生物工程角膜与人供体角膜治疗真菌性角膜溃疡的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2219

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物工程角膜：又称脱细胞猪角膜基质，是取材于猪眼角膜经病毒灭活与脱细胞等工艺制备而成，由前弹力层和部分基质层构成的纤维支架组织。所有的脱细胞猪角膜基质均通过细胞毒性测试和组织相容性测试。
板层角膜移植：是一种部分厚度的角膜移植，通常是切除病变的角膜组织，将相应厚度的植片移植到角膜植床上。

背景：寻找替代角膜供体的材料是临床上治疗真菌性角膜溃疡的研究热点。

目的：观察生物工程角膜和人供体角膜治疗真菌性角膜溃疡的临床疗效。

方法：选择2016年10月至2017年2月北部战区总医院收治的真菌性角膜溃疡患者44例(44眼)，随机分2组：生物工程角膜组(n=22)采用脱细胞猪角膜基质材料进行板层角膜移植治疗，人供体角膜组(n=22)采用人供体角膜材料进行板层角膜移植治疗。随访12个月，观察两组感染控制率、视力、角膜植片透明度、角膜上皮化时间、并发症等情况。试验已通过北部战区总医院医学伦理委员会批准[K(2018)05号]。

结果与结论：①两组感染控制率比较差异无显著性意义(91%，91%，P > 0.05)；②两组术后视力随时间延长逐渐改善，人供体角膜组术后12个月的矫正视力视力优于生物工程角膜组(P < 0.05)；③人供体角膜组术后1，3，6个月的角膜植片透明度优于生物工程角膜组(P < 0.05)，两组术后12个月的角膜植片透明度无差异(P > 0.05)；④两组角膜植片上皮愈合时间比较差异无显著性意义[(6.6±2.0)，(6.7±1.9) d，P > 0.05]；⑤两组角膜上皮愈合延迟、角膜植片排斥反应、新血管长入、原病复发等并发症发生率比较差异无显著性意义，生物工程角膜组角膜植片溶解发生率高于人供体角膜组(32%，8%，P < 0.05)；⑥结果表明，采用生物工程角膜行板层角膜移植治疗真菌性角膜溃疡的临床效果显著、安全性高、预后较好。因此在无人供体角膜的情况下，生物角膜可作为板层角膜移植的材料用于治疗真菌性角膜溃。

ORCID: 0000-0002-1297-4684(刘志玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 真菌, 角膜溃疡, 板层角膜移植, 生物工程角膜, 人供体角膜, 感染控制率, 排斥, 复发

Abstract:

BACKGROUND: Searching for a substitute donor corneal is a hotspot for treating fungal corneal ulcer.

OBJECTIVE: To investigate the clinical effect of bio-engineering cornea and donor cornea on treating fungal corneal ulcer.

METHODS: Forty-four cases (44 eyes) of fungal corneal in General Hospital of Northern Theater Command were enrolled, and were randomized into two groups, followed by underwent lamellar keratoplasty using acellular porcine corneal matrix (bio-engineering group, n=22) and human donor cornea (donor group, n=22). The patients were followed up for 12 months. The control rate of infection, visual acuity, graft transparency, epithelization time and complications were observed in both groups. The study was approved by the Ethical Committee of General Hospital of Northern Theater Command, approval No. K(2018)05.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The control rate of infection showed no significant difference between two groups (91%, 91%, P > 0.05). (2) The visual acuity in both groups was improved with time. The visual acuity in the donor group was significantly better than that in the bio-engineering group at 12 months after surgery (P < 0.05). (3) The graft transparency in the donor group was significantly better than that in the bio-engineering group at 1, 3 and 6 months after surgery (P < 0.05), and had no significant difference at 12 months after surgery (P > 0.05). (4) The epithelization time showed no significant difference [(6.6±2.0) days, (6.7±1.9) days, P > 0.05]. (5) There was no significant difference in the incidence of delayed healing of corneal epithelium, rejection reaction of graft, neovascularization, or recurrence between two group (P > 0.05). The rate of graft dissolved in the bio-engineering group was significantly higher than that in the donor group (32%, 8%, P < 0.05). (6) In summary, bio-engineering cornea used for lamellar keratoplasty holds significant efficacy, high safety and good prognosis in the treatment of fungal cornea ulcer, which may as substitute when donor cornea is deficient.

