCR. The study protocol was approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Shanghai Jiaotong University.
RESULTS AND CONCLUSION: The kidneys of the WT-UUO and KO-UUO groups showed obvious kidney injury and renal interstitial fibrosis, and the expression of type I collagen α1 and fibronectin was remarkably increased. Compared with the WT-UUO group, the KO-UUO group had significantly severer renal damage, severer inflammatory cell infiltration and higher expression of extracellular matrix components (P < 0.05). There was no obvious renal injury, renal fibrosis, and extracellular matrix deposition in the kidneys of WT-C group and KO-C group. Compared with the WT-UUO group, the mRNA expression of interleukin-6, tumor necrosis factor α, interleukin 1β, C-C motif chemokine ligand 5 and monocyte chemotactic protein 1 increased significantly in the KO-UUO group (P < 0.05). Besides, the proportion of macrophage infiltration was also increased significantly in the KO-UUO group (P < 0.05). In the two control groups, there was less macrophage infiltration and low expression of inflammatory mediators in the renal tissue. To conclude, GOLM1 plays a protective role in the development of renal fibrosis. Its mechanism may be related to macrophage infiltration and the regulation of inflammatory mediators.

Key words: gene, knockout, protein, ureteral obstruction, renal fibrosis, extracellular matrix, inflammation, macrophages

中图分类号:

覃健芳, 王欢, 吴冰冰, 马小京. GOLM1基因敲除对单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4162-4167.

Qin Jianfang, Wang Huan, Wu Bingbing, Ma Xiaojing. Effect of GOLM1 gene knockout on renal fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(26): 4162-4167.

图/表（结果） 5

2.1 肾组织形态学变化苏木精-伊红染色结果显示，KO-对照组和WT-对照组小鼠肾组织形态未见异常，肾小管间质无扩大、无明显炎性细胞浸润。在单侧输尿管梗阻术后，小鼠结扎侧肾组织，KO-单侧输尿管梗阻组和WT-单侧输尿管梗阻组肾间质均出现了不同程度的水肿、存在炎性细胞的浸润，而KO-单侧输尿管梗阻组小鼠肾组织相对于WT-单侧输尿管梗阻组而言，这些症状更为严重(见图1)。Masson染色结果显示，KO-对照组和WT-对照组肾脏，肾小球大小、形态正常，未观察到蓝色胶原纤维沉积。而单侧输尿管梗阻组小鼠肾脏中均有蓝色胶原纤维沉积，出现了明显的纤维化。同时，半定量分析结果显示，与WT-单侧输尿管梗阻组相比，KO-单侧输尿管梗阻组的肾脏胶原沉积面积增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.2 肾组织细胞外基质主要成分的表达 Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白是肾纤维化发生的重要特征分子。qRT-PCR结果表明，单侧输尿管梗阻术后，小鼠组织中Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白 mRNA表达量均明显升高，且KO-单侧输尿管梗阻组表达量高于WT-单侧输尿管梗阻组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.3 肾间质巨噬细胞浸润情况流式结果分析显示，WT-对照组、KO-对照组、WT-单侧输尿管梗阻组、KO-单侧输尿管梗阻组小鼠肾组织中巨噬细胞平均比例分别为1.5%，1.4%，5.6%，9.7%。与对照组相比，单侧输尿管梗阻组肾组织中巨噬细胞增加，KO-单侧输尿管梗阻组巨噬细胞比例最高，较WT-单侧输尿管梗阻组明显增多, 差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.4 肾组织中炎症相关细胞因子的表达 qRT-PCR检测炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β 以及趋化因子 CCL5、MCP-1的基因水平表达。结果显示，单侧输尿管梗阻组表达水平较对照组均显著增加。在对照组肾组织中，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、CCL5、MCP-1仅有极少量表达，而KO-单侧输尿管梗阻组白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、CCL5、MCP-1 mRNA的表达量均高于WT-单侧输尿管梗阻组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。以上结果显示，单侧输尿管梗阻术后，KO小鼠出现了更为严重的炎症反应。

