神经生长因子β对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1170

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (15): 2373-2379.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1170

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神经生长因子β对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的影响

陈德平1，刘盛泽1，陈实1，从长春2，刘树义3，肖颖4

(厦门大学附属福州第二医院，1神经外科，4病理科，福建省福州市 350007；2厦门大学附属翔安医院神经外科，福建省厦门市 361000；3西安医学院，陕西省西安市 710000)

收稿日期:2018-12-24 出版日期:2019-05-28 发布日期:2019-05-28
通讯作者: 刘盛泽，主任医师，教授，硕士生导师，厦门大学附属福州第二医院神经外科，福建省福州市 350007
作者简介:陈德平，男，1985年生，安徽省马鞍山市人，汉族，厦门大学在读硕士，主要从事脊柱脊髓的研究。
基金资助:
福建省自然科学基金资助项目(2017J01336)，项目负责人：刘盛泽；福州市卫生计生系统科技计划项目(2015-S-wt1)，项目负责人：刘盛泽

Effect of nerve growth factor-beta on proliferation of intraspinal schwannomas

Chen Deping1, Liu Shengze1, Chen Shi1, Cong Changchun2, Liu Shuyi3, Xiao Ying4

(1Department of Neurosurgery, 4Department of Pathology, Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University, Fuzhou 350007, Fujian Province, China; 2Department of Neurosurgery, Xiang’an Hospital Affiliated to Xiamen University, Xiamen 361000, Fujian Province, China; 3Xi’an Medical University, Xi’an 710000, Shaanxi Province, China)

Received:2018-12-24 Online:2019-05-28 Published:2019-05-28
Contact: Liu Shengze, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Neurosurgery, Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University, Fuzhou 350007, Fujian Province, China
About author:Chen Deping, Master candidate, Department of Neurosurgery, Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University, Fuzhou 350007, Fujian Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2017J01336 (to LSZ); the Science and Technology Program of Fuzhou Health System, No. 2015-S-wt1 (to LSZ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
椎管内神经鞘瘤：又名椎管内许旺细胞瘤，在脊髓肿瘤中发病率占首位，整个椎管的各个节段均可发生，大多为单发，好发于脊髓外硬膜下，多位于脊髓的侧面，起源于脊神经根，多数为良性肿瘤，极少数可发展为恶性肿瘤，多见于成年人，性别差异不大。临床表现为肢体麻木、疼痛、无力以及尿便功能障碍等。
NGF/TrkA信号通路：神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)结合TrkA 受体可导致受体二聚化，激活内在激酶活性，从而引起多种信号通路的激活，包括RAS/MAPK，PI3K/AKT 和PLCγ通路等，该信号通路与肿瘤发生、增殖、血管生成以及转移等相关，且目前对该信号通路的研究主要集中于人的恶性肿瘤，如胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌等。