Key words: fungus, corneal ulcer, lamellar keratoplasty, bio-engineering cornea, human donor cornea, control rate, rejection reaction, recurrence

中图分类号:

刘志玲, 高明宏, 陈颖欣. 生物工程角膜与人供体角膜治疗真菌性角膜溃疡的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(10): 1563-1569.

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图/表（结果） 14

2.1 参与者数量分析按意向性分析处理，纳入行板层角膜移植的44例真菌性角膜溃疡患者作为研究对象，4例最终行穿透性角膜移植治疗。

2.2 试验流程见图1。

2.3 基线资料对比两组年龄、性别比例、术前视力、病灶累及范围及深度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 感染控制率两组感染控制率相同，两组各2只眼(9%)在术后1-4周内出现真菌复发，抗真菌药物治疗无效，行穿透明角膜移植后最终感染控制；其余40眼真菌感染全部控制，感染控制率为91%。

2.5 视力在未行穿透性角膜移植的40眼中，两组术后视力随时间延长逐渐改善，12个月时生物工程角膜组最佳矫正视力为(logMAR)0.51±0.33，人供体角膜组为(logMAR) 0.33±0.20，人供体角膜组的视力优于生物工程角膜组(P < 0.05)。生物工程角膜组治疗前后的眼前节照相见图2。

2.6 角膜植片透明度术后1，3，6个月时，人供体角膜组角膜植片透明度优于生物工程角膜组；术后12个月时，两组透明度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。术后不同时间点两组角膜植片透明度见图3。

2.7 角膜上皮愈合时间生物工程角膜组角膜植片上皮愈合时间为4-11 d，平均(6.6±2.0) d；人供体角膜组角膜植片上皮愈合时间为4-12 d，平均(6.7±1.9) d，两组角膜上皮化时间比较差异无显著性意义(χ²=0.014，P > 0.05)，见图4。

2.8 角膜移植后并发症

2.8.1 角膜上皮愈合延迟角膜上皮愈合标准为荧光素染色后无片状着染。两组角膜上皮延迟愈合后给予羊膜移植处理，角膜上皮愈合天数见表4。

2.8.2 角膜植片溶解角膜植片发生溶解后的主要表现为角膜上皮及基质缺损，荧光素钠染色大面积着染，首先给予药物保守治疗及羊膜移植等处理方法，保守治疗无效后给予角膜植片更换，行羊膜移植后结果见表5。角膜植片溶解见图5。

2.8.3 角膜植片排斥发生排斥反应后，给予药物对症治疗及角膜植片更换，其转归见表6。1例生物工程角膜发生角膜排斥反应的眼前节照相，见图6。

2.8.4 新生血管长入生物工程角膜组8例角膜植片长入新生血管，发生率为36%，见图7，3个月左右拆除新生血管部位缝线，部分新生血管可消退；人供体角膜组6例角膜植片长入新生血管，发生率为27%，经抗排斥治疗后新生血管可部分消退，见表7。

2.8.5 原病复发两组各2只眼(9%)真菌复发，最终行穿透性角膜移植，具体情况见表8。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照试验。

1.2 时间及地点试验于2016年10月至2017年2月在北部战区总医院眼科完成。

1.3 对象选择2016年10月至2017年2月在北部战区总医院眼科住院治疗的真菌性角膜溃疡患者44例(44眼)，利用随机数字表法分为2组：生物工程角膜组(n=22)采用脱细胞猪角膜基质材料进行板层角膜移植治疗，人供体角膜组(n=22)采用人供体角膜材料进行板层角膜移植治疗。所有患者术前均签署手术知情同意书。试验已通过北部战区总医院医学伦理委员会批准[K(2018)05号]。

入选标准：年龄18-80岁之间；根据病史、临床表现、体征、共焦显微镜及实验室等辅助检查，确诊为真菌性角膜溃疡者；未累及全层的角膜溃疡，经过1周药物治疗后病灶未局限，仍有扩大趋势患者；药物治疗后前房积脓消失者，病灶位于中、浅层角膜基质且迁延不愈者(3个月以上)^[3]；药物治疗有效，但病灶位于中央视轴区中、浅层角膜基质视力严重下降至0.1及以下者^[4]；角膜溃疡直径较大或偏中心的中、浅层溃疡者^[4]；角膜溃疡直径在3-8 mm之间者。