参考文献

[1] HUMPHREYS BD. Mechanisms of renal fibrosis. Annu Rev Physiol. 2018;80:309-326.
[2] WEBSTER AC, NAGLER EV, MORTON RL, et al. Chronic kidney disease. Lancet. 2017;389(10075):1238-1252.
[3] ROMAGNANI P, REMUZZI G, GLASSOCK R, et al. Chronic kidney disease. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17088.
[4] RUIZ-ORTEGA M, RAYEGO-MATEOS S, LAMAS S, et al. Targeting the progression of chronic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 2020;16:269-288.
[5] NOGUEIRA A, PIRES MJ, OLIVEIRA PA. Pathophysiological mechanisms of renal fibrosis: a review of animal models and therapeutic strategies. In Vivo. 2017;31(1):1-22.
[6] CHEVALIER RL, FORBES MS, THORNHILL BA. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 2009;75(11):1145-1152.
[7] KLADNEY RD, BULLA GA, GUO L, et al. GP73, a novel Golgi-localized protein upregulated by viral infection. Gene. 2000;249(1-2):53-65.
[8] JIANG K, LI W, ZHANG Q, et al. GP73 N-glycosylation at Asn144 reduces hepatocellular carcinoma cell motility and invasiveness. Oncotarget. 2016;7(17):23530-23541.
[9] HU L, YAO W, WANG F, et al. GP73 is upregulated by Hepatitis C Virus (HCV) infection and enhances HCV secretion. PLoS ONE. 2014;9(3): e90553.
[10] YANG L, LUO P, SONG Q, et al. DNMT1/miR-200a/GOLM1 signaling pathway regulates lung adenocarcinoma cells proliferation. Biomed Pharmacother. 2018;99:839-847.
[11] ALLAM MA, ELTIBY DM, NASSAR Y, et al. Studying the value of golgi protein 73 as a serum marker in hepatocellular carcinoma versus alfa feto protein. Nature and Science. 2016;14(1):126-129.
[12] KOJIMA S, ENOKIDA H, YOSHINO H, et al. The tumor-suppressive microRNA-143/145 cluster inhibits cell migration and invasion by targeting GOLM1 in prostate cancer. J Hum Genet. 2014;59(2):78-87.
[13] YANG S, ZENG C, FANG X, et al, Hepatitis B virus upregulates GP73 expression by activating the HIF-2α signaling pathway. Oncol Lett. 2018; 15(4):5264-5270.
[14] YE Q, ZHU W, ZHANG J, et al. GOLM1 modulates EGFR/RTK cell-surface recycling to drive hepatocellular carcinoma metastasis. Cancer Cell. 2016;30:444-458.
[15] LIU Y, ZHANG X, ZHOU S, et.al. Knockdown of Golgi phosphoprotein 73 blocks the trafficking of matrix metalloproteinase‐2 in hepatocellular carcinoma cells and inhibits cell invasion. J Cell Mol Med. 2019;23(4): 2399-2409.
[16] YANG X, WEI C. LIU N, et al. GP73, a novel TGF-β target gene, provides selective regulation on Smad and non-Smad signaling pathways. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2019;1866(4):588-597.
[17] ZHANG X, ZHU C, WANG T, et al. GP73 represses host innate immune response to promote virus replication by facilitating MAVS and TRAF6 degradation. PLoS Pathogens. 2017;13(4):e1006321.
[18] LIU Y, LIEWEN H, MARKULY M, et al. A review of GOLPH2, an oncogenic protein and novel therapeutic options for GOLPH2 driven tumours. J Translat Sci. 2019;6:1-4.
[19] YANG H, LIU G, LIU B, et al. GP73 promotes invasion and metastasis of bladder cancer by regulating the epithelial–mesenchymal transition through the TGF‐β1/Smad2 signalling pathway. J Cell Mol Med. 2018; 22(3):1650-1665.
[20] XU R, JI J, ZHANG X, et al. PDGFA/PDGFR α-regulated GOLM1 promotes human glioma progression through activation of AKT. J Exp Clin Cancer Res. 2017;36(1):193.
