阿尔茨海默病细胞模型中β淀粉样蛋白介导ERK信号通路的STEP61负性调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0796

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
β淀粉样蛋白：β淀粉样蛋白(Aβ)全长为Aβ1-40或Aβ1-42，是老年斑的主要结构物质，Aβ的沉积是阿尔茨海默病理的始发因素和中心环节，是多种因素导致阿尔茨海默发生发展的共同通路。
纹状体富集的酪氨酸磷酸酶：其位于后突触末端，影响突触增强的形成，可能的机制是使关键性信号蛋白如MAPK激酶ERK1/2，p38和Fyn去磷酸化并失活。

摘要
背景：研究表明纹状体富集的酪氨酸磷酸酶61(striatal-enriched phosphatase，STEP61)在突触可塑性方面发挥重要作用。STEP位于后突触末端，影响突触增强的形成，可能的机制是使关键性信号蛋白如MAPK激酶ERK1/2去磷酸化并失活。
目的：探讨STEP61负性调控阿尔茨海默病细胞模型中β淀粉样蛋白介导的ERK信号通路的机制。
方法：实验分3组，正常组为C57BL/6小鼠原代皮质神经元细胞；阿尔茨海默病细胞模型组是利用1 μmol/L凝聚态的β淀粉样蛋白1-42加入皮质神经元细胞中1 h作为阿尔茨海默病细胞模型；β淀粉样蛋白1-42+RNAi组为在阿尔茨海默病细胞模型基础上，利用sRNAi技术制作STEP61基因沉默组。应用Western Blot技术检测STEP61的RNAi对ERK信号通路的影响。
结果与结论：Western blot结果显示，阿尔茨海默病细胞模型组与正常组相比STEP61蛋白表达增加了223% (P < 0.05)，使磷酸化STEP61的比例减少到(75.6±4.6)% (P < 0.05)。β淀粉样蛋白1-42+RNAi组STEP61磷酸化的比例与阿尔茨海默病细胞模型组相比差异无显著性意义。同时阿尔茨海默病细胞模型组pERK1/2的蛋白表达量较对照组减少(P < 0.05)，而β淀粉样蛋白1-42+RNAi组pERK1/2的蛋白表达量较阿尔茨海默病细胞模型组显著增加(P < 0.05)。结果说明：在阿尔茨海默细胞模型中证实了STEP61调控β淀粉样蛋白介导的ERKs活性，并且很可能是通过脱磷酸化使他们失活而实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-5849-8639(张琳)

关键词: 阿尔茨海默病, β淀粉样蛋白, STEP61, 磷酸化STEP61, pERK1/2, 细胞培养, 细胞模型, STEP61基因沉默, RNA干扰, Western Blot, 组织工程

Abstract:

BACKGROUND: Striatal-enriched phosphatase 61 (STEP61) has been shown to play an important role in
synaptic plasticity. STEP is located at the postsynaptic terminal, and affects the formation of synaptic enhancement probably through the dephosphorylation and inactivation of key signal proteins such as MAPK kinase ERK1/2.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of STEP61 negatively regulating amyloid β-protein (Aβ)-mediated ERK signaling pathway in Alzheimer’s disease cell model.
METHODS: There were three groups. Normal group was primary cortical neuron cells of C57BL/6 mice. In Alzheimer’s disease cell model group, 1 μmol/L Aβ1-42 (condensed state) was added into the cortical neuron cells for 1 hour culture to prepare Alzheimer’s disease cell model. In Aβ1-42 + RNAi group, STEP61 gene silencing was performed in Alzheimer’s disease cell model by sRNAi technique. The effect of STEP61 RNAi on ERK signaling pathway was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of STEP61 protein in the Alzheimer’s disease cell model group was increased by 223% compared with the normal group, and the ratio of phosphorylated STEP61 was reduced to (75.6 ± 4.6)% (P < 0.05). There was no significant difference in the ratio of STEP61 phosphorylation between Aβ1-42 + RNAi and Alzheimer’s disease cell model groups. Western blot analysis showed an evident decrease of pERK1/2 levels in the Alzheimer’s disease cell model group compared with the control group (P < 0.05). The expression of pERK1/2 protein in the Aβ1-42 + RNAi group was significantly higher than that in the Alzheimer’s disease cell model group (P < 0.05). These results suggest that STEP61 negatively regulates Aβ mediated ERK signaling pathway in the Alzheimer’s disease cell model, possibly by dephosphorylation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Alzheimer Disease, RNA Interference

中图分类号:

R318

张琳，杨菁，刘赞华. 阿尔茨海默病细胞模型中β淀粉样蛋白介导ERK信号通路的STEP61负性调控[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(28): 4507-4512.

