脑死亡模型兔炎症因子表达和肺损伤性变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0367

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (28): 4481-4486.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0367

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脑死亡模型兔炎症因子表达和肺损伤性变化

李玲1，徐千1，魏婉慧1，赵慧佳1，时玉颖1，刘璐1，王彦峰1，叶啟发1，2

1武汉大学中南医院，武汉大学肝胆疾病研究院，武汉大学移植医学中心，移植医学技术湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430071；2中南大学湘雅三医院，卫生部移植医学工程技术研究中心，湖南省长沙市 410013

收稿日期:2018-04-22 出版日期:2018-10-08 发布日期:2018-10-08
通讯作者: 叶啟发，博士，教授，主任医师，武汉大学中南医院，武汉大学肝胆疾病研究院，武汉大学移植医学中心，移植医学技术湖北省重点实验室，湖北省武汉市 430071；中南大学湘雅三医院，卫生部移植医学工程技术研究中心，湖南省长沙市 410013
作者简介:李玲，女，1985年生，湖北省应城市人，2011年中南大学毕业，硕士，主管药师，主要从事器官移植术后供体质量评估的研究。
基金资助:
湖北省自然科学基金创新群体(2015CFA018)

Lung injury and inflammatory responses in a rabbit model of brain death

Li Ling1, Xu Qian1, Wei Wan-hui1, Zhao Hui-jia1, Shi Yu-ying1, Liu Lu1, Wang Yan-feng1, Ye Qi-fa1, 2

1Zhongnan Hospital of Wuhan University, Institute for Hepatobiliary Diseases of Wuhan University, Transplant Center of Wuhan University, Hubei Provincial Key Laboratory of Medical Technology on Transplantation, Wuhan 430071, Hubei Province, China; 2the Third Xiangya Hospital of Central South University, Research Center of National Health Ministry on Transplantation Medicine Engineering and Technology, Changsha 410013, Hunan Province, China

Received:2018-04-22 Online:2018-10-08 Published:2018-10-08
Contact: Ye Qi-fa, MD, Professor, Chief physician, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Institute for Hepatobiliary Diseases of Wuhan University, Transplant Center of Wuhan University, Hubei Provincial Key Laboratory of Medical Technology on Transplantation, Wuhan 430071, Hubei Province, China; the Third Xiangya Hospital of Central South University, Research Center of National Health Ministry on Transplantation Medicine Engineering and Technology, Changsha 410013, Hunan Province, China
About author:Li Ling, Master, Pharmacist-in-charge, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Institute for Hepatobiliary Diseases of Wuhan University, Transplant Center of Wuhan University, Hubei Provincial Key Laboratory of Medical Technology on Transplantation, Wuhan 430071, Hubei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hubei Province for the Innovation Group, No. 2015CFA018

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脑死亡状态：大脑整体功能不可逆性丧失的病理状态，其判定标准为：①明确为颅内加压引起的深昏迷；②瞳孔对光反射、角膜反射消失；③自主呼吸停止；④脑电图呈扁平波。
缓慢间断颅内加压法：通过动物颅骨开孔，颅内放置球囊导管，缓慢间断输注生理盐水，逐渐升高颅内压，使脑灌注压下降，脑血流量随之急剧减少，从而建立脑死亡模型。