摘要
背景：研究已经证实，在人的良恶性肿瘤中NGF/TrkA信号通路促进肿瘤细胞增殖、分化的效应与PI3K/AKT信号通路密切相关，然而，关于NGF/TrkA信号通路在椎管内神经鞘瘤发病机制的研究甚少。
目的：观察神经生长因子β对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的影响及初步研究NGF/TrkA信号通路在椎管内神经鞘瘤中的发病机制。
方法：收集肿瘤标本并消化培养获得高纯度肿瘤细胞作为实验细胞；分别给予细胞不同浓度的神经生长因子β(15，30，60，120，240 μg/L)、K252a(100，200，300，400，500，600 nmol/L)、LY294002(10，20，30，40，50，60 μmol/L)、神经生长因子β(120 μg/L)+K252a(TrkA受体抑制剂，400 nmol/L)、神经生长因子β(120 μg/L)+LY294002(PI3K抑制剂，50 μmol/L)作用一定时间；通过MTT法评估细胞增殖情况，Western blot检测TrkA、AKT、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达情况，RT-PCR检测TrkA、AKT蛋白质对应的mRNA表达情况。
结果与结论：①与对照组比较，神经生长因子β组细胞吸光值(A值)随神经生长因子β的质量浓度增加而升高(P < 0.05)，于120 μg/L时升高幅度最大(P < 0.001)，K252a、LY294002组细胞A值不断下降(P < 0.05)，分别于浓度400 nmol/L、50 μmol/L时下降幅度最大(P < 0.001)；②神经生长因子β组中TrkA、p-AKT (Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达上调(P < 0.05)，TrkA mRNA的表达也上调(P < 0.05)；③神经生长因子β(120 μg/L)+K252a(400 nmol/L)组细胞A值下降(P < 0.001)，TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达下调(P < 0.05)，TrkA mRNA的表达亦下调(P < 0.05)；④神经生长因子β(120 μg/L)+LY294002 (50 μmol/L)组细胞A值下降(P < 0.01)，p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达下调(P < 0.05)；⑤各组中AKT蛋白质及其对应的mRNA的表达无明显变化(P > 0.05)；⑥结果表明，神经生长因子β能够促进椎管内神经鞘瘤细胞增殖，其增殖可能与NGF/TrkA信号通路中TrkA、p-AKT(Ther308)及p-GSK-3β等蛋白质的表达水平有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7866-477X(陈德平)

关键词: 椎管内神经鞘瘤, 神经生长因子β, 肿瘤细胞增殖, 椎管, 椎管内肿瘤, NGF/TrkA信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Existing evidence has shown that that the effect of NGF/TrkA signaling pathway on proliferation and differentiation of tumor cells is closely related to PI3K/AKT signaling pathway in human benign and malignant tumors. However, there is little information on the NGF/TrkA signaling pathway in pathogenesis of intraspinal schwannomas.
OBJECTIVE: To investigate the effect of nerve growth factor-beta on the proliferation of interspinal schwannoma cells and to explore on the pathogenesis of NGF/TrkA signaling pathway in interspinal schwannoma.
METHODS: Tumor samples were collected and digested to obtain high purity tumor cells as experimental cells. Then the cells were given different concentrations of nerve growth factor-beta (15, 30, 60, 120 and 240 μg/L), K252a (100, 200, 300, 400, 500 and 600 nmol/L), LY294002 (10, 20, 30, 40, 50 and 60 μmol/L), nerve growth factor-beta (120 μg/L) plus K252a (TrkA inhibitor, 400 nmol/L), and nerve growth factor-beta (120 μg/L) plus LY294002 (P13K inhibitor, 50 μmol/L), respectively, for a certain time. The cell proliferation was detected by MTT assay. TrkA, AKT, p-AKT (Ther308), p-GSK-3 beta protein expression was detected by western blot assay. TrkA and AKT mRNA expression was detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the absorbance value of cells in the nerve growth factor-beta groups was increased in a concentration-dependent manner (P < 0.05), and increased obviously at the concentration of 120 μg/L (P < 0.001). The absorbance value of cells in the K252a and LY294002 groups was decreased continuously (P < 0.05), and decreased obviously at the concentration of 400 nmol/L and 50 μmol/L, respectively (P< 0.001). (2) The expression levels of TrkA, p-AKT (Ther308), and p-GSK-3 beta protein were upregulated in the nerve growth factor-beta group (P < 0.05), and the expression level of TrkA mRNA was upregulated (P < 0.05). (3) In the nerve growth factor-beta (120 μg/L) plus K252a (400 nmol/L) group, the absorbance value of cells decreased (P < 0.001). The expression levels of TrkA, p-AKT (Ther308), and p-GSK-3 beta protein downregulated (P < 0.05), and the expression level of TrkA mRNA downregulated (P < 0.05). (4) In the nerve growth factor-beta (120 μg/L) plus LY294002 (50 μmol/L) group, the absorbance value of cells decreased (P < 0.01), and the expression levels of p-AKT (Ther308), and p-GSK-3 beta protein downregulated (P < 0.05). (5)There was no significant change in AKT protein and mRNA in each group (P > 0.05). (6) These results suggest that nerve growth factor-beta can promote interspinal schwannoma cell proliferation, which may be related to the expression of TrkA, p-AKT (Ther308) and p-GSK-3 beta protein in NGF/TrkA signaling pathway.

