2.1  溶剂种类对电纺聚乳酸-羟基乙酸膜的影响  如图1A所示，3种不同溶剂配制的聚乳酸-羟基乙酸均可喷出电纺丝，但六氟异丙醇溶剂下的电纺比较稳定，电纺丝细长，聚乳酸-羟基乙酸电纺丝表面光滑、多孔、网格状、无球等。3种配制方法得到的聚乳酸-羟基乙酸电纺丝具体形态略有差异，六氟异丙醇配制的聚乳酸-羟基乙酸电纺丝为方格多孔形，而二氯甲烷与二甲基甲酰胺混合溶液和三氯甲烷制备的电纺丝为多边形孔状结构，有中断。 

       3种不同溶剂下形成的聚乳酸-羟基乙酸电纺丝直径分布符合正态分布，3者直径大小无统计学差异；但在孔隙率方面，以六氟异丙醇溶剂制备的聚乳酸-羟基乙酸电纺丝平均直径为435 nm，分布频率最高区间为425-575 nm之间，与其他2种溶剂制备的电纺丝有明显统计学差异，电纺丝孔隙率为85%；以三氯甲烷溶剂制备的聚乳酸-羟基乙酸电纺丝平均直径为473.3 nm，分布频率最高区间为425-575 nm之间，孔隙率为71.2%；以二氯甲烷和二甲基甲酰胺混合溶液制备的聚乳酸-羟基乙酸电纺丝平均直径为485.5 nm，分布频率最高区间为225-375 nm，孔隙率为73.8%，见图1B-D。

2.2  不同参数对电喷壳聚糖微球直径及形貌的影响

2.2.1  壳聚糖质量浓度及相对分子质量对微球的影响   光镜下，相对分子质量5万、质量浓度10 g/L壳聚糖形成的微球比较散，大小不一，平均直径为362.1 μm，易破；相对分子质量5万、质量浓度20 g/L壳聚糖形成的微球大小基本一致，平均直径366.6 μm，单分散性好、饱满、稳定；相对分子质量10万、 质量浓度10 g/L壳聚糖形成的微球比较大，最大直径可达510.88 μm，不稳定，见图2A，2C-a。 因此，选定相对分子质量5万、质量浓度20 g/L的壳聚糖进行下一步实验。

2.2.2  电压对电微球直径的影响  14 kV低压下，壳聚糖微球的平均直径366.6 μm；28 kV高压下，壳聚糖微球的平均直径在112.1 μm，两者之间比较差异有非常显著性意义(P < 0.000 1)，见图2C-b，此结果提示电喷技术中电压参数是影响壳聚糖微球直径大小的重要因素之一。随着电压升高，壳聚糖微球的直径变小，高压下电喷微球直径在100 μm，牙周膜宽度100-380 μm，直径100 μm微球便于用于仿生牙周膜支架，提示高压下形成的壳聚糖微球更符合脱位牙仿生膜的要求。

2.2.3  三聚磷酸钠接受液浓度对微球微观结构的影响  如图2B所示，扫描电镜示微球多孔结构，表面光滑，均一性好，无粘连。不同浓度三聚磷酸钠制备的壳聚糖微球大小一致，但其微观结构形貌孔径差别很大，3组微球微观结构孔径比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2C-c。

2%三聚磷酸钠所得的壳聚糖表面微观结构孔径最小，平均值为0.915 7 μm；5%三聚磷酸钠所得的壳聚糖表面微观结构孔径居中，平均值为4.775 μm；10%三聚磷酸钠所得的壳聚糖孔径最大，平均直径为9.407 μm。可见接受液三聚磷酸钠浓度明显影响壳聚糖微球表观结构孔径的大小。壳聚糖微观孔径太大有可能影响细胞的黏附，孔径太小有可能影响细胞的穿入，所以5%三聚磷酸钠下壳聚糖微球微观结构可能是最有利于临床牙周膜再生的支架结构。

2.2.4  含基质细胞衍生因子1α壳聚糖微球的缓释速率  每样本含有200 ng基质细胞衍生因子1α，37 ℃ 54 r/min恒温摇床振荡24 h后，生长因子释放速率达5 μg/L，此后释放率继续上升，4 d达最大，近10 μg/L，但之后缓慢下降，于25 d释放速率减至0.5 μg/L，见图2D。总之，壳聚糖微球具有大约1个月的缓释效能。



