高压氧联合依达拉奉干预耳撕脱模型兔的皮瓣成活

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1184

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
皮肤撕脱伤：皮肤撕脱伤是由于车轮或机器传动带等产生的外力作用致皮肤和皮下组织从深筋膜深面或浅面强行剥脱，同时伴有不同程度的软组织碾挫损伤，受累皮肤常因缺血发生大面积坏死。
自由基清除剂：能将自由基还原为非自由基的氧化剂称为自由基清除剂。自由基清除剂是指具有延迟、抑制和阻断活性氧/氧自由基氧化损伤的物质的总称，是能够与氧自由基结合并使之清除的机体保护剂。因此，在机体正常过程中以及保护细胞和组织免受氧化损伤中具有重要作用。

摘要
背景：早期给予高压氧辅助治疗对外伤皮瓣术后患者进行处理，能够减轻水疱、肿胀等症状，使皮瓣的成活率提高，依达拉奉能够有效清除皮瓣损伤区自由基。
目的：探讨高压氧处理联合依达拉奉治疗对兔撕脱皮瓣成活的影响及机制。
方法：54只健康新西兰白兔由苏州医学院实验动物中心提供。于兔左耳背中央形成1.5 cm×8 cm中央动脉为蒂的矩形皮瓣，应用特殊装置造成碾压撕脱伤，造模成功48只，随机分为4组，每组12只，原位缝合后各组连续治疗3 d。对照组不予任何处理；高压氧组予以高压氧治疗；依达拉奉组尾静脉注射依达拉奉 3 mg/(kg ? d)；联合组予以高压氧治疗的同时予以依达拉奉治疗；在治疗后第3天观察皮瓣的微循环变化，治疗后第7天测量皮瓣的成活面积，取存活皮瓣组织苏木精-伊红染色进行组织学观察，RT-PCR和Western Blot检测皮瓣组织细胞间黏附分子1、血管内皮细胞黏附分子1的表达。
结果与结论：①激光多普勒和红外线热成像系统检查显示，在联合组血流灌注能达到皮瓣的远端，高压氧组和依达拉奉组血流灌注能够达到皮瓣的中段，而对照组仅能达到近段；②联合组皮瓣存活显著高于其他3组(P < 0.05)，依达拉奉组和高压氧组显著高于对照组(P < 0.05)；③联合组炎性细胞浸润程度极低，而对照组炎性细胞浸润程度明显高于高压氧组和依达拉奉组；④RT-PCR和Western Blot检测示细胞间黏附分子1、血管内皮细胞黏附分子1基因和蛋白的表达联合组最低(P < 0.05)，高压氧组和依达拉奉组显著低于对照组(P < 0.05)；⑤结果说明，高压氧处理联合联合依达拉奉治疗能够有效促进兔耳撕脱皮瓣成活，其机制与降低兔耳皮瓣损伤过程中细胞间黏附分子1、血管内皮细胞黏附分子1的表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1202-6542(闫贵春)

关键词: 高压氧, 依达拉奉, 兔耳, 撕脱皮瓣, 皮瓣, 血流灌注, 血管内皮细胞, 细胞间黏附分子1

Abstract:

BACKGROUND: Early application of hyperbaric oxygen adjuvant therapy can relieve blisters, swelling and other symptoms, and thus improves the survival rate of skin flaps. Edaravone can effectively eliminate free radicals in the injured area of skin flaps.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of hyperbaric oxygen combined with edaravone on the survival rate of avulsed flap in rabbits.
METHODS: Fifty-four healthy New Zealand white rabbits were provided by Laboratory Animal Center of Medical Collage of Soochow University. A 1.5 cm x 8 cm pedicled rectangle flap of the rabbit central artery was made on the middle of the rabbit left ear back, and created crush injury using special device. The 48 model rabbits were randomly divided into four groups (n=12/group), and received no intervention (control group), hyperbaric oxygen therapy, 3 mg/kg•d edaravone injection via tail vein, or hyperbaric oxygen therapy combined with edaravone (combination group), for 3 continuous days. The microcirculation of skin flap was observed at 3 days after treatment. The flap survival area was measured at 7 days after treatment. The survived flap was removed for hematoxylin-eosin staining. The expression levels of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule 1 in flap tissue were detected by RT-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Laser doppler and infrared thermal imaging system showed that the blood perfusion reached the distal segment of skin flap in the combination group, reached the middle segment of skin flap in the hyperbaric oxygen and edaravone groups, and reached the proximal segment of skin flap in the control group. (2) The survival rate of flap in the combination group was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.05). The survival rate in the edaravone and hyperbaric oxygen groups was significnatly higher than that in the control group (P < 0.05). (3) The degree of inflammatory infiltration in the combination group was significantly low, and the degree of inflammatory infiltration in the control group was significantly higher than that in the hyperbaric oxygen and edaravone groups. (4) The mRNA and protein expression levels of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule 1 detected by RT-PCR and western blot assay were lowest in the combination group (P < 0.05), and the levels in the hyperbaric oxygen and edaravone groups were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). (5) To conclude, hyperbaric oxygen combined with edaravone can effectively promote the survival of rabbit ear avulsed skin flap, which is related to the decreased expression of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule 1.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Hyperbaric Oxygenation, Surgical Flaps, Intercellular Adhesion Molecule-1