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Key words: Spinal Canal, Neurilemmoma, Signal Transduction, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

陈德平, 刘盛泽, 陈实, 从长春, 刘树义, 肖颖. 神经生长因子β对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(15): 2373-2379.

Chen Deping, Liu Shengze, Chen Shi, Cong Changchun, Liu Shuyi, Xiao Ying. Effect of nerve growth factor-beta on proliferation of intraspinal schwannomas[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(15): 2373-2379.

图/表（结果） 2

2.1 各组对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的影响 ①神经生长因子β组中随其质量浓度的升高，椎管内神经鞘瘤细胞 A值逐渐升高(P < 0.05)，并呈浓度依赖性，在质量浓度为 120 μg/L时升高幅度最大(P < 0.001)，其后随神经生长因子β浓度增加，其作用与质量浓度120 μg/L无明显差异(P > 0.05)；②用最适浓度120 μg/L神经生长因子β行椎管内神经鞘瘤细胞培养，与对照组比较，培养至36 h，A值升高变化幅度最大(P < 0.001)；③K252a组随浓度增加，椎管内神经鞘瘤细胞A值逐渐降低(P < 0.05)，浓度为400 nmol/L时降低幅度最大(P < 0.001)；④LY294002组随其浓度增加，椎管内神经鞘瘤细胞 A值亦逐渐降低(P < 0.05)，浓度为50 μmol/L时下降幅度最大(P < 0.001)，见图3；⑤神经生长因子β(120 μg/L)组细胞A值升高(P < 0.001)，神经生长因子β(120 μg/L)+K252a(400 nmol/L)组(P < 0.001)和神经生长因子β(120 μg/L)+LY294002(50 μmol/L)组(P < 0.01)细胞A值下降，见图4。

2.2 Western blot及RT-PCR ①与对照组比较，神经生长因子β组中TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达上调(P < 0.05)，TrkA蛋白质对应的mRNA的表达亦上调(P < 0.05)，而AKT蛋白质及其对应的mRNA的表达变化不明显(P > 0.05)，见图5；②与对照组比较，神经生长因子β (120 μg/L)组TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达上调(P < 0.05)，TrkA蛋白质对应的mRNA的表达亦上调(P < 0.05)；③神经生长因子β(120 μg/L)+K252a (400 nmol/L)组TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达下调(P < 0.05)，TrkA蛋白质对应的 mRNA的表达亦下调(P < 0.05)；④神经生长因子β(120 μg/L)+LY294002 (50 μmol/L)组p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达下调(P < 0.05)，而TrkA蛋白质及其mRNA的表达变化不明显(P > 0.05)。上述各组AKT蛋白质及其mRNA均无明显变化(P > 0.05)，见图6。

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引言

椎管内神经鞘瘤(Intraspinal schwannomas，IS)是常见的椎管内病变之一，肿瘤多为良性，约占椎管内肿瘤的25%^[1]，其起源于背侧脊神经，Verocay在1910年首次将其描述为神经鞘瘤^[2]。神经鞘瘤中许旺细胞占所有细胞的大部分，故又称许旺氏鞘瘤，并认为其起源细胞为许旺细胞。椎管内神经鞘瘤可发生于任何年龄，以40-60岁成年人多见，90%单发^[3]，男性发病率略高于女性，但无统计学意义^[4]。其对人体危害主要是瘤体压迫脊髓和神经造成肢体疼痛、麻木、功能障碍甚至瘫痪，目前手术是治疗椎管内神经鞘瘤唯一有效的方法^[5-6]，且术后预后良好。但对于多发、难以全切、残留的鞘瘤存在一定复发倾向、合并多种基础病不能耐受手术以及瘤体小无临床症状和手术指征的椎管内神经鞘瘤患者，现暂无特殊药物可供选择治疗，所以对椎管内神经鞘瘤发病机制的研究可能为开发这类药物提供一定的依据，然而目前仅有研究报道椎管内神经鞘瘤的发生、发展可能与神经纤维瘤病2基因的失活突变有关^[7-9]。