[21] DING X, DENG G, LIU J, et al. GOLM1 silencing inhibits the proliferation and motility of human glioblastoma cells via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Brain Res. 2019;1717:117-126.
[22] YAN G, RU Y, WU K, GOLM1 promotes prostate cancer progression through activating PI3K‐AKT‐mTOR signaling. Prostate. 2018;78(3): 166-177.
[23] LI XM, CAO LL. Identification of GOLM1 as a Positively Regulator of Tumor Metastasis by Regulating MMP13 in Gastric Carcinoma. Cancer Biomark. 2019;26(4):421-430.
[24] ZHANG W, KIM H, LV J, et al. Golgi phosphoprotein 2 is a novel regulator of IL-12 production and macrophage polarization. J Immunol. 2018;200(4):1480-1488.
[25] LIU Y. Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2011;7(12):684-696.
[26] PILLING D, FAN T, HUANG D, et al. Identification of markers that distinguish monocyte-derived fibrocytes from monocytes, macrophages, and fibroblasts. PLoS One. 2009;4(10):e7475.
[27] DISTLER JHW, GYÖRFI A, RAMANUJAM M, et al. Shared and distinct mechanisms of fibrosis. Nat Rev Rheumatol. 2019;15:705-730.
[28] NOGUEIRA A, PORES MJ, OLIVEIRA P. Pathophysiological mechanisms of renal fibrosis: a review of animal models and therapeutic strategies. In Vivo. 2017;31(1):1-22.
[29] BLACK LM, LEVER JM, AGARWAL A. Renal Inflammation and Fibrosis: A Double-edged Sword. J Histochem Cytochem. 2019;67(9):663-681.
[30] HUEN SC, Cantley LG. Macrophages in Renal Injury and Repair. Annu Rev Physiol. 2017;79:449-469.
[31] KLUTH DC. Pro-resolution properties of macrophages in renal injury. Kidney Int. 2007;72(3):234-236.
[32] Huang L, Wang AM, Hao Y, et al. Macrophage Depletion Lowered Blood Pressure and Attenuated Hypertensive Renal Injury and Fibrosis. Front Physiol. 2018;9:473.
[33] MARTÍNEZ-KLIMOVA E, APARICIO-TREJO OE, TAPIA E, et al. Unilateral ureteral obstruction as a model to investigate fibrosis-attenuating treatments. Biomo- lecules. 2019;9(4):141.
[34] TANG PM, NIKOLIC-PATERSON DJ, LAN H. Macrophages: versatile players in renal inflammation and fibrosis. Nat Rev Nephrol. 2019; 15(3):144-158.
[35] LU H, WU L, LIU L.Quercetin ameliorates kidney injury and fibrosis by modulating M1/M2 macrophage polarization. Biochem Pharmacol. 2018;154:203-212.
[36] Sato Y, Yanagita M. Immune cells and inflammation in AKI to CKD progression.Am J Physiol Ren Physiol. 2018;315:F1501-F1512.
[37] LV W, BOOZ GW, WANG Y, et al. Inflammation and renal fibrosis: recent developments on key signaling molecules as potential therapeutic targets. Eur J Pharmacol. 2018;820:65-76.
[38] GRANDE MT, PÉREZ-BARRIOCANAL F, LÓPEZ-NOVOA JM. Role of inflammation in túbulo-interstitial damage associated to obstructive nephropathy.J Inflamm (Lond). 2010;7:19.
[39] LIANG H, XU F, WEN X, et al.Interleukin-33 signaling contributes to renal fibrosis following ischemia reperfusion. Eur J Pharmacol. 2017;812:18-27.
[40] MAEL-AININ M, ABED A, CONWAY SJ, et al. Inhibition of periostin expression protects against the development of renal inflammation and fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2014;25(8):1724-1736.
[41] WRIGHT LM, YONG S, PICKEN MM, et al. Decreased survival and hepato-renal pathology in mice with c-terminally truncated GP73 (GOLPH2).Int J Clin Exp Pathol. 2009;2(1):34-47.

