OTX2基因对hFOB1.19成骨细胞增殖和分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0313

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
OTX2 基因：定位于染色体14q22.23 区，共含3个外显子，编码由 289个氨基酸构成的转录因子，包含N末端结构域，1个高度保守的同源结构域和C末端转录激活域。其中高度保守的同源结构域为DNA结合域，与 DNA 序列相结合，可形成螺旋-转角-螺旋结构。
基因沉默：RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，即引起基因沉默，是基因表达调控的一种重要方式，是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制。可利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达，达到治疗疾病的目的。

摘要
背景：研究成骨细胞的表达及分化有助于阐明骨性反牙合畸形下颌骨发育过度的分子机制。
目的：应用RNA干扰技术下调成骨细胞系hFOB1.19中OTX2基因的表达，进一步研究OTX2基因对成骨细胞增殖及分化的影响。
方法：实验分为6组：特异性OTX2-siRNA1、OTX2-siRNA2、OTX2-siRNA3组，GAPDH-siRNA组，阴性对照组和空白对照组。设计3个靶序列的小干扰RNA(iRNA)，转染人成骨细胞hFOB 1.19。RT-PCR检测转染后成骨细胞中OTX2 mRNA水平的变化；Western Blot检测蛋白质表达水平；MTT法评估OTX2-siRNA对成骨细胞增殖的抑制作用；化学比色法检测细胞碱性磷酸酶活性。
结果与结论：①转染后，出现OTX2 mRNA水平下调，蛋白表达水平下调；②倒置显微镜下观察漂浮细胞OTX2-siRNA组明显多于各对照组，细胞增殖抑制率明显高于各对照组，OTX2-siRNA组碱性磷酸酶活性明显降低；③结果提示，化学合成的特异性OTX2-siRNA 转染人成骨细胞系hFOB1.19，能有效下调OTX2 mRNA水平；OTX2基因表达下调能够抑制hFOB1.19成骨细胞增殖；OTX2基因表达下调可降低hFOB1.19成骨细胞碱性磷酸酶活性，抑制其分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-9399-4467(王晶)

关键词: hFOB1.19成骨细胞, OTX2基因, 小干扰RNA, RNA干扰, 基因沉默, 错牙合畸形

Abstract:

BACKGROUND: Studying the expression and differentiation of osteoblasts contributes to understanding the mechanism of hereditary mandibular deformity at molecular level.
OBJECTIVE: To down-regulate the expression of OTX2 gene and investigate the effect of OTX2 gene on the proliferation and differentiation of hFOB1.19 osteoblasts by RNA interference.
METHODS: There were six groups: synthesized OTX2- siRNA1, OTX2-siRNA2, OTX2-siRNA3, GAPDH-siRNA, negative control, and blank control groups. Three target sequence siRNAs were designed and transfected into the osteoblasts. The OTX2 mRNA level in osteoblasts was detected by RT-PCR after transfection. The protein expression level was detected by western blot assay. The inhibition of OTX2-siRNA on osteoblast proliferation was evaluated by MTT assay. The alkaline phosphatase activity was detected by chemical colorimetry.
RESULTS AND CONCLUSION: OTX2 mRNA and protein expression was down-regulated after transfection. In the OTX2-siRNA group, the number of loating cells and cell proliferation inhibition rate were higher and the alkaline phosphatase activity was decreased compared with the control group. Our findings indicate that the chemically synthesized OTX2-siRNA can effectively restrain mRNA expression level of OTX2 gene in hFOB1.19 osteoblasts. Interference of OTX2 gene can inhibit the proliferation of hFOB1.19 osteoblasts, and down-regulated expression level of OTX2 gene can reduce the alkaline phosphatase activity of hFOB1.19 osteoblasts and inhibit their differentiation.

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Key words: Osteoblasts, RNA Interference, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王晶，田玉楼. OTX2基因对hFOB1.19成骨细胞增殖和分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(24): 3792-3797.