近年来关于神经生长因子(nerve growth factor，NGF)/TrkA信号通路在肿瘤中的作用已有大量的研究。Hondermarck等^[10]发现乳腺癌中神经生长因子是作为一种分泌/自分泌因子在肿瘤细胞的存活和增殖过程中发挥促进作用，并存在神经生长因子及TrkA受体过度表达。Ruggeri等^[11]研究发现晚期人神经母细胞瘤中存在TrkA的高表达，且与预后不良相关，Yu等^[12]也证实了卵巢癌组织中神经生长因子、TrkA基因阳性的细胞数明显高于正常卵巢组织，同样，尤文肉瘤中神经生长因子及其受体TrkA均有表达^[13]。梁家宏等^[14]研究证实神经生长因子和TrkA与结直肠癌的发生、发展和浸润转移关系密切。然而对于该信号通路在椎管内神经鞘瘤中发病机制的研究尚未见报道，推测其与椎管内神经鞘瘤的发生、发展、增殖也可能存在密切的关系。所以此次实验对NGF/TrkA信号通路在椎管内神经鞘瘤中的发病机制进行了初步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点于2017年4月至2018年6月在福建中医药大学中心实验室及中西医结合实验室完成。

1.3 材料 Anti-TrkA抗体、Anti-AKT抗体、Anti-p-GSK-3β抗体、LY294002(PI3K抑制剂)、K252a(TrkA受体抑制剂)购自Abcam公司，Anti-p-AKT(Ther308)抗体购自CST公司，神经生长因子β(β-NGF)购自PeProTech公司，RNA抽提试剂盒、SYBR Green试剂盒由福州博涵生物科技有限公司提供，内参基因引物GAPDH、TrkA和AKT目的基因引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。细胞培养箱 (Thermo)、核酸分析仪(Thermo Scientific 2000c)、PCR 扩增仪(ABI 2720)、实时荧光定量PCR仪(ABI 7500 Fast)、倒置显微镜(Olympus1X70)、酶标仪(Bio-Tek ELx800)、自动细胞计数器(Invitrogen)、凝胶成像显影系统(Bio-Rad)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养、椎管内神经鞘瘤细胞鉴定及纯度计算无菌条件下收集手术切除的椎管内神经鞘瘤标本(见图1)，保温桶低温运送至实验室，上述过程控制在2 h内，超净工作台中进行组织消化及原代细胞培养，具体操作参考 Zhang等^[15]关于椎管内神经鞘瘤原代细胞培养方案。利用许旺细胞阳性表达S-100蛋白而成纤维细胞阴性表达的原理鉴定椎管内神经鞘瘤细胞的纯度，其中所有细胞均可以被DAPI染为蓝色，而含有S-100蛋白的许旺细胞在荧光显微镜下被激发出绿色荧光(见图2)，故椎管内神经鞘瘤细胞纯度=(S-100染色阳性细胞数/DAPI染色阳性细胞数)×100%。收集的23例肿瘤标本中，2例室管膜瘤，1例脊膜瘤，椎管内神经鞘瘤细胞纯度为(95.17±0.14)%，其中，3例纯度<95%，17例纯度≥95%(作为实验细胞)。