Zhang Lin1, Yang Jing2, Liu Zan-hua1 . STEP61 negatively regulates amyloid beta-mediated ERK signaling pathway in Alzheimer’s disease cell model [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(28): 4507-4512.

图/表（结果） 2

2.1 Aβ对皮质神经元细胞中STEP₆₁的影响 STEP₆₁在外源性加入Aβ_1-42的皮质神经元细胞中的表达变化：Western Blot结果显示，外源性加入Aβ_1-42使STEP₆₁蛋白表达水平增加了223%(P < 0.05；图1A，B)。使磷酸化STEP₆₁的比例减少到(75.6±4.6)% (P < 0.05；图1C)。作为对照实验使用β-淀粉样肽42-1(1 μmol/L，1 h)，发现其对STEP₆₁的蛋白表达和磷酸化比例无影响(STEP₆₁蛋白水平：(105.0±4.2)%；磷酸化STEP₆₁比例：(98.0±1.6)%；图1D-F)，提示外源性加入Aβ_1-42有助于STEP₆₁在皮质神经元细胞突触小体中的蛋白表达和活性形式的增加。

2.2 STEP₆₁ RNAi鉴定结果实验接下来对STEP₆₁的干扰效率进行检测，分为正常对照组，转染STEP siRNA，non-silencing siRNA和转染试剂组。Western Blot结果显示，转染STEP siRNA组可明显抑制STEP₆₁蛋白表达，干扰后48 h为抑制效果最佳时间点(瞬转法)。与正常组相比，干扰后48 h STEP₆₁表达量减少了80.7%(P < 0.01，图2A，B)；转染STEP siRNA组与non-silencing siRNA 组相比，STEP₆₁表达量减少了69%(P < 0.01，图2C，D)。

2.3 STEP₆₁ RNAi对ERK信号通路的影响实验首先检测谷氨酸刺激后的ERK1/2活化的时程。免疫印迹结果显示，在谷氨酸刺激原代皮质神经元细胞5 min后ERK1/2出现了快速的激活，15-30 min则出现了ERK1/2的延迟失活(图3A，B)。接下来检测STEP₆₁脱磷酸化时程，谷氨酸刺激神经元0，5，10，15和30 min，实验使用抗-STEP抗体来分析细胞裂解产物。谷氨酸刺激15-30 min STEP₆₁显示了明显的上面条带的蛋白表达减少和下面条带的蛋白表达增加，而5-10 min STEP₆₁上面条带的蛋白表达轻微减少，表明STEP61在谷氨酸刺激15-30 min发生了脱磷酸化(图3C，D)。

Western blot 结果显示，Aβ_1-42处理组STEP₆₁水平 (1 μmol/L，1 h)较对照组明显增加(P < 0.05；图4A，B)，而STEP₆₁磷酸化的比例减少(P < 0.05，图4C)。尽管转染STEP₆₁ siRNA明显减少了STEP₆₁水平(P < 0.05；图4C)，而Aβ_1-42+RNAi组STEP₆₁磷酸化的比例与 Aβ_1-42组相比无显著差异(P > 0.05，图4C)。

ERK1/2是STEP的底物，可以使突触加强和记忆巩固。为了检测阿尔茨海默中STEP₆₁是否调控pERK1/2 (Thr²⁰² and Tyr²⁰⁴，STEP₆₁去磷酸化位点)。Western blot结果显示1 μmol/L Aβ_1-42处理皮质神经元细胞1 h后，pERK1/2的蛋白表达量较对照组减少(P < 0.05)，而Aβ_1-42+RNAi组pERK1/2的蛋白表达量较Aβ_1-42组有显著增加(P < 0.05；图4D，E)。

参考文献

[1] Turner PR. Roles of amyloid precursor protein and its fragments inr regulating neural activity, plasticity and memory. Prog Neurobiol. 2003; 70:1-32.

[2] Giacchino J, Criado JR, Games D, et al. In vivo synaptic transmission in young and aged amyloid precursor protein transgenic mice. Brain Res. 2000;876:185-190.

[3] Terry RD, Masliah E, Salmon DP, et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann Neurol. 1991;30:572-580.