Wang Jing1, 2, Tian Yu-lou2. Effect of OTX2 gene on the proliferation and differentiation of hFOB1.19 osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(24): 3792-3797.

图/表（结果） 2

2.1 RT-PCR检测转染后成骨细胞内OTX2 mRNA的表达转染特异性OTX2-siRNA1组、特异性OTX2-siRNA2组和特异性OTX2-siRNA3 组的成骨细胞24 h出现OTX2 mRNA水平下调，表达强度分别为0.196±0.017，0.331± 0.024，0.235±0.021，GAPDH-siRNA组、阴性对照组及空白对照组的表达强度为0.523±0.029，0.496±0.026，0.539±0.033，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图1，2。说明靶向基因的OTX2-siRNA能够抑制成骨细胞中OTX2基因的表达。

2.2 Western Blot 检测转染后成骨细胞的OTX2蛋白表达转染特异性OTX2-siRNA1组、特异性OTX2- siRNA2组和特异性OTX2- siRNA3组的成骨细胞24 h后出现OTX2蛋白表达下调，特异性OTX2-siRNA1组蛋白表达阳性率为(22.9±1.3)%，特异性OTX2-siRNA2组蛋白表达阳性率(30.4±2.8)%，特异性OTX2-siRNA3组蛋白表达阳性率为(24.2.±1.6)%，而空白对照组及阴性对照组、GAPDH-siRNA组分别为(93.1±1.7)%，(91.6±2.1)%，(90.5±2.8)%，特异性OTX2-siRNA1组、OTX2-siRNA2组和OTX2-siRNA3 组与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3，4。RT-PCR及Western Blot实验后，选取转染效率最高的OTX2-siRNA1进行后续实验。

2.3 MTT法检测转染后成骨细胞增殖抑制情况倒置显微镜下观察，转染特异性OTX2-siRNA24 h，成骨细胞部分细胞变圆，转染72 h，细胞皱缩，漂浮细胞增多；而空白对照组及非特异性siRNA组大部分细胞形态基本正常，贴壁生长良好。MTT法检测各组的抑制率(表1)，绘制细胞生长曲线(图5)。结果显示在各时间点，OTX2-siRNA组成骨细胞均出现显著增殖抑制(P < 0.05)，空白组与对照组无明显差异(P > 0.05)。

2.4 转染特异性OTX2-siRNA后细胞碱性磷酸酶合成情况碱性磷酸酶检测结果显示(表2)，基因转染组细胞和上清液中碱性磷酸酶活性较阴性和空白对照组明显降

低(P < 0.05)，说明OTX2基因表达下调后抑制了成骨细胞活性。

参考文献

引言

反牙合畸形是正畸临床常见的错牙合畸形之一，常因下颌骨发育过度造成前牙反咬合，下颌前突，影响颜面外观和口颌系统功能，受到遗传和环境两方面因素影响，是一种多基因遗传病。下颌骨的发育受到许多基因的调控，这些基因对成骨细胞的生长和分化进行调节^[1]。相关研究表明，骨性反牙合可能与骨骼发育相关的基因表达异常导致^[2]。哺乳动物的颅神经嵴细胞迁移至前鼻突和第一鳃弓(下颌弓)突起，形成Meckel软骨、上颌骨、下颌骨及其他颅面骨结构。神经嵴细胞是特殊的多潜能干细胞，可分化成不同的组织和成分，包括牙间充质细胞、成骨细胞、成软骨细胞等，以诱导牙、骨等组织器官的发生。研究神经嵴细胞即成骨细胞的表达及分化有助于明确反牙合畸形下颌骨发育的分子机制。因此，当前研究采用成骨细胞作为研究对象。

在前期试验中用免疫组化方法检测了骨性反牙合畸形患者下颌骨组织中骨形态发生蛋白2蛋白的表达，结果发现骨形态发生蛋白2蛋白的分布和OTX1相互重叠，在OTX1高表达的部位同时存在有高表达的骨形态发生蛋白2，由此推测OTX1可通过影响骨形态发生蛋白2表达调控成骨。在颅面发育过程中，OTX1与OTX2协同作用促进脑及骨骼的发育^[2-3]。这提示可以通过研究OTX2与骨形态发生蛋白2之间的相关性进而调控成骨。