引言

肾纤维化是指在各种致病因子如炎症、肾组织微环境改变等作用下，细胞外基质过度积聚，导致正常肾组织结构被破坏的病理过程[1]。肾纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病发展到末期的共同特征，随着肾纤维化的进行性发展，慢性肾脏疾病患者的肾功能逐渐恶化，并最终走向肾衰竭[2-3]。数据表示，目前全球约有2 100万肾衰竭患者需依赖透析或肾脏移植维持生命，高额的治疗费用给社会和家庭带来沉重的负担。因此，研究肾纤维化的机制对于制定有效措施防止慢性肾脏疾病发展到终末期肾衰竭显得尤为重要[4]。单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruc- tion，UUO)是研究肾纤维化的发生机制及其治疗措施的理想模型[5-6]。
高尔基体膜蛋白1(Golgi membrane protein 1，GOLM1)，又称GP73或GOLPH2，是Ⅱ型高尔基体跨膜蛋白，最初由KLADNEY等[7]在成年人巨细胞肝炎患者的肝组织cDNA文库中筛选克隆得出。GOLM1基因编码一种糖基化蛋白，相对分子质量为73 000，属于GOLM1 / CASC4 家族。GOLM1在许多物种如大猩猩、小鼠、斑马鱼中高度保守[8]。GOLM1在人体组织中广泛存在，它的异常表达与癌症、病毒感染等多种疾病密切相关[9-14]。研究表明，GOLM1可调控一些纤维化细胞因子，如转化生长因子β1、基质金属蛋白酶2及基质金属蛋白酶9等[14-16]。然而，关于GOLM1在肾纤维化中的作用尚未有报道。此次研究利用GOLM1敲除小鼠建立单侧输尿管结扎(单侧输尿管梗阻)诱导的小鼠肾纤维化模型，初步探讨 GOLM1 在肾纤维化中的作用及潜在的机制，并为发现慢性肾脏疾病新的治疗靶点提供基础和实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对比动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年4至12月在上海交通大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物全身GOLM1-/-小鼠(KO小鼠)和C57BL/6野生型小鼠(WT小鼠)各12只，6-8周龄，体质量18-23 g。全身性GOLM1敲除小鼠，以C57BL/6为背景，使用TALEN技术对其第4外显子进行定向缺失而得，由课题组构建[17]，C57BL/6野生型小鼠购买于浙江维通利华公司，许可证号：SCXK(浙)2019-0001。
1.3.2 实验用主要试剂及仪器设备苏木精-伊红染色试剂盒、Masson染色试剂盒(索莱宝生物科技公司产品)；反转录试剂盒(Takara公司)；流式荧光抗体APC-F4/80、FITC-CD11b(BD公司)；Trizol(Thermo Fisher公司)；荧光定量PCR引物由上海桑尼生物科技公司合成；普通PCR仪、荧光定量PCR仪(Bio-rad)；多功能酶标仪(Bio-tek)；离心机(Thermo)；流式细胞仪C6(BD)；倒置相差显微镜(Olympus)；石蜡切片机(Leica)。
1.4 实验方法
1.4.1 单侧输尿管梗阻动物模型建立 WT和KO所有小鼠术前禁食12 h，自由饮水。称量体质量，并以1%戊巴比妥钠(5 μL/g) 腹腔注射，对小鼠进行麻醉并切开腹部，随后分离小鼠左侧输尿管，在其中上1/3处结扎并剪断，随后逐层缝合，关闭腹腔，再次消毒切口，使用无菌敷料覆盖包扎。术后小鼠自由饮水、进食。
1.4.2 肾脏标本收集于术后第4天麻醉小鼠后处死，切取双侧肾脏，剥离肾包膜，生理盐水冲洗后，将收集到的肾脏分为4组：WT-对照组(WT小鼠右肾)、WT-单侧输尿管梗阻组(WT小鼠左肾)、KO-对照组(WT小鼠右肾)、KO-单侧输尿管梗阻组(WT小鼠左肾)。将每一个肾组织分成3部分：一部分置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，经石蜡包埋后进行病理学染色，一部分立即做流式检验巨噬细胞，剩余组织保留于液氮中，用于提取RNA。

1.4.3 苏木精-伊红染色和Masson染色观察肾组织病理、肾纤维化程度取肾脏组织标本，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成石蜡切片，按照常规方法分别行苏木精-伊红染色和Masson染色，在显微镜下观察肾脏组织并拍照。每张切片随机选取10个不重叠视野(×200倍)进行分析。Masson染色结果，使用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，以蓝色胶原沉积为阳性面积，计算肾间质胶原沉积面积占总面积的百分比。

1.4.4 流式细胞术检测肾脏巨噬细胞浸润比例将新鲜的肾组织剪碎成小块，加入2 mL组织消化液(含2 g/L 胶原酶D、200 mg/L DNase I)，37℃消化30min，取出细胞悬液，加入4 mL staining buffer (PBS+2% FBS)终止消化，用5 mL注射器柄部将肾组织研磨，70 μm滤膜过滤，离心(350×g，4℃，5 min)，弃上清，加入3 mL红细胞裂解液裂解5 min，加入10 mL staining buffer终止裂解，离心(350×g，4 ℃，5 min)，洗涤2次，细胞重悬计数后，用100 μL staining buffer制备单细胞悬液(1×106)，每管加入适量的细胞表面荧光抗体APC-F4/80、FITC-CD11b，冰上避光孵育 30 min，staining buffer洗涤细胞，重复3次，100 μL staining buffer重悬，上机检测。用Flow Jo软件分析结果。