中图分类号:

R446，R318

闫贵春. 高压氧联合依达拉奉干预耳撕脱模型兔的皮瓣成活[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(15): 2380-2384.

Yan Guichun. Hyperbaric oxygen combined with edaravone for flap survival in rabbit models of ear tear injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(15): 2380-2384.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选用造模成功的新西兰白兔48只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 皮瓣的微循环变化术后3 d，应用激光多普勒对各组微循环变化情况进行比较发现：相对于对照组血流灌注仅达近段而言，高压氧及依达拉奉组能够达到皮瓣的中段，联合组则能够达到远段(P < 0.05)；而高压氧和依达拉奉组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。见表1。

2.3 皮瓣的成活面积比较每日对各组皮瓣进行观察发现：各组在0.5 h内出现青紫、水肿，以24 h最为明显。3 d后，除对照组外，其他各组皮瓣中段的青紫情况开始减轻，以联组合最为明显；同时，所有组皮瓣的远段开始出现发黑、活力丧失，坏死部分呈现不清楚的边界，7 d后边界开始变得清晰，此时对各组皮瓣进行摄像并对成活面积进行比较，结果显示：皮瓣的存活面积百分比在对照组为(20.21±3.11)%，明显低于高压氧组的(43.72±3.54)%，依达拉奉组的(44.38±2.69)%及联合组的(63.84±4.38)%(P 均< 0.05)，且以联合组的存活百分比为最高(P < 0.05)。

2.4 存活皮瓣组织行苏木精-伊红染色后比较术后7 d将各组动物处死，取组织行病理切片检查发现：对照组的正常结构被破坏，可见黏液样变性组织，血管内满布血栓，单核及白细胞浸润严重，并能够见到新生的毛细血管。高压氧组及依达拉奉组血管壁结构不完整，可见血栓形成，并能见到炎性细胞浸润。而联合组的组织结构基本正常，有完整的血管壁，仅见少量的单核和中性粒细胞浸润。见图1。

2.5 RT-PCR检测其ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达RT-PCR测定结果发现，模型组中ICAM-1、VCAM-1mRNA表达量明显增加，而高压氧组和依达拉奉组较低，联合组为最低(P均<0.05)；而高压氧和依达拉奉组的差异无显著性意义(P > 0.05)。见表2，图2。

2.6 Western Blot检测其ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达应用Western blot法于7 d时对各组蛋白表达量比较发现，联合组、高压氧组及依达拉奉组均较对照组低，且以联合组更明显(P < 0.05)。见表3，图3。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年10月至2017年10月在华北煤炭医学院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物选取发育良好，体质量相近的健康新西兰白兔54只，雌雄各半，新西兰白兔由苏州医学院实验动物中心提供，许可证号SYXK(苏)2012-0045。

1.3.2 实验试剂与材料依达拉奉(昆明积大制药有限公司)、苏木精-伊红染色试剂盒(HE试剂盒)(武汉博士德生物工程有限公司)、荧光定量PCR仪(江苏和创生物科技有限公司)、Trizol试剂盒(BioTNT公司)、siRNA及PCR引物由广东瑞博生物有限公司合成、β-actin 抗体、抗细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管内皮细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)抗体(兔抗鼠)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Santa Cruz 公司)。医用图像分析系统(苏州医学院附属医院)、整形外科手术器械(苏州医学院附属医院)、奥林巴斯光学显微镜(苏州医学院附属医院)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型建立和分组

(1)动物模型建立：动物禁食过夜，麻醉后置于木板上固定好，对皮肤进行消毒，用电动剪剪除耳部兔毛，体积分数75%乙醇消毒，于兔左耳后中部设计1.5 cm×8 cm蒂矩形皮瓣，任意皮瓣内不包含知名血管。将模型机开启开关，调节速度为75 r/min后，放入制作好的皮瓣，推轮以此速滚压，这个操作重复3次以上，建好兔耳皮瓣碾压伤模型，使用特殊装置造成碾压撕脱伤，造模成功48只。为减少误差，上述实验均由同一人操作。