摘要
背景：脑死亡供体器官质量是影响移植成功率的关键。对脑死亡诱发器官损伤的机制和保护方面的研究，将为临床上供体器官的合理利用提供实验依据。
目的：观察兔脑死亡后不同时间点肺脏形态学和炎症因子的变化，探究脑死亡状态致肺损伤过程中的作用机制。
方法：40只健康家兔，随机分成2组，假手术组(n=20)：行气管、股动脉插管及颅骨钻孔术；脑死亡组(n=20)：建立兔缓慢间断颅内加压脑死亡模型。各组在术后2，6及8 h记录动脉血压和心率变化，苏木精-伊红染色观察肺组织病理改变，RT-PCR检测各组肺脏热休克蛋白27的mRNA表达，免疫组织化学法检测肺组织核因子κB和细胞间黏附分子1的表达，并用ELISA法检测白细胞介素1β及白细胞介素6，8的水平。
结果与结论：①脑死亡后2，6，8 h家兔动脉血压、心率差异无显著性意义(P > 0.05)；②血清中白细胞介素1β及白细胞介素6、8的水平随着脑死亡时间延长有上升趋势(P < 0.05)；③脑死亡组各时间点热休克蛋白27 mRNA水平较假手术组明显升高(P < 0.05)；④光镜下可见脑死亡后2 h肺泡腔完整，6 h时肺泡间隔增宽并有水肿，炎症细胞浸润增多，8 h损伤最为严重，炎症细胞几乎浸润整个肺脏组织，该形态学变化与脑死亡组炎症相关因子细胞间黏附分子1和核因子κB表达逐渐升高的趋势一致；⑤结果表明，脑死亡状态下肺脏出现损伤性变化且呈进行性加重，该表现与炎症因子的释放有关；脑死亡状态维持8 h以上，肺脏的形态和功能将发生明显改变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0396-0579(李玲)

关键词: 脑死亡, 肺移植, NF-κB, HSP27, 白细胞介素, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: The quality of organs from donation after brain death is essential for the success of transplantation. Studies on the mechanism and protection of organ injury induced by brain death will provide references for the reasonable application of donor organs.
OBJECTIVE: To investigate the changes in the liver morphology and inflammatory factors at different time points after brain death in rabbits, and to explore the mechanism of inflammatory factors in lung damage induced by brain death.
METHODS: Forty rabbits were randomized into two groups (n=20 per group): sham operation group (tracheal intubation, femoral artery intubation, and sphenotresia), brain death group (low intracranial pressure to establish a state of brain death). The mean arterial pressure and heart rate in the two groups were recorded at postoperative 2, 6, 8 hours; the pathological changes of lung were observed by hematoxylin-eosin staining. The expression levels of inflammatory factors in the lung tissues including heat shock protein 27, intercellular adhesion molecule-1 and nuclear factor-κB were tested by RT-PCR and immunohistochemistry. The serum levels of interleukin-1, -6, and -8 were detected by ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in the mean arterial pressure and heart rate at 2, 6 and 8 hours after brain death (P > 0.05). The serum levels of interleukin-1, -6, and -8 increased with time, and the differences were significant (P < 0.05). The mRNA level of heat shock protein 27 in the brain death group was significantly higher than that in the sham operation group (P < 0.05). Under light microscope, the alveolar cavity was intact at 2 hours after brain death, capillary hemorrhage, widened alveolar septum and inflammatory cell infiltration occurred at 6 hours after brain death, and inflammatory cells almost infiltrated the entire lung at 8 hours, which were consistent with the expression levels of inflammatory factors like intercellular adhesion molecule-1 and nuclear factor-κB in the brain death group. In summary, brain death can lead to lung damage, which gets worse with time, and the damage is related to the release of inflammatory factors. Moreover, the lung damage peaks at 8 hours after brain death.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Brain Death, Lung Transplantation, NF-κappa B, HSP27 Heat-Shock Proteins, Interleukins, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

李玲，徐千，魏婉慧，赵慧佳，时玉颖，刘璐，王彦峰，叶啟发. 脑死亡模型兔炎症因子表达和肺损伤性变化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(28): 4481-4486.

Li Ling1, Xu Qian1, Wei Wan-hui1, Zhao Hui-jia1, Shi Yu-ying1, Liu Lu1, Wang Yan-feng1, Ye Qi-fa1, 2 . Lung injury and inflammatory responses in a rabbit model of brain death[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(28): 4481-4486.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用家兔40只，分为2组，均进入结果分析，无实验动物脱失。

2.2 脑死亡前及脑死亡2，6，8 h动脉血压和心率变化脑死亡组和假手术组动脉血压在颅内加压前差异无显著性意义(P > 0.05)。开始颅内加压时，脑死亡组动脉血压明显上升(P < 0.01，图1A)，峰值达400 mm Hg(1 mm Hg= 0.133 kPa)左右。停止加压后血压显著下降，用多巴胺 2 μg/(kg·min)静脉滴入维持在100 mm Hg左右。