1.4.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肾组织细胞外基质成分及炎症因子mRNA表达取出各组肾组织，放于液氮预冷过的研钵中，研磨成粉末，加入Trizol提取肾组织总RNA，测定RNA浓度和纯度，按试剂盒说明操作反转录为cDNA，加入SYBR Green Mix、引物和水，置入荧光定量PCR仪中进行扩增。扩增条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 °C 1 min，40个循环；最后95 ℃ 5 s，65-95 ℃ 5 s。各基因引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①肾组织形态学变化；②肾组织Ⅰ型胶原蛋白α1、纤维连接蛋白 mRNA的表达；③肾间质巨噬细胞浸润情况；④肾组织白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及趋化因子5 (C-C motif chemokine ligand 5，CCL5) 单核细胞趋化蛋白1 (monocyte chemotactic protein 1，MCP-1) 的表达。
1.6 统计学分析实验结果数据以x±s表示，采用t检验法进行分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着研究的深入，GOLM1在各种疾病中的作用及机制逐渐被解析。GOLM1是转化生长因子β作用的靶分子，可调节Smad和非Smad信号通路，是抗肝纤维化、膀胱癌等疾病潜在的治疗靶标[16，18-19]。在神经胶质瘤中，GOLM1调控PDGFA/PDGFRα促进AKT的磷酸化[20]。GOLM1还参与EGFR、mTOR/AKT/PI3K、Wnt/β-catenin等信号通路的调节，影响癌细胞的增殖和迁移[21-23]。GOLM1在炎症反应中也发挥着重要的作用。在肝癌细胞系中，过表达的GOLM1可激活先天性免疫信号通路和炎症小体复合物的形成[17]；GOLM1通过激活白细胞介素4介导的JAK-STAT6通路，抑制LPS介导的核因子κB通路来调控巨噬细胞的极化[24]。上述信号通路及炎症反应在肾纤维化的发展中也发挥着重要的作用。此次研究发现，GOLM1在肾纤维化过程中发挥着抗纤维化的作用。
在此次研究中，通过在GOLM1敲除小鼠和野生型小鼠中建立单侧输尿管梗阻模型诱导小鼠肾纤维化，结果发现，与野生型小鼠相比，GOLM1敲除小鼠发展为更为严重的肾纤维化。小鼠肾组织病理染色结果显示，单侧输尿管梗阻术后，GOLM1敲除小鼠的肾组织病变程度较野生型小鼠明显加重，且其肾脏胶原纤维沉积面积也显著增加。GOLM1缺失后，小鼠梗阻性肾纤维化加重，说明GOLM1在肾纤维化中具有潜在的抗纤维化作用。
肾纤维化形成的主要特征是细胞外基质的沉积[25]。Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白是细胞外基质的主要成分，常被用来评估肾纤维化程度[26]。为进一步探究GOLM1对肾纤维化影响，实验检测了Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白 mRNA表达量。结果显示，单侧输尿管梗阻术后，KO组小鼠肾组织中Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白 mRNA表达量明显比WT组高，KO组小鼠细胞外基质沉积较多。在正常组织中，Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白可维持肾组织的空间结构，而肾损伤发生时，Ⅰ型胶原蛋白α1和纤维连接蛋白在肾间质堆积，降解失衡，引起纤维化[1，26-27]。在此次研究中，GOLM1的缺乏导致肾组织的细胞外基质沉积增多，因此推测在肾纤维化进程中，GOLM1可能通过调控细胞外基质成分的降解平衡来缓解肾纤维化。
肾纤维化的病理过程较复杂，炎症反应是肾纤维化的发展进程中的关键因素，主要表现为免疫细胞浸润和炎症递质释放[28-29]。实验通过对各组肾组织的巨噬细胞浸润及炎症递质等情况进行检测，探究GOLM1在肾纤维化发生发展中可能存在的调控机制。苏木精-伊红染色结果显示，单侧输尿管梗阻术后，与WT小鼠肾组织相比，KO小鼠肾组织炎症细胞浸润明显增加，该结果表明GOLM1敲除后，阻梗小鼠肾间质炎症细胞分泌增多，加剧了肾组织炎症反应。在所有致肾纤维化的炎症细胞中，巨噬细胞是介导肾纤维化炎症反应过程的主要浸润免疫细胞[30]，肾纤维化程度与巨噬细胞的数量密切相关[31-32]。因此，实验使用流式细胞术检测肾纤维化组织中巨噬细胞的浸润情况，结果显示，单侧输尿管梗阻术后第4天，小鼠阻梗侧肾组织中巨噬细胞数量均增加，这与之前的研究报道一致[33]；此外，与WT-单侧输尿管梗阻组相比，KO小鼠的肾组织的巨噬细胞浸润比例显著增加。许多学者认为，巨噬细胞的浸润加剧了肾纤维化，巨噬细胞的耗竭可减轻纤维化程度[34-35]。此次研究中，GOLM1敲除后，引起了更多的巨噬细胞在肾脏中募集，因此推测，GOLM1可能通过抑制巨噬细胞的浸润，从而抑制肾纤维化的发生发展。研究表明，各亚型的巨噬细胞均参与肾纤维化过程，且不同亚型的巨噬细胞在不同阶段发挥的作用存在差异[34，36]。有研究显示，GOLM1可抑制巨噬细胞M1型极化，促进M2型极化[24]。结合此次实验结果，在肾纤维化的早期，GOLM1可抑制巨噬细胞浸润，但GOLM1是如何调控巨噬细胞的浸润，是否通过调控M1/M2极化平衡来影响肾纤维化等问题还有待后续进一步研究探讨。