OTX2基因是OTX家族成员之一，与间脑、中脑及神经嵴等脑部发育具有密切关系，还可促进视网膜等视觉系统的发育^[4-7]。此外，OTX2基因所表达的神经嵴细胞参与下颌远中区域的形成，是下颌骨发育的易感区域中的候选基因之一^[8-9]。OTX2基因突变可引起小下颌或无颌畸形^[10-11]。提示，由于下颌骨发育过度而引起的反牙合畸形可能与成骨细胞中OTX2基因高表达有关。hFOB1.19是一种人的永生化成骨细胞株，表达碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原等多种成骨细胞特异性标志，经体内实验证实具有成骨活性，可用于研究正常人成骨细胞的增殖、分化及对成骨细胞的增殖及分化有影响的细胞因子^[12-13]。因此当前研究选择 hFOB1.19成骨细胞系研究OTX2基因对细胞增殖分化的影响。

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNA干扰技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，即引起基因沉默，是基因表达调控的一种重要方式，是生物体在基因调控水平上的一种自我保护机制。可利用基因沉默在基因治疗中有效抑制有害基因的表达，达到治疗疾病的目的^[14]。当前研究应用RNA干扰技术下调成骨细胞系hFOB1.19中OTX2基因的表达，检测其对成骨细胞增殖及分化的影响，为进一步明确OTX2基因表达在下颌骨过度发育方面的作用奠定基础。

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材料方法

1.1 设计分组对照细胞学实验。

1.2 时间及地点于2012年1月至2015年12月在中国医科大学科学实验中心二部完成。

1.3 材料

实验用主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清购于Gibco公司，Trizol、PCR引物和RNA PCR kit(AMV) Ver.3.0 试剂盒购于Takara公司，Lipofectamine 2000 Reagent购于凯基生物公司，化学合成的OTX2-siRNA购于上海吉玛公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碱性磷酸酶试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

siRNA及细胞系：hFOB1.19 成骨细胞系由中国科学院上海生命科学研究院细胞库提供。siRNA基因序列引自GenBank，由上海吉玛制药技术有限公司设计3个靶序列的siRNA，合成序列如下：

OTX2-siRNA1	5′-GGG UGC AGG UAU GGU UUA ATT –UUA AAC CAU ACC UGC ACC CTT -3′
OTX2-siRNA2	5′-CAU GGA CUG UGG AUC AUA UTT –AUA UGA UCC ACA GUC CAU GTT -3′
OTX2-siRNA3	5′-CAG ACA UCC UCG UGG AAA UTT –AUU UCC ACG AGG AUG UCU GTT- 3′

1.4 方法

1.4.1 实验分组实验分为6组：特异性OTX2-siRNA1组(转染OTX2-siRNA1)，特异性OTX2-siRNA2组(转染OTX2-siRNA2)，特异性OTX2-siRNA3组(转染OTX2-siRNA3)，GAPDH-siRNA组(转染GAPDH-siRNA阳性对照)，阴性对照组(转染非特异性siRNA)，空白对照组(不做任何处理)。

1.4.2 细胞培养及转染转染前24 h将成骨细胞以 2×10⁵L^-1细胞浓度接种于6孔板，加入1.5 mL含血清不含抗生素的DMEM/F12 培养基，贴壁过夜，待细胞汇合达80%-90% 时进行转染。转染前更换为不含血清不含抗生素的Opti-MEM培养基。用250 μL Opti-MEM培养基稀释 siRNA(终浓度为33 nmol/L)，轻轻吹吸3-5次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250 μL Opti-MEM培养基稀释 5.0 μL Lipofectamine ^TM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5 min。混合转染试剂和 siRNA 稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20 min。将转染复合物加入到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于 37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养。转染6 h换含血清、不含抗生素的DMEM/F12培养基，倒置显微镜下观察转染24，72 h成骨细胞形态。