检测停止加压后2，6，8 h心率，脑死亡组各时间点心率的差异及与假手术组间心率的差异均无显著性意义(P > 0.05，图1B)。结果提示，在去神经支配的情况下给予多巴胺等升压药物和呼吸机辅助呼吸支持，生命体征相对稳定。

2.3 脑死亡状态下肺脏病理损伤光镜下(图2)：①脑死亡组：2 h肺泡腔完整，渗出物较少，间隔均匀，肺泡壁光滑，偶见中性粒细胞；6 h，肺泡间隔增宽并有水肿，炎症细胞浸润逐渐增多，肺泡腔有渗出液；8 h损伤最为严重，肺泡腔完整性丧失，视野中满布炎症细胞；②假手术组：与脑死亡组相比，各时间点肺脏损伤程度更轻，表现为肺间质水肿程度减轻，炎症细胞浸润减少，肺泡结构更完整。

2.4 血清白细胞介素1β、6、8水平 ELISA结果表明，脑死亡后6，8 h血清白细胞介素6和白细胞介素8水平均高于假手术组(P < 0.05)，8 h的脑死亡组和假手术组白细胞介素1β的差异有显著性意义(P < 0.05)。白细胞介素1β、6、8水平随着脑死亡时间延长有均上升趋势(图3，P < 0.05)。

2.5 HSP27 mRNA的表达 RT-PCR结果显示，与假手术组相比，脑死亡组各时间点HSP27 mRNA水平均明显升高(图4A，P < 0.05)，且HSP27 mRNA表达随脑死亡时间的延长呈上升趋势，其相对表达量从脑死亡后2 h的0.205± 0.023增加到脑死亡后6 h的0.778±0.055，差异有显著性意义(图4B，P < 0.05)。

2.6 细胞间黏附分子1和NF-κB的表达脑死亡后各时间点肺组织中细胞间黏附分子1和NF-κB蛋白质阳性的细胞比例较前一时间点均有明显差异(P < 0.05)，较假手术组对应时间点也都有升高(图5，6)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2011年4月至2014年4月在武汉大学中南医院肝胆疾病研究院基础部完成。

1.3 材料

1.3.1 实验仪器及试剂多功能心电监护仪、JR-1/2动物恒温系统、HX-100E动物呼吸机、BL-420生物机能实验系统、动物实验台和手术器械，Foley 3F气囊导管(Baxter公司)，RevertAid^TM反转录试剂盒(Fermentas公司)，白细胞介素1β，6，8 ELISA 试剂盒(美国R＆D公司)，细胞间黏附分子1(ICAM-1)兔一抗、NF-κB兔一抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3.2 实验动物 12周龄清洁级雄性家兔40只，体质量(3.1±0.2)kg，购自武汉万千佳禾实验动物养殖中心，许可证号：SCXK(鄂)2016-0011。所有家兔均自由标准饮食，并饲养于清洁级环境中。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组与脑死亡模型的建立 40只健康家兔，随机分成2组：①脑死亡组(n=20)：建立脑死亡模型。家兔禁食12 h，自由饮水，称体质量麻醉后，股动、静脉插管，接生物机能实验系统(记录动脉血压)和静脉输液管。气管插管，备接呼吸机。颅骨骨膜下埋置脑电图电极，四肢和胸前接心电图导联，动物恒温系统维持深部体温。沿颅骨正中线钻孔开颅，置3F的Foley气囊导管于硬膜外腔，缓慢注入生理盐水1 mL，观察动脉血压、心率、脑电图变化，继续灌注生理盐水使颅内压升高，直至家兔脑死亡。家兔呼吸停止时，接呼吸机进行机械通气(氧浓度50%，吸呼比5∶4，潮气量15 mL/kg，呼吸频率35次/min)，多巴胺 2 μg/(kg·min)静脉滴入维持血压，至此成功建立脑死亡模型；②假手术组(n=20)：钻孔开颅置管后不加压，其他操作同脑死亡组。