2.3  牙周仿生膜结构  首先，通过电纺技术在牙根表面黏附一层聚乳酸-羟基乙酸纤维膜，其厚度大约在30 μm，其表面黏附100 μm的壳聚糖微球，再外层薄薄一层聚乳酸-羟基乙酸将壳聚糖裹住，防止冻干后脱落，通过电纺技术和电喷技术形成了一个黏附牙根表面的三层仿生膜结构，见图3。

完全性牙脱位发生率高^[1]，原位再植后往往发生根骨粘连及根吸收，皆为牙周膜的缺失，使再植牙在承受咀嚼力时丧失缓冲、分散应力及感知等功能^[2]。天然牙周膜是连接牙齿和牙槽骨之间具有方向性的结缔组织，宽度为0.15-0.38 mm。组织工程的快速发展为脱位牙的牙周膜再生提供了新方向^[3]。细胞、支架、生长因子是组织工程的3大元素^[3-4]，其中支架是组织工程技术必需的外源性核心要素^[3]。

三维缓释支架材料在缺损修复中发挥着不可替代的占位作用^[5-6]。研究发现局部注射成纤维细胞生长因子并不能促进兔颅骨缺损的修复，而含有成纤维细胞生长因子的明胶可促进骨缺损的修复^[7]；局部应用渗透泵缓释胰岛素样生长因子不能促进骨修复，而微球载体的胰岛素样生长因子成功实现了骨缺损的修复^[8]。当牙齿脱离牙槽窝后牙周膜断裂，残留在脱位牙根表面的牙周膜由三维变成二维，丧失了支架膜的作用，导致脱位牙再植后根骨粘连，这可能是这些年来学者们尝试通过保护牙根表面残留的活细胞促进牙周膜再生尚未有突破性进展的根本原因^[9]。

如何研发一种能黏附牙根表面具有一定厚度及强度的三维缓释支架材料，是脱位牙牙周膜再生成功的关键之一。静电纺丝是高分子聚合物在电场下变成微小射流经一定距离固化成纤维的一种技术，为制备黏附在牙根表面的膜支架材料提供了可能性^[10]。电纺方向性聚己丙酯与壳聚糖层状组合支架，可促进大鼠牙周组织缺损的修复^[11]，电纺聚乳酸-羟基乙酸/明胶可促进生物牙根再生类牙周膜组织^[12]。因此研发出黏附在牙根表面的具有一定强度的多孔支架材料，可能解决脱位牙延迟再植的牙周膜再生难题。

生长因子具有半衰期短、易降解等缺点，其发挥有效、稳定的作用必须依赖支架缓释载体。壳聚糖为甲壳质的脱乙酰化产物，是自然界中唯一存在的碱性多糖，具有良好的生物相容性、安全性、生物可降解性^[13-14]。壳聚糖具有水溶性和带正电荷的特性，使其可与带负电荷的聚合物、大分子相互作用，从而可以应用于药物缓释系统^[15]，保护生长因子免受酶降解，保证其稳定缓慢释放^[16-17]。

所以，作者设想通过电纺技术获得黏附牙齿的聚乳酸-羟基乙酸电纺膜及电喷技术获得携带缓释生长因子的壳聚糖微球，形成黏附牙根表面聚乳酸-羟基乙酸电纺膜-中间壳聚糖微球-外层聚乳酸-羟基乙酸电纺膜3层仿生膜结构，构建脱位牙的牙周仿生膜。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2014年10月至2015年12月在浙江大学紫金港校区完成。

1.3  材料  聚乳酸-羟基乙酸购自山东省医疗器械研究所，壳聚糖(M_w=50 000，脱乙酰化大于90%)购自济南海德贝海洋生物工程有限公司，见表1；六氟异丙醇(Sigma，USA)；二氯甲烷、三氯甲烷(成都市化工试剂公司)；二甲基甲酰胺、三聚磷酸钠、冰乙酸(成都市科龙化工)；人基质细胞衍生因子1α ELISA酶联免疫试剂盒(RayBiotech，USA)。