1.4.3 RT-PCR检测OTX2 mRNA的表达转染后24 h，用Trizol法提取细胞总RNA，使用RT-PCR试剂盒进行反应。将2 μL MgCl₂、1 μL 10×RT Buffer、3.75 μL RNase Free dH₂O、1 μL dNTP Mixture、0.25 μL RNase inhibitor、0.5 μL AMV Reverse Transcriptase、0.5 μL Random 9 mers混合后加入1 μL RNA(≤1 μg)，按照30 ℃ 10 min、45 ℃ 25 min、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min 行反转录反应。OTX2基因PCR引物序列为5′-GAT GTG CTG GAA GCA CTG TTT G -3′(上游)，5′-GAC CTC CAT TCT GCT GTT GTT G-3′(下游)；GAPDH内参引物序列为 5′-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3′(上游)，5′-AGG GTA CAT GGT GGT GCC GCC AGA C -3′(下游)。PCR 反应条件为：94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 5 min。取5 μL PCR产物与1 μL上样缓冲液混合，进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并进行扫描分析。以OTX2与GAPDH平均吸光度值的比值来半定量反映OTX2 mRNA的表达强度。

1.4.4 Western Blot检测蛋白质表达水平收集转染24 h的成骨细胞，提取细胞总蛋白，用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5 min，冷却5 min；取30 μg蛋白上样到制备好的15%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，使用 Bio-Rad半干转印系统转膜，封闭过夜，加入Western洗涤液洗涤，加入单克隆抗体摇床室温杂交2 h；按照适当比例用Western羊抗鼠二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60 min；洗膜液洗3次；ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。

选择RT-PCR及Western Blot检测后转染效率最好的特异性siRNA序列进行后续试验。

1.4.5 MTT法观察成骨细胞增殖抑制应用MTT法，用酶标仪在490 nm处读取吸光度值。记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。细胞增殖抑制率=(1-实验组平均吸光度值/空白组平均吸光度值)× 100%。

1.4.6 化学比色法检测细胞碱性磷酸酶合成情况

培养液中碱性磷酸酶测定：吸取转染24 h的细胞培养液，2 500 r/min，离心10 min，应用碱性磷酸酶检测试剂盒取上清液进行测定。碱性磷酸酶=[(测定吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)]×酚标准品浓度× 100 mL×样品测定前稀释倍数。

培养细胞中碱性磷酸酶测定：按照碱性磷酸酶检测试剂盒说明测定转染后培养细胞中的碱性磷酸酶水平。碱性磷酸酶=[(测定吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)]×酚标准品浓度/待测样本蛋白浓度。

1.5 主要观察指标 ①成骨细胞光镜下形态学观察；②OTX2 mRNA表达；③蛋白表达测定；④细胞增殖抑制率测定；⑤碱性磷酸酶活力测定(利用酶标仪测定吸光度值)。

1.6 统计学分析实验数据资料以x(_)±s表示，采用统计软件SPSS 17.0，多组间参数采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

安氏Ⅲ类错牙合畸形是由上下颌骨大小不调所致的上下颌矢状向关系异常。研究证明，不论是骨性还是非骨性安氏Ⅲ类错牙合畸形，都受到遗传和环境因素的双重影响^[15]。而当二者共同作用于下颌骨时，可使下颌体过度生长，最终引起下颌前突，造成反牙合畸形。研究发现Gsc、Gli2、Gli3、DLx5、幻化生长因子β2等基因能够通过不同的途径在不同的发育阶段对鼠的下颌骨的形态发育产生影响^[16]；Foxo1与Runx2协同作用影响鼠的下颌骨发育^[17]；P561T基因可抑制儿童早期下颌骨发育^[18]。但到目前为止，尚没有明确的骨性反牙合畸形致病基因。