1.4.2 脑死亡模型判定标准参照2013年《脑死亡判定标准与技术规范(成人质控版)》及相关文献^[12-13]。该实验脑死亡判定标准为：①明确为颅内加压引起的深昏迷；②瞳孔对光反射、角膜反射消失；③自主呼吸停止；④脑电图呈扁平波。

1.4.3 血压、心率监测记录颅内加压前和加压后2，6，8 h的动脉血压和心率。

1.4.4 苏木精-伊红染色检查肺脏病理损伤取假手术组和脑死亡组各时间点家兔肺脏组织，标本用体积分数10%甲醛溶液固定、包埋切片、脱蜡至水，行苏木精-伊红染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.4.5 RT-PCR检测HSP27 mRNA表达 PCR引物由上海英骏生物公司合成，HSP27前引物为：5'-GGC-AAA-AAT-CAT-TTT-GAG-GC-3'，后引物为：5'-ATC-CAT-TCT -GGT-TCC-GTG-CT-3'；GAPDH前引物为：5'-TCT-GGC-AAA-GTG-GAT-GTT -GTC-3'，后引物为：5'-TCA-CGC-CCA-TCA-CAA-ACA-T-3'。肺组织匀浆，Trizol法提总mRNA，按试剂盒合成cDNA第一链，以GAPDH为内参RT-PCR HSP-27，2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，计算出灰度值并统计分析。

1.4.6 免疫组织化学法检测细胞间黏附分子1及NF-κB的表达取石蜡切片，脱蜡至水，体积分数3%H₂O₂去离子水10 min，枸橼酸盐缓冲液浸洗2次，PBS洗5 min×2，BSA(50 g/L)室温封闭20 min，稀释后的细胞间黏附分子1、NF-κB一抗孵育(37 ℃、2 h)，PBS洗5 min×4；二抗孵育(37 ℃、20 min)，PBS洗5 min×4，滴加HRP标记的链霉素卵白素工作液，DAB显色，苏木精复染，封固观察。

1.4.7 血清白细胞介素1β及白细胞介素6、8水平测定收集颅内加压前和加压后各时间点家兔血液于无抗凝剂血清管，标本离心(2 000 r/min、5 min)，收集上层血清，ELISA试剂盒检测白细胞介素1β、白细胞介素6，8的水平。

1.5 主要观察指标颅内加压前和加压后2，6，8 h家兔动脉血压、心率、苏木精-伊红染色、HSP27的mRNA表达、细胞间黏附分子1和NF-κB的蛋白表达、血清白细胞介素1β、白细胞介素6及白细胞介素8的水平。

1.6 统计学分析数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组内分析采用重复测量设计的方差分析，检验标准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

肺移植是治疗终末期肺病的最终方案，但由于供体的缺乏，每年因终末期肺病需要进行肺脏移植的人数远远超过捐献肺脏的数量，许多患者在等待移植的过程中死亡。目前脑死亡供体已经成为缓解器官来源短缺的重要途径。然而脑死亡作为一种大脑整体功能不可逆性丧失的病理状态，其引起的血流动力学、炎症因子、内分泌的严重失调会造成肺泡上皮细胞和内皮细胞损伤、肺水肿、肺泡内出血、血管通透性改变，由此导致的急性供体肺损伤会使供体不适合移植或对移植后肺功能产生不良影响。近期研究也发现，脑死亡供肺移植相对于活体供肺移植和心脏死亡供肺移植更容易发生排斥反应^[14-15]。对脑死亡诱发肺损伤的机制和保护方面的研究，将为临床上供体器官的合理利用以及肺移植患者术后生存质量的改善提供实验依据。

该实验采用缓慢颅内加压法建立家兔脑死亡模型，选取了脑死亡后2，6，8 h等时间点，对家兔脑死亡前后的血压、心率、肺脏病理损伤、细胞因子(白细胞介素1β、6、8)水平及炎症因子(细胞间黏附分子1和HSP27)表达等多个指标进行了检测。结果显示，停止加压后2，6和8 h脑死亡组家兔动脉血压无明显变化 (P > 0.05)，脑死亡组和假手术组间家兔心率差异也无显著性意义(P > 0.05)，表明通过颅内加压建立脑死亡状态后，给予多巴胺升压和机械通气支持，可以在一段时间内维持血压在100 mm Hg左右，此时心脏搏动功能也无明显受损，从而证实缓慢颅内加压辅以呼吸循环支持可以有效建立稳定的家兔脑死亡模型。