1.4  方法

1.4.1  构建聚乳酸-羟基乙酸电纺膜  研究电纺溶剂对电纺膜的影响：①将称取适量相对分子质量10万的聚乳酸-羟基乙酸，加入按体积比52∶37混合的二氯甲烷和二甲基甲酰胺溶剂中，配成浓度110 g/L的聚乳酸-羟基乙酸溶液；②以三氯甲烷为溶剂，配成150 g/L的聚乳酸-羟基乙酸溶液；③以六氟异丙醇为溶剂，配成100 g/L的聚乳酸-羟基乙酸溶液。均于室温下搅拌3 h获得均匀的纺丝液。使用10 mL注射器针筒分别吸取上述配好的聚乳酸-羟基乙酸溶液，选用22号针头，调针头与收集辊的距离为15 cm，调正压为7.46 kV、负压为7.12 kV，注射速率为0.1 mm/min。用IPP软件定量分析电纺丝的直径大小、分布频率与孔隙率。

1.4.2  构建壳聚糖微球

壳聚糖相对分子质量及质量浓度对微球直径、形貌等的影响：用蒸馏水分别配制相对分子质量为5万的质量浓度为10，20 g/L的壳聚糖溶液及相对分子质量为10万的质量浓度为10 g/L的壳聚糖溶液，各加入1%乙酸，放在磁力搅拌器搅拌2 h至溶液搅匀，壳聚糖调pH=5.8。采用电喷方法及离子交联原理制备壳聚糖微球。将盛有5%三聚磷酸钠接受液的培养皿放到磁力搅拌器上低速搅拌，针头为22号不锈钢弯头，正压14 kV，速率为0.2 mm/min。反应完成后，离心、冲洗、离心、冷冻干燥。通过光镜及扫描电镜观察不同相对分子质量及质量浓度的壳聚糖溶液对电喷形成微球直径与形貌等影响。

电压对微球直径、形貌等的影响：选用相对分子质量为5万的质量浓度为20 g/L的壳聚糖溶液，5%的三聚磷酸钠接受液，采用电喷方法与离子交联原理制备壳聚糖微球，研究电压(14，28 kV)对壳聚糖微球直径、形貌等的影响。

不同浓度三聚磷酸钠接受液对微球直径、形貌等的影响：选用相对分子质量为5万的质量浓度为20 g/L的壳聚糖溶液，电压28 kV，采用电喷方法与离子交联原理制备壳聚糖微球，研究不同浓度三聚磷酸钠接受液(2%，5%，10%)对构建壳聚糖微球直径、形貌等的影响。

检测壳聚糖微球缓释基质细胞衍生因子1α的速率：按200 µg/L制备含有基质细胞衍生因子1α的壳聚糖微球，将 1 mL壳聚糖溶液制备的微球冷冻干燥，环氧乙烷消毒后备用，得到含基质细胞衍生因子1α壳聚糖微球。将4个微球样本置入2 mL冻存管中，加入0.5-1 mL pH=7.3的PBS中，置于37 ℃恒温振荡培养器中，振荡速率54 r/min，分别于第1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25天3 500 r/min离心5 min后取上清液，按照Elisa试剂盒说明检测上清液生长因子的含量。

1.4.3  构建牙周仿生膜  选用相对分子质量10万的聚乳酸-羟基乙酸，以六氟异丙醇为溶剂，配成100 g/L的聚乳酸-羟基乙酸溶液，在调针头与收集辊的距离为15 cm，调正压为7.46 kV、负压为7.12 kV， 注射速率为0.1 mm/min，制作电纺聚乳酸-羟基乙酸膜，经体积分数70%乙醇泡洗后将其裹在牙根表面。然后选择相对分子质量为5万的质量浓度为20 g/L的壳聚糖溶液，5%的三聚磷酸钠接受液，电业28 kV，采用电喷方法与离子交联原理制备壳聚糖微球。将得到的壳聚糖微球以去离子水清洗3遍，离心后黏附在牙根聚乳酸-羟基乙酸膜表面，最后在其外层裹一层薄薄的聚乳酸-羟基乙酸，从而形成聚乳酸-羟基乙酸-壳聚糖微球-聚乳酸-羟基乙酸膜。