排除标准：年龄<18岁且>80岁的患者；溃疡灶穿透后弹力层的患者；全身情况差，不能耐受手术的患者；干眼症患者；既往有眼底病变的患者。

1.4 材料角膜材料选用干燥保存的脱细胞猪角膜基质(艾欣瞳)，深圳艾尼尔角膜工程有限公司商品，见表1。人供体角膜组选取北部战区总医院眼库4 ℃低温甘油脱水法保存的角膜植片，均在3个月内，所有角膜植片均无传染性疾病。

1.5 方法

1.5.1 术前用药真菌性角膜溃疡患者术前给予0.5%氟康唑滴眼液0.1 mg点眼2-4次/d(长春迪瑞制药有限公司)或5%那他霉素滴眼液0.1 mg点眼1次/h(Alcon Laboratories，Inc.)；伏立康胶囊200 mg口服2次/d(辉瑞制药有限公司)或注射用伏立康唑200 mg静脉输液2次/d(四川美大康华康药业有限公司)。

1.5.2 手术方法所有手术均由同一术者完成，术者为经验丰富主任医师，所有患者均按常规内眼手术准备。显微镜下，首先在术眼定出角膜病灶的几何中心，在显微镜下用直径大于病灶1 mm的环钻做1/3深度的角膜植床切口，根据溃疡深度用尖刀片逐层剖切病变组织，直至彻底清除病变组织并用0.02%伏康唑注射液冲洗角膜植床创面。观察无病灶残留，并将最后一次切除的角膜组织送微生物培养。根据切削病变深度，选取相应厚度的植片(200，300，400，450 µm)，置于生理盐水中，生理盐水复水10-15 min，人供体角膜组剥除供体角膜植片内皮层及后弹力层^[5]，根据病灶深度去除相应的基质层，人供体角膜组角膜植片术前1 h在室温下用无菌生理盐水反复多次冲洗，然后将其置于庆大霉素生理盐水(1 000 U/mL)溶液中复水30 min后使用^[6]。两组植片直径均>植床0.5 mm。采用10-0尼龙线间断对位缝合12针或16针，线结埋藏于植床内。

1.5.3 术后处理绷带加压包扎术眼2 d，全身用药同术前；术后第2天在感染控制的情况下佩戴角膜绷带镜。感染控制指标：结膜囊无脓性分泌物；角膜层间无浸润；前房无积脓。术后继续常规抗感染治疗，降低疾病的复发率^[7]。给予小牛血去蛋白眼用凝胶0.1 mg涂眼3次/d(沈阳兴齐眼药股份有限公司)，促进角膜上皮愈合。上皮愈合后，在感染控制情况下滴用1%环孢素A滴眼液0.1 mg涂眼3次/d(华北制药股份有限公司)，醋酸泼尼松滴眼液0.1 mg滴眼4 次/d(艾尔建信息咨询上海有限公司)。全身用药1周后监测肝肾功。术后3，6个月行共焦显微镜检查，3个月时结果(-)，可减少抗真菌滴眼液的用药频次。6个月时连续2次结果(-)，可停用抗真菌药。

1.6 主要观察指标术后3，7 d及1，3，6，12个月进行随访，主要观察指标为感染控制率，次要观察指标为最佳矫正视力、角膜植片透明度、角膜上皮化时间、并发症等情况。角膜植片透明度进行评分采用统一标准(详见Score Clinical Appearance)，评分高角膜混浊程度重^[8]。

1.7 统计学分析应用SPSS 22.0统计软件进行数据处理。两组内视力比较采用重复方差分析，两组间视力比较采用t 检验。植片透明度、角膜上皮化时间、排斥反应发生率等采用χ²检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