(2)实验分组：将48只建模完成的新西兰白兔随机分为4组，每组12只，雌雄各半，原位缝合后各组连续处理3 d。①对照组：不予任何处理；②高压氧组：给予高压氧处理，造模后4 h置于高压氧舱内，以纯氧洗舱15 min后，按 0.01 MPa/min的速率匀速加压到0.2 MPa，稳压30 min，间断加纯氧使氧浓度维持在96.5%以上，随后匀速减压 10 min后至常压，出舱后常规喂养。每日治疗4次。连续治疗3 d；③依达拉奉组：予以依达拉奉治疗尾静脉注射依达拉奉3 mg/(kg•d)，连续治疗3 d；④联合组：予以高压氧处理的同时予以依达拉奉处理，连续处理3 d。

1.4.2 兔耳活体微循环的显微镜观察首先制作好观察窗，透过观察窗部分把制作好的皮瓣平展，放在显微镜载物台上，在皮瓣碾压前后，肉膜面朝上进行观察。分别记录辗压前后微动脉血流速，白细胞黏附及血栓产生等微循环等差异，照相并摄影，用NIS Free Ware2.0图像处理软件对数据进行处理分析。所有观察过程在同一室温下进行^[12]。

1.4.3 皮瓣存活率检测处理3 d后，用美蓝将皮瓣轮廓及坏死位置圈出，用硫酸试纸进行临描，这样不同部位就被不同颜色区分开来了，经扫描，利用计算机全自动图像分析系统求出皮瓣存活率。治疗7 d测量皮瓣的成活面积。皮瓣存活面积的百分率=皮瓣存活面积/皮瓣面积。

1.4.4 苏木精-伊红染色治疗7 d后，麻醉下处死白兔，取存活皮瓣进行苏木精-伊红染色。①于皮瓣中远2/3处切去约5 mm×5mm 大小的标本，固定用体积分数4%甲醛溶液，经石蜡包埋切4 μm片；②用二甲苯脱蜡对切片进行处理，然后作如下处理：二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min→100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→ 75%乙醇 1 min→蒸馏水洗2 min(各2次，然后把水吸干)；③苏木精染色5 min，水清洗(吸干水)；④盐酸乙醇分化30 s；⑤自来水浸泡15 min或温水(约50 ℃)5 min(吸干水)；⑥置伊红液 2 min；⑦常规脱水，透明，封固：95%乙醇(Ⅰ)1 min→95%乙醇(Ⅱ)1 min→100%乙醇(Ⅰ)1 min→100%乙醇(Ⅱ) 1 min→二甲苯石炭酸(3∶1)1 min→二甲苯(Ⅰ)1 min→二甲苯(Ⅱ)1 min→中性树脂封固。在高倍镜下进行组织形态学观察。

1.4.5 RT-PCR检测ICAM-1、VCAM-1 mRNA的表达将存活皮瓣剪碎后置于1.5 mL的无RNA酶的EP管中，与液氮一起进行研磨，然后加入1 mL的TRIzol，之后采用TRIzol法按照相关说明进行操作，首先提取出总的RNA，然后从其中取出量约2 μL的RNA进行反转录反应，转录产物为cDNA。将反转录得到的特定片段作为PCR反应的模板进行PCR反应，整个操作根据相关试剂盒的说明进行。设计 qPCR引物序列如下，ICAM-1的上游引物：5'-CCT CAC ACT TCA CTG TCA CCT-3'，下游引物：5'-CGT GCC GCA CTG AAC TGG AC-3'，VCAM-1的上游引物：5'-ATC CCT ACC ATT GAA GAT ACT GG-3'，下游引物：5'-TGA TGA CAG TTC TCC TTC TTT G-3'，内参GAPDH的上游引物：5'-GAG TCA ACG GAT TGG TCG T-3'，下游引物： 5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3'。PCR引物序列参照文献[13]。qPCR反应条件：95 ℃ 5 min(预变性)， 95 ℃ 5 s (变性)，60 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 30 s(延伸)，25个循环，终延伸72 ℃ 8 min。将PCR产物经过电泳后将其置于凝胶图像分析仪上对成像进行自动分析。

1.4.6 Western blot法检测ICAM-1、VCAM-1 蛋白的表达将存活皮瓣剪碎后用锡箔纸包好放入液氮，之后再跟液氮一起进行研磨，然后与蛋白裂解液(1%蛋白酶抑制剂)一起移入匀浆器进行裂解蛋白，待蛋白裂解完毕时，调整离心机至12 000 r/min状态进行离心，15 min后使用胶头滴管吸取中间清亮层，对其中蛋白进行收集，将收集的蛋白经过BCA 法分析进行蛋白的定量，最后将其置于特定条件下进行保存。从保存的样本中取少量蛋白，分别经过电泳分离及转膜后，将其置于室温条件下摇床封闭1 h；1 h后将膜剪开放在2个器皿中，分别向其中加入抗ICAM-1、VCAM-1的一抗(1∶5 000)，随后将其置于4 ℃条件下进行过夜处理，再用TBS洗液进行洗膜，洗涤3次，洗膜完毕后分别向各组中滴加经过辣根过氧化物酶处理的二抗，二抗 (1∶2 000)添置完毕置于室温条件下进行孵育，1 h后再次用TBS进行洗膜，以上所有操作均完成后，最后分别向其中加入发光工作液A液和B液，随后在曝片机上曝光，内参是β-actin，对各组图像进行分析及比较，操作中所使用的软件为Alpha Digi Doc图像分析软件^[14]。