1.4.2 MTT 将符合纯度要求的椎管内神经鞘瘤细胞用胰酶消化离心配成单细胞悬液，分别以每孔细胞7 000个、溶液200 μL/孔接种于96孔板，置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中，8-12 h细胞基本贴壁后加入实验试剂。对照组只给予体积分数10% FBS?DMEM完全培养基200 μL，实验组给予体积分数10% FBS?DMEM完全培养基配制的，质量浓度分别为15，30，60，120，240 μg/L的神经生长因子β溶液200 μL，作用24 h后取出96孔板，按照试剂盒说明，每孔直接加MTT溶液10 μL继续培养4 h，然后每孔再加入Formanzan溶解液100 μL继续孵育，直至在显微镜下观察Formanzan全部溶解。酶标仪测定570 nm波长处各孔A值。每个浓度组设5个复孔，实验重复3次，取均值。按照上述方案，设置对照组(体积分数10% FBS?DMEM完全培养基)，实验组分为：①K252a组浓度为100，200，300，400，500，600 nmol/L；②LY294002组浓度为10，20，30，40，50，60 μmol/L；③神经生长因子β(120 μg/L)组；④神经生长因子β(120 μg/L)+K252a(400 nmol/L)组；⑤神经生长因子β(120 μg/L)+LY294002(50 μmol/L)组，作用 24 h后测定570 nm波长各孔A值。

1.4.3 椎管内神经鞘瘤细胞生长动力学分析将椎管内神经鞘瘤细胞按上述方法接种于96孔培养板中，共接种5个培养板，每板中对照组给予200 μL体积分数10% FBS?DMEM，实验组给予质量浓度为120 μg/L神经生长因子β溶液200 μL，每组设置5个复孔。5板细胞连续培养0，12，24，36，48 h，每孔直接加MTT溶液10 μL继续培养 4 h，然后每孔再加入Formanzan溶解液100 μL继续孵育，直至在显微镜下观察Formanzan全部溶解。用酶标仪测定570 nm 波长处两组细胞各时间点A值，实验重复3次，根据A值绘制生长曲线。

1.4.4 Western blot 椎管内神经鞘瘤细胞按常规方法消化，以每孔5×10⁴细胞接种于六孔板中的6孔，加体积分数10% FBS?DMEM 培养基体积至3 mL，培养箱中培养12 h后，弃去培养液，PBS洗涤2次，对照组给予3 mL体积分数10%FBS?DMEM培养基，实验组分别给予质量浓度为15，30，60，120，240 μg/L神经生长因子β培养液3 mL，继续培养24 h后收集总蛋白。按照BCA试剂盒测定蛋白浓度。取45 μL样品上样电泳，转至硝酸纤维酯(PVDF)， 5%脱脂奶粉封闭2h ，加一抗37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜3×10 min。二抗37 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜3×10 min，ECL发光，凝胶图像处理系统分析目标条带的灰度值，重复3次。参照上述方法，每孔5×10⁴细胞接种于六孔板中的4孔，对照组给予3 mL10% FBS?DMEM培养基，实验组分别给予3 mL神经生长因子β(120 μg/L)、3 mL神经生长因子β(120 μg/L)+K252a(400 nmol/L)、3 mL神经生长因子β(120 μg/L)+LY294002(50 μmol/L)，凝胶图像处理系统分析目标条带的灰度值，重复3次。