人供体角膜在临床治疗真菌性角膜溃疡应用时间较久、范围较广泛，适应证及并发症报道也较多，试验着重讨论生物工程角膜的相关情况。

真菌性角膜溃疡的治疗非常棘手，病灶位于浅基质层时大部分可通过药物治愈，若病灶较深，累及深基质层或角膜全层时，往往需要板层角膜移植或者穿透性角膜移植才能治愈^[9-10]。然而全球范围内角膜供需之间严重不平衡，GAIN等^[11]研究发现已经行角膜移植和等待行角膜移植两者的比例大约是1∶70，尤其中国是发展中国家，随着人口的增长，这种不平衡会进一步加重。生物工程角膜是猪角膜植片经过脱细胞处理后形成的角膜支架材料，目前被用于板层角膜移植。板层角膜移植是由德国医生Arthur von Hippel在19世纪末首次报道成功^[12]，是一种部分厚度的角膜移植，通常是切除病变的角膜组织，将相应厚度的植片移植到角膜植床上^[13]。板层角膜移植相对于穿透性角膜移植具有以下优点^[14-16]：手术相对安全，无须切开进入前房，眼内感染等并发症少；手术面积不受限制；对移植材料的要求低；由于没有更换角膜内皮细胞，排斥反应发生率低，一般仅为4%-5%，植片存活率明显增加。此次研究中有几例采用深板层角膜移植，术后视力提高较常规板层角膜移植明显，考虑主要与深板层角膜移植术后不规则散光小有关。ZHANG等^[17]报道47例真菌性角膜炎行脱细胞猪角膜基质板层角膜移植治疗的患者，随访6个月时角膜溃疡均被治愈，且无感染复发、排斥及全身不良反应。郑钦象等^[18]报道20例感染性角膜炎使用脱细胞猪角膜基质行深板层角膜移植治疗的患者，在定期随访过程中发现原病复发1例、角膜排斥1例，在6个月随访时，单眼脱盲率为100%，感染控制率为95%。

试验中两组病例感染控制率均达91%，板层角膜移植切除病变角膜组织可减少致病微生物的数量、减弱毒性及抗原抗体反应，有利于术中、术后抗真菌药物的渗透。此次研究中两组病例各有1例真菌复发，作者认为可能与以下因素相关术中病灶切除不彻底，可能仍存留少量菌丝；抗真菌药物用药频次减少过快；这2例患者真菌较顽固，毒力较强。谢立信^[19]研究认为真菌菌丝在角膜中的生长方式大致可分3种形式：①表层(水平生长)型：真菌呈表层地毯式生长，菌丝只在病灶处水平或斜行扩散；②局灶(板层生长)

型：菌丝只在病灶处垂直或水平扩散；③弥散(垂直和斜行生长)型：角膜全层可见菌丝，菌丝垂直嵌顿与组织间，有伪足及卫星灶等。彻底切除角膜病变组织是控制感染的关键因素，此次研究中感染控制率高于平时报道的6.34%- 7.08%，可能与患者病情严重程度较高有关，该研究纳入病例大多是基层医院治疗无效转入沈阳军区总医院治疗。

术后1年时两组间视力最佳矫正视力相比差异有显著性意义(t=2.05，P < 0.05)。在短期内人供体角膜组视力提高较组织工程角膜组明显，可能与甘油保存角膜恢复透明时间短有关。板层角膜移植很少累及角膜内皮细胞，内皮细胞是甘油保存角膜和生物工程角膜恢复透明的前提。术后视力主要与病变组织位置有关，病灶位于角膜瞳孔中央者且病灶直径>6 mm者早期术后视力恢复较慢，但术后6个月视力均能达到0.5以上，其原因为缝线所导致的角膜散光小。溃疡灶位于周边部，术后缝线恰好累及瞳孔区，植片与植床瘢痕愈合，导致不规则散光是患者术后视力提高不佳的主要原因。若病灶偏中心时考虑术后视力恢复因素，植床的制备可超过瞳孔区^[20]。

角膜植片透明度的恢复考虑主要与以下因素有关：制成合格的脱细胞猪角膜基质，无细胞残留，是角膜植片恢复透明性的前提；患者角膜内皮细胞数亦是角膜植片恢复透明重要因素。角膜植片复水后组织水肿，供体角膜组术后1，3，6个月的角膜植片透明优于组织工程角膜组。虽然术后12个月时两组透明度比较差异无显著性意义(χ²=2.125，P > 0.05)，可能与样本量较小有关，还需进一步扩大样本量继续观察研究。