1.5  主要观察指标  不同电纺溶剂对聚乳酸-羟基乙酸电纺膜的影响；壳聚糖相对分子质量与质量浓度、三聚磷酸钠接受液浓度、电压对壳聚糖微球的影响。

支架是组织工程技术必需的外源性核心要素，在组织缺损修复中发挥不可替代地空间占位及缓释载体作用。聚乳 酸-羟基乙酸是聚乳酸和聚乙醇酸按照一定比例结合的共聚物。聚乳酸分子中有侧甲基，所以亲水性较差，但降解速率慢；与其相反，聚乙醇酸亲水性较好，但降解速率过快，所以将两者按不同的比例共聚成具有不同力学性能和降解速率的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，就可以达到不同实验要求的生物材料^[18]。此次实验为了达到相对高强度、降解时间长、生物相容性更好，选取聚乳酸∶聚乙醇酸=75∶25，不同溶剂下聚乳酸-羟基乙酸电纺最佳浓度比不一致，但形成的最佳电纺丝直径差异不大，无统计学差异。

基质细胞衍生因子1α是经典的趋化因子，可召集干细胞及相关细胞方向性移动^[19]。快速牵张成骨技术是传统牵张成骨速率的2倍，但由于成骨速度跟不上牵张的速率导致快速牵张成骨失败。但局部应用基质细胞衍生因子1可加快召集内皮前体细胞至牵张部位，从而使快速牵张技术成功^[20]。KIM等^[21]用3D打印技术制备了具有孔隙的牙齿模样聚己内酯-羟基磷灰石支架材料，将含有基质细胞衍生因子1及骨形态发生蛋白7的胶原灌注于支架材料空隙中，植入大鼠切牙的牙槽窝或者皮下，9周后发现生长因子组血管形成数量多，细胞多，类牙周组织形成。

实验选择离子交联法制备壳聚糖微球，离子交联法利用酸性环境下壳聚糖呈阳离子性，向壳聚糖溶液中边搅拌边滴加三聚磷酸钠，带负电的磷酸根离子与壳聚糖分子链上带正电荷的氨基通过静电吸附，从而形成微球^[22-23]。此方法适用于亲水性药物，在制备过程中没有有机试剂的参与，不影响生长因子的蛋白活性^[24-25]。

实验进一步研究了电喷壳聚糖微球相关参数的关系，发现壳聚糖微球的直径受壳聚糖相对分子质量、质量浓度及电压因素影响较大。相对分子质量5万、20 g/L壳聚糖电喷微球大小一致，饱满；电压越大壳聚糖微球直径越小。接受液浓度对壳聚糖直径影响不大，但对微球微观外貌结构孔隙影响较大。随着接受液浓度的增大，微球表面结构孔隙增大，其表面形貌结构是否对生长因子释放速率有影响尚需进一步实验验证。以往研究也证实，壳聚糖相对分子质量及接受液浓度对微球直径影响不大^[26-28]。

实验通过电纺成功获得黏附牙根表面的聚乳酸-羟基乙酸膜，同时电纺膜的多孔结构为中间层的缓释微球提供了附着点，在其外层裹有一层薄薄的聚乳酸-羟基乙酸电纺膜，避免冷冻干燥后壳聚糖微球从牙根表面脱落，从而形成了适用于脱位牙的三维仿生膜，后续将进一步通过体内外实验研究此仿生膜对脱位牙牙周再生的作用。

实验创建了一种黏附牙齿表面的具有缓释效能的聚乳酸-羟基乙酸-壳聚糖微球-聚乳酸-羟基乙酸三维仿生膜并筛选出构建此仿生膜的最佳参数，可在此基础上进一步研究组织工程手段对脱位牙再植的效果及机制，为脱位牙再植提供新的思路及方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

离子交联法制备壳聚糖微球：离子交联法利用酸性环境下壳聚糖呈阳离子性，向壳聚糖溶液中边搅拌边滴加三聚磷酸钠，带负电的磷酸根离子与壳聚糖分子链上带正电荷的氨基通过静电吸附，从而形成微球。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

实验的创新在于分别通过电纺、电喷技术及真空冷冻干燥成功制备了粘附牙根表面的聚乳酸-羟基乙酸电纺膜及壳聚糖电喷微球复合仿生牙周膜。通过研究电纺溶剂种类、壳聚糖浓度、接受液浓度及电压等参数对构建仿生膜的影响筛选其最佳参数。以经典趋化因子基质细胞衍生因子1为例，将其溶于壳聚糖溶液制备出缓释生长因子壳聚糖微球，结果证实壳聚糖微球可释放基质细胞衍生因子1长大1个月余，提示可以脱位牙再植后早期提供较多的生长因子量，并满足较长时间对生长因子需求， 是良好的脱位牙仿生膜支架。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程