1.4.5 RT-PCR 椎管内神经鞘瘤细胞按常规方法消化。以每孔5×10⁴细胞接种于六孔板中的6孔，对照组给予 3 mL体积分数10%FBS?DMEM培养基，实验组分别给予质量浓度为15，30，60，120，240 μg/L神经生长因子β培养液3 mL，继续培养24 h。TRIzol法提取总RNA，反转录成cDNA，实时荧光定量PCR法检测TrkA、AKT蛋白质对应的mRNA表达情况，样本重复3孔，引物序列见表1。PCR反应体系总体积为20 μL，设定反应程序：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共40次循环，以2^-^??Ct 法计算各组间mRNA的表达量。参照上述方法，每孔5×10⁴细胞接种于六孔板中的4孔，对照组给予3 mL体积分数10% FBS?DMEM培养基，实验组分别给予3 mL神经生长因子β(120 μg/L)、3 mL神经生长因子β(120 μg/L)+ K252a(400 nmol/L)、3 mL神经生长因子β(120 μg/L)+ LY294002(50 μmol/L)，采用2^-^??Ct法计算TrkA、AKT蛋白质对应的mRNA的相对表达水平。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名称	引物序列	退火温度
AKT	5’GGA CTG CCA GAA ATA CAT ACG C 3’	60 ℃
	5’ CTT GTC TGT GGG ACA CTG CTC 3’
TrkA	5’ GCC CTC AGT CTT GGA GTG TC 3’	60 ℃
	5’ TAA CAC AGG GCG CCT AAG AG 3’
GAPDH	5’ CAA CGG GAA ACC CAT CAC CA 3’	60 ℃
	5’ACG CCA GTA GAC TCC ACG ACA T 3’

1.5 主要观察指标 ①DAPI染色及细胞免疫荧光鉴定椎管内神经鞘瘤细胞及其纯度计算；②MTT实验检测细胞吸光度值(A)高低；③Western blot实验检测TrkA、AKT、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β等蛋白质的表达；④RT-PCR检测TrkA、AKT等mRNA的表达。

1.6 统计学分析分析采用SPSS 19.0统计学软件，用 x(_)±s表示实验数据，用t 检验进行组间比较，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义(^aP < 0.05，^bP < 0.01，^cP < 0.001)。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

神经生长因子是Levi-montalcini^[16]在研究鸡胚的神经系统发育时首次发现，对神经、血管和肿瘤都有多种病理生理功能^[17]。神经生长因子属神经营养因子大家族，包括脑源性神经营养因子，神经营养因子3和神经营养素4/5。神经生长因子通过与TrkA受体或/和P75受体结合发挥生物学效应。其中TrkA是神经生长因子的特异性高亲和力受体，也称为功能性受体，介导神经生长因子大多数生物学功能，其本质是由NTRK1基因编码的一种跨膜糖蛋白。NGF/TrkA信号通路通过TrkA与神经生长因子结合激活TrkA进而作用于下游信号通路(包括Ras/MAPK、PI3K/AKT和PLCγ等)产生细胞活性与生物学效应。其中PI3K/AKT信号通路在肿瘤的发生及演变过程中起着至关重要的调控作用^[18-19]。

有报道指出在肿瘤发展过程中，TrkA的激活能够促进肿瘤细胞的增殖^[20]，并且TrkA高表达是恶性肿瘤进展的标志^[21]。PI3K能够通过催化3、4、5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)作用于下游信号分子AKT，而AKT在PI3K/AKT信号转导通路中处于中心位置，经磷酸化激活后可进一步使多种下游蛋白磷酸化，进而调控肿瘤细胞的发生、发展、增殖和凋亡等^[22]，且该信号通路的异常激活在恶性肿瘤中广泛存在，是重要的肿瘤细胞存活途径^[23]。为此，有研究报道K252a(一种TrkA受体特异性抑制剂)作用于卵巢癌细胞后能够使TrkA表达下调，不仅可阻断神经生长因子对该细胞基因表达或迁移行为的影响，还可阻断其引发的癌细胞增殖^[24-25]，此外该抑制剂还可阻断神经生长因子刺激的卵巢癌细胞基因表达或迁移行为的改变^[24]。而在神经源性肿瘤中，Meco等^[26]通过对低级别儿童胶质瘤细胞系的研究发现神经生长因子促进PI3K/AKT信号转导的能力能够被K252a显著降低。张靖等^[27]研究证实PI3K高特异性抑制剂LY294002具有抑制PI3K/AKT通路活性的作用。吴海峰等^[28]证实LY294002能够作用于PI3K/AKT信号而抑制人泌尿系上皮癌细胞的增殖，此外该抑制剂还可抑制人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株及慢性髓系白血病细胞株K562细胞的增殖^[29-30]。所以当阻断NGF/TrkA/PI3K/AKT信号通路时会抑制某些肿瘤的增殖而使其生长停滞。