1.5 主要观察指标 ①观察皮瓣的微循环变化；②皮瓣的成活面积；③存活皮瓣组织学观察；④RT-PCR和Western Blot检测皮瓣组织ICAM-1、VCAM-1的mRNA及蛋白表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)对实验中所有数据进行处理分析，计量资料均以x(_)±s表示，组间比较首先检验资料的正态性和方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验法，P < 0.05为差异有显著性学意义。

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讨论

皮肤撕脱损伤的发病率一直逐年上升，其特有的损伤常造成组织的大面积坏死。目前临床上多采用的措施是先彻底切除碾压组织，然后进行植皮或皮瓣转移等方法进行创面修复，多数情况下能够挽救患者的生命和肢体，但常常产生后移畸形^[15-21]。研究撕脱伤的最首要的目的是使存活皮瓣尽可能多地得以保留，治疗效果更加明显。皮肤受损后往往产生组织的大面积损毁，主要是原发和继发性坏死两种^[22-24]。皮瓣存活面积的大小和血管内皮细胞的结构受损程度有关，一般表现在：①血管内皮受损加剧白细胞贴壁黏附，附近大量炎分子浸润，P、L、E三种黏性因子介导其运动，造成在毛细血管内大量微血栓产生；②血管内皮细胞损伤脱落，血小板在创伤处聚集成团，产生血栓，阻塞微血管，造成微循环障碍，使局部缺血、缺氧最终损伤皮瓣；③血流量明显降低。以往研究显示，皮瓣继发性死亡的重要原因是血液循环系统受损，尤其是微循环系统，动脉缺血、静脉淤血。

此次研究在模型的建立过程中，能够通过增减砝码的质量从而对压力和牵拉力进行调控，通过滚动的圆形铁棒对动物进行碾压，几近真实地反映了现实生活中最为常见的因转轴或车轮而造成的碾压撕脱伤。该模型的另一大特色是撕脱力与碾压力之间存在关联，即在碾压时放置的砝码越重，造成的碾压力就会更大，使拉动皮瓣所用的力更大，最终出现的撕脱伤就越重，这和现实生活中受损伤的情况相类似。总体而言，该模型简单易行、重复性好；但为了预防动物在碾压过程中受伤，在实际工作中由1人来保护白兔，另1人拉动砝码进行碾压，所以实际的牵拉力会有偏差。此次实验结果显示：在联合组血流灌注最高，对照组最低；苏木精-伊红染色可见，联合组炎性细胞浸润程度极低，而对照组炎性细胞浸润程度显著高于高压氧组和依达拉奉组。RT-PCR以及Western Blot检测示ICAM-1、VCAM-1基因和蛋白的表达联合组最低，高压氧组和依达拉奉组较低。结果表明高压氧处理联合联合依达拉奉治疗能够有效促进兔耳撕脱皮瓣成活。

作为一种自由基清除剂，依达拉奉可去除自由基，控制脂质过氧化，通过遏制血管内皮细胞对撕脱皮瓣受损发挥作用。ICAM-1和VCAM-1是血管细胞黏附分子，使炎症处的粘连性得以增强，并且调控肿瘤转移、恶化以及机体效应等。它通过与其受体的特异性结合，增强这些白细胞、炎症细胞和肿瘤细胞和内皮细胞间的黏附作用，活化内皮细胞，使之更易穿透内皮。由于受到P-，E-，L黏附分子的调控，白细胞暂时于附近的内皮细胞结合，在这种反复黏附和脱离过程中，白细胞与CD31等活性分子的接触使白细胞的黏附活性得以激活，从而使ICAM-1，ICAM-2，VCAM-1等黏附分子更易于与之结合。而高压氧可降低血小板的聚集力，抑制血小板大量释放5-羟色胺，改善脑微循环状态和患者的机体循环，对受损细胞的恢复发挥作用^[25-30]。所以得出结论高压氧处理联合联合依达拉奉治疗能够有效的促进兔耳撕脱皮瓣成活，其机制与兔耳皮瓣损伤过程中ICAM-1、VCAM-1的降低表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程