在肾纤维化发展过程中，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等炎症因子及CCL5、MCP-1等趋化因子炎症递质的释放，可诱发免疫细胞的浸润，放大炎症反应[37]。在此次研究中，单侧输尿管梗阻术后，肾组织中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、CCL5、MCP-1的mRNA表达量显著增加。此外，与WT-单侧输尿管梗阻组相比，KO-单侧输尿管梗阻组肾组织表现出更严重的肾间质炎症反应，其炎症因子包括白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β 以及趋化因子 CCL5、MCP-1的mRNA转录水平更高。以上炎症递质均可通过驱动成肌纤维细胞分化和刺激细胞外基质合成，促进炎症反应，导致肾组织损伤，加剧肾纤维化[38-40]。这些结果表明，GOLM1可通过调控炎症细胞因子的表达，参与炎症反应，从而调控参与肾纤维化发展过程，该结果也进一步证实了GOLM1在炎症反应中的发挥的重要作用。
在此次研究中，KO-对照组小鼠在组织病理分析、肾纤维化程度、巨噬细胞浸润以及炎症递质表达等方面与WT-对照组相比均无显著差异。这表明GOLM1敲除小鼠在正常状态下，其肾脏组织未出现明显的病理变化。有研究表明，GOLM1基因C-末端截短的小鼠与野生型小鼠相比，存活率显著降低，并出现了不同程度的肾脏病变，包括局灶性节段性肾小球硬化和透明血栓形成[41]。然而，课题组构建的GOLM1敲除小鼠与野生型小鼠相比无明显异常[23]。该现象有待进一步探究。
综上所述，研究结果表明，GOLM1敲除后加剧了单侧输尿管梗阻小鼠的肾纤维化。在肾纤维化过程中，GOLM1对肾脏具有一定的保护作用，其作用机制可能与抑制巨噬细胞浸润及炎症递质的释放有关，但具体的作用机制仍待深入探究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

GOLM1基因敲除对单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化的影响

Effect of GOLM1 gene knockout on renal fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.
[3]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[4]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[5]	姬志祥, 蓝常贡. 尿酸盐转运蛋白在痛风中的多态性和治疗相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1290-1298.
[6]	申晋波, 张林. 急性力竭运动导致大鼠跟腱微损伤的超微结构变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1190-1195.
[7]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[8]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[9]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[10]	王晗月, 李富荣, 杨晓菲, 胡巢凤. 高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1056-1063.
[11]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[12]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[13]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[14]	赵中溢, 李勇阵, 陈峰, 季爱玉. 同期双侧全膝关节置换和单髁置换治疗创伤性关节炎的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 854-859.
[15]	郑小龙, 何晓铭, 龚水帝, 庞凤祥, 杨帆, 何伟, 刘少军, 魏秋实. 酒精性股骨头坏死患者的骨转换特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 657-661.