此次实验中，当不同质量浓度的神经生长因子β作用椎管内神经鞘瘤细胞后细胞A值不断升高，并呈浓度依赖性，说明神经生长因子β能够促进椎管内神经鞘瘤细胞增殖，与DescamPs等^[20]研究证明TrkA通路的激活能够促进肿瘤细胞的增殖这一结论相同。通过Western blot检测的TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β等蛋白质的表达上调，RT-PCR 检测TrkA蛋白质对应的mRNA的表达也上调，说明神经生长因子β促进椎管内神经鞘瘤细胞增殖与TrkA、p-AKT (Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达上调相关联。而与对照组比较，神经生长因子β(120μg/L)组细胞A值升高，TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达上调，神经生长因子β(120 μg/L)+ K252a(400 nmol/L)组细胞A值下降，TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达下调，TrkA蛋白质对应的mRNA的表达也下调，以及神经生长因子β (120 μg/L)+LY294002(50 μmol/L)组细胞A值下降，p-AKT (Ther308)、p-GSK-3β蛋白质的表达下调。说明K252a、LY294002能够阻断神经生长因子β使TrkA、p-AKT (Ther308)、p-GSK-3β蛋白质表达上调这一作用，从而达到抑制椎管内神经鞘瘤细胞的增殖的作用。所以结合以上结果，能够推测当TrkA、p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β蛋白质表达上调时能够促进椎管内神经鞘瘤细胞增殖，反之则抑制细胞增殖，并且可以推断神经生长因子β促进椎管内神经鞘瘤细胞增殖机制是使NGF/TrkA/ PI3K/AKT信号通路中AKT、GSK-3β等蛋白质分子磷酸化水平增高，其中居于中心地位的蛋白质分子AKT，不管是单独加入促进剂神经生长因子β，抑制剂K252a或LY294002还是促进剂与抑制剂的组合，其在试剂作用前后细胞蛋白质中的表达量与其对应的mRNA的相对表达量的变化均不明显，而改变的是其蛋白质磷酸化的水平。这也进一步证明了影响细胞增殖的是信号通路中p-AKT(Ther308)、p-GSK-3β等蛋白质磷酸化的水平以及TrkA蛋白质的表达水平，由于K252a和LY294002两种抑制剂作用于信号通路的位点不一样，也决定了细胞中表达量降低的蛋白质分子种类也不一样。与Rh2、LY294002可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路下调p-AKT和p-GSK-3β诱导人结肠癌细胞凋亡^[31]，以及K252a使TrkA表达下调而抑制人脑胶质瘤U251MG细胞生长等研究结论相一致^[32]。

综上所述，NGF/TrkA/PI3K/AKT信号通路在椎管内神经鞘瘤的发生、发展及增殖中亦发挥了重要作用，该信号通路的激活能够使通路中相关蛋白质的表达上调而促进肿瘤细胞的增殖，当K252a、LY294002等特定的信号通路抑制剂作用于该通路时能够使通路中相关蛋白质的表达下调而抑制肿瘤细胞的增殖，故可以推测鞘瘤细胞的增殖可能与NGF/TrkA信号通路中TrkA、p-AKT(Ther308)及p-GSK-3β等蛋白质的表达水平有关，也为不能行手术以及无法全切而有复发倾向的椎管内神经鞘瘤患者提供了治疗的新思路,使针对NGF/TrkA信号通路靶向治疗椎管内神经鞘瘤成为可能，此次研究不足之处是没有对鞘瘤细胞进行凋亡实验及相关凋亡蛋白如Bcl-2、c-myc等的检测，这些将于下一阶段的实验中予以完善。

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神经生长因子β对椎管内神经鞘瘤细胞增殖的影响

Effect of nerve growth factor-beta on proliferation of intraspinal schwannomas

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