对脑死亡组肺脏病理损伤观察显示，2 h肺泡腔完整无渗出物，偶见中性粒细胞；6 h，肺泡间隔增宽并有水肿，炎症细胞浸润逐渐增多；8 h损伤最为严重，肺泡腔完整性丧失，视野中满布炎症细胞。随着脑死亡时间延长，家兔肺脏损伤越来越严重，表明脑死亡时间是影响肺移植供体器官质量的重要因素。

已有研究表明，脑死亡过程中炎症因子的过表达是诱发供体肺损伤的重要机制，脑死亡状态刺激不同类型的细胞释放炎症因子、上调细胞因子表达和白细胞浸润^[16-18]。实验中也发现在血流动力学维持稳定的情况下，随着时间延长，脑死亡组白细胞介素1β，6，8呈上升趋势，脑死亡后8 h其与假手术组相比差异最为显著，肺脏中细胞间黏附分子1和NF-κB阳性表达在8 h达到峰值。而2-8 h肺组织中炎症细胞浸润逐渐加重，8 h时炎症细胞几乎浸润整个肺脏组织，与炎症因子升高的趋势相同，提示炎症因子参与介导炎症细胞浸润，引起肺脏损伤。在肺泡上皮细胞表面，白细胞介素1β可以刺激细胞间黏附分子1的表达，促进中性粒细胞和单核细胞对上皮细胞的黏附，调节白细胞介素6的产生，引起细胞损伤^[19]。白细胞介素8作为中性粒细胞趋化因子，在肺脏炎症反应中发挥重要作用，一方面介导中性粒细胞黏附、聚集和脱颗粒，释放炎性递质，引起早期供体肺损伤；另一方面，白细胞介素8通过促血管新生，诱导细胞外基质过度沉积，破坏肺泡毛细血管，降低供体肺质量^[20]。这些炎症分子通过炎症反应直接对肺造成损伤，或者通过提高移植后的组织相容性，增加移植后排斥反应发生率影响移植预后。

HSP27能通过抗巨噬细胞黏附和迁移、升高抗炎因子白细胞介素10的水平发挥抗炎作用。Salari等^[21]用rHSP处理人巨噬细胞，发现rHSP27能诱导IκBα降解，引起NF-κB p65亚基从胞质进入胞核发挥其生理作用,进一步研究表明，rHSP27既促进炎症因子如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α，也促进抗炎因子如白细胞介素10、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达，且倾向于抗炎作用。该实验发现HSP27表达随脑死亡时间的延长逐渐升高，推测肺组织中高水平的炎症因子引起HSP27过表达，过表达的HSP27抑制炎症反应，减轻肺损伤的程度，发挥其在应激状态下保护细胞免于损伤的作用。

除了炎症因子的过表达，脑死亡还可能伴随如下过程：神经内分泌的改变、血流动力学的改变、细胞凋亡的改变、氧化应激的改变^[22-24]，该实验未对相关指标如儿茶酚胺类物质、下丘脑-垂体轴相关激素、凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、caspase 3)进行检测，因此尚不能全面地反映脑死亡对肺脏状态的影响，这是该实验的局限性。

综合上述，通过建立家兔脑死亡模型，研究了脑死亡状态下肺脏炎症因子和形态学变化的趋势。结果提示NF-κB、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、细胞间黏附分子1等炎症因子的水平与脑死亡状态下肺脏损伤性变化关系密切，而HSP-27在高炎症水平下可能有保护细胞、减轻肺损伤的作用。在临床实践中，关注炎症因子和HSP-27的变化，可能对脑死亡状态下供肺质量的评估有所帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

脑死亡模型兔炎症因子表达和肺损伤性变化

Lung injury and inflammatory responses in a rabbit model of brain death

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