两组术后角膜上皮化时间对比无明显差别。角膜移植术后上皮愈合时间>7 d为植片上皮延缓愈合^[21-22]。影响角膜上皮化的因素包括角膜缘干细胞数量及质量、泪液分泌功能、眼表健康状况、年龄、植片直径等。角膜缘干细胞是所有细胞增殖与分化的源泉^[23]。SCHERMER等^[24]研究认为角膜缘基底细胞层是角膜上皮干细胞存在的部位。感染性角膜病灶未侵及角膜缘基底细胞时，角膜上皮愈合时间越短。孙秀丽等^[25]研究发现患者年龄、泪液分泌功能、角膜植片直径均可影响角膜上皮的愈合：年龄大、内皮细胞功能下降、Shirmer试验<5 min的患者，植片上皮愈合时间明显延长，植片直径>9 mm的患者上皮愈合时间最长。此次研究中，生物工程角膜组中2例患者角膜上皮愈合延迟，其中1例具有10年糖尿病病龄，平时血糖控制不佳，另一例是术眼植片直径6 mm，两者均于羊膜移植后4 d角膜上皮愈合。羊膜具有独特的生物学特性^[26-27]，具有抑制瘢痕形成、促进上皮增生和分化的作用^[28-29]。研究表明角膜移植后神经再生及修复是眼表重建的基础，神经破坏影响角膜上皮细胞再生，易引起持续性上皮缺损^[30]。角膜上皮完全覆盖是角膜植片存活的关键。

角膜植片溶解影的响因素包括角膜上皮愈合延迟、排斥反应发生、原病复发等。此次研究中，组织工程角膜组有8例角膜植片溶解，人供体角膜组有2例。组织工程角膜组的主要原因为角膜上皮缺损，排斥反应发生，而人供体角膜组主要为原病复发导致角膜植片溶解。给予对症治疗后部分角膜植片溶解愈合，这类患者也可以采用角膜缘干细胞移植及睑裂缝合治疗^[31]。原病复发病例通常需要更换角膜植片。

两组角膜植片发生排斥反应的特点：①在时间上：组织工程角膜组排斥反应发生较早，人供体角膜组发生较晚；②症状及预后：组织工程角膜组主要表现为新生血管快速长入，结膜混合充血，排斥控制后新生血管快速消退，伴角膜植片溶解；人供体角膜组主要表现为角膜植片水肿，结膜混合充血，角膜新生血管长入速度慢，排斥控制后新生血管消退速度也较慢，很少有角膜植片溶解。排斥反应和新生血管长入角膜植片是角膜移植后常见的并发症，虽然文献报道板层角膜移植后无内皮排斥反应^[32]，但仍可发生角膜排斥，如基质型和上皮型排斥，发生率为0%-8%^[33-34]。生物工程角膜经通过特殊工艺处理去除了生物细胞和其他抗原性物质，保留的胶原蛋白为公认的低免疫性物质降低炎症反应，从而减少了角膜排斥反应的发生^[35-37]。在正常的角膜血管生成过程中，促进因子与抑制因子处于一种动态的平衡中，当这种平衡被角膜化学烧伤、缺血、感染、创伤和炎症、手术等打破后，新生血管长入角膜，导致角膜“免疫赦免”机制破坏，是角膜移植后发生免疫排斥反应的常见高危因素^[38-41]。此次研究中发生角膜排斥反应的患者为翼状胬肉术后继发真菌感染，其角膜缘干细胞数量及质量均较正常患者差，易发生角膜排斥反应。抑制角膜新生血管药物治疗包括：免疫抑制剂、抗血管内皮生长因子、抗血管生成因子、非类固醇抗炎药，也可以采用基因治疗手段^[42]。

原病复发是真菌性角膜溃疡行角膜移植后常见的并发症，再次复发意味着对之前使用的抗真菌药物产生抗耐药性，病情难以控制，再次行角膜移植的可能性极大，同时也增加了患者的经济负担。研究发现真菌性角膜溃疡患者术后真菌复发率为6.34%-7.08%^[41]。此次研究的复发率为9%，明显高于此报道的复发率，且两种材料间的复发率无明显差别。角膜植片缝线松脱是角膜移植患者常见的现象，此次研究发现组织工程角膜组发生缝线松脱的比例高于人供体角膜组，可能由于术后复水角膜植片组织水肿较重，术后角膜植片水肿减轻，缝线发生松脱。若随访发现缝线松弛者应尽早拆除松脱缝线，避免眼部分泌物存留于线周围，增加感染及排斥风险^[34]。

综上所述，生物工程角膜可作为板层角膜移植材料用于治疗真菌性角膜溃疡治疗。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程