OTX2基因是OTX家族成员之一，定位于14q22.3，含有5个外显子，编码297个氨基酸。OTX2基因属于果蝇正小齿基因中的同源性脊椎动物型，编码含同源结构域的转录因子^[19]。OTX2是胚胎发育的一个重要功能基因，在各种组织中广泛表达，如脑、眼、颌骨等。对于OTX2基因在脑和眼发育中的表达模式与功能研究已较为明确，但其对下颌骨发育所起的作用尚需继续研究探讨。据文献报道，OTX2基因位于小鼠的下颌骨发育的易感区域内^[20]；OTX2等基因的协同作用可影响第一鳃弓形成进而影响下颌骨发育，引起小下颌或无颌畸形。OTX1基因同属于OTX家族，广泛分布在骨、神经系统、眼等组织，在胎儿、胚胎性组织及干细胞中也有表达^[21-22]。前期实验说明OTX1基因可能是遗传性骨性反牙合的易感基因^[23]。有研究报道，在大脑区域化过程中，在中脑后部OTX2的表达在很大程度上与OTX1重叠^[24-26]。这些提示OTX2基因可能通过调控下颌骨发育进而参与骨性反牙合的形成。因此，当前实验通过RNA干扰技术下调OTX2基因的表达，从而研究其对成骨细胞增殖及分化的影响，为进一步探究其对颌骨甚至是下颌骨发育的影响提供一定的研究基础。

当前研究应用RNA干扰技术转染成骨细胞，下调mRNA和蛋白的表达。其原理为：siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物，与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发mRNA的降解反应，引起基因沉默。实验应用化学合成的特异性OTX2-siRNA转染成骨细胞，下调OTX2基因的表达，研究其对成骨细胞增殖及成骨活性的影响。RT-PCR结果显示，转染特异性OTX2-siRNA的成骨细胞mRNA表达强度显著下降。Western Blot结果显示，转染特异性OTX2-siRNA的成骨细胞OTX2蛋白表达下调。说明转染特异性OTX2-siRNA能够显著下调成骨细胞OTX2 mRNA 及蛋白的表达。实验选取的RNA干扰靶序列有较好的干扰效果，RNA干扰结果高效稳定，可作为研究细胞增殖及成骨活性的一种有效的工具和手段。

MTT是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490 nm波长处测定其光吸收值，吸光度值越大，细胞活性越强。实验结果显示，转染特异性 OTX2的成骨细胞增殖明显受到抑制，与对照组差异具有显著性，说明 OTX2基因表达下调能有效抑制成骨细胞增殖。-siRNA

研究表明，多种信号转导通路和细胞因子参与成骨细胞分化的调控，如Wnt、BMP、PI3K/Akt信号转导通路等。据文献报道，骨形态发生蛋白2能促进前成骨细胞碱性磷酸酶基因的表达，增加其活性，从而促进成骨细胞分化^[27-28]。碱性磷酸酶是成骨细胞分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞分化的特异性标志，其含量可以间接反映成骨细胞的功能，是最常见评价成骨细胞分泌功能的指标之一^[29-31]，因此当前研究通过检测培养液及细胞中碱性磷酸酶水平来评估OTX2-siRNA干扰对成骨细胞分化的影响。研究结果显示，特异性OTX2-siRNA转染成骨细胞后，碱性磷酸酶含量较对照组明显降低，提示通过RNA干扰技术，使碱性磷酸酶的活性下降，成骨细胞的分化功能受到抑制，成骨活性降低。OTX2-siRNA干扰对于成骨细胞分化的具体调控机制及参与的信号转导通路还需要深入研究。

综上所述，OTX2-siRNA可以通过下调OTX2 mRNA水平和蛋白的表达，抑制hFOB1.19成骨细胞的增殖，降低碱性磷酸酶活性抑制成骨细胞的分化。提示OTX2基因可能与成骨细胞的表达、增殖及分化等相关。课题组将进一步通过取材下颌骨组织进行免疫组化实验，进一步研究OTX2基因与下颌骨发育的相关性。

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