[4] Terry RD, Katzman R. Life span and synapses: will there be a primary senile dementia? Neurobiol Aging. 2001;22(3):347-348.

[5] Peters A, Sethares C, Luebke JI. Synapses are lost during aging in the primate prefrontal cortex. Neuroscience. 2008;152(4):970-981.

[6] Baum ML, Kurup P, Xu J, et al. A STEP forward in neural function and degeneration. Commun Integr Biol. 2010;3:419-422.

[7] Boulanger LM, Lombroso PJ, Raghunathan A, et al. Cellular and molecular characterization of a brain-enriched protein tyrosine phosphatase. J Neurosci. 1995;15(2):1532-1544.

[8] Oyama T, Goto S, Nishi T, et al. Immunocytochemical localization of the striatal enriched protein tyrosine phosphatase in the rat striatum: a light and electron microscopic study with a complementary DNA-generated polyclonal antibody. Neuroscience 1995;69(3): 869-880.

[9] Baum ML, Kurup P, Xu J, et al. A STEP forward in neural function and degeneration. Commun Integr Biol. 2010;3(5):419-422.

[10] Paul S, Olausson P, Venkitaramani DV, et al. The protein tyrosine phosphatase step gates long-term potentiation and fear memory in the lateral amygdala. Biol Psychiat. 2007;61:1049-1061.

[11] Venkitaramani DV, Paul S, Zhang Y, et al. Knockout of striatal enriched protein tyrosine phosphatase in mice results in increased ERK1/2 phosphorylation. Synapse. 2009;63(1):69-81.

[12] Floden AM, Li S, Combs CK. Beta-amyloid-stimulated microglia induce neuron death via synergistic stimulation of tumor necrosis factor alpha and NMDA receptors. J Neurosci. 2005;25(10):2566-2575.

[13] Frank AW, Randy JA, Fengju BA. Proteomic survey of rat cerebral cortical synaptosomes. Proteomics. 2005;5(8):2177-2201.

[14] Snyder EM, Nong Y, Almeida CG, et al. Regulation of NMDA receptor trafficking by amyloid-beta. Nat Neurosci 2005;8:1051-1058.

[15] Costa-Mattioli M, Sossin WS, Klann E, et al. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 2009;61(1):10-26.

[16] Sweatt JD. Mitogen-activated protein kinases in synaptic plasticity and memory. Curr Opin Neurobiol. 2004;14(3):311-317.

[17] Paul S, Nairn AC, Wang P, et al. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci 2003;6:34-42.

[18] Schafe GE, Atkins CM, Swank MW, et al. Activation of ERK/MAP kinase in the amygdala is required for memory consolidation of pavlovian fear conditioning. J Neurosci. 2000;20(21):8177-8187.

[19] Valjent E, Pascoli V, Svenningsson P, et al. Regulation of a protein phosphatase cascade allows convergent dopamine and glutamate signals to activate ERK in the striatum. PNAS. 2005;102:491-496.

[20] English JD, Sweatt JD. A requirement for the mitogen-activated protein kinase cascade in hippocampal long term potentiation. J Biol Chem. 1997;272:19103-19106.

[21] Impey S, Smith DM, Obrietan K, et al. Stimulation of cAMP response element(CRE)-mediated transcription during contextual learning. Nat Neurosci. 1998;1(7):595-601.

[22] Davis S, Vanhoutte P, Pages C, et al. The MAPK/ERK cascade targets both Elk-1 and cAMP response element-binding protein to control long-term potentiation-dependent gene expression in the dentate gyrus in vivo. J Neurosci. 2000;20:4563-4572.

[23] Swank MW, Sweatt JD. Increased histone acetyltransferase and lysine acetyltransferase activity and biphasic activation of the ERK/RSK cascade in insular cortex during novel taste learning. J Neurosci. 2001;21:3383-3391.

[24] Dineley KT, Westerman M, Bui D, et al. Beta-amyloid activates the mitogen-activated protein kinase cascade via hippocampal alpha7 nicotinic acetylcholine receptors: In vitro and in vivo mechanisms related to Alzheimer's disease. J Neurosci. 2001;21(12):4125-4133.

[25] Carlezon WA Jr, Duman RS, Nestler EJ. The many faces of CREB. Trends. Neurosci 2005;28:436-445.

[26] Bitner RS, Bunnelle WH, Anderson DJ, et al. Broad-spectrum efficacy across cognitive domains by alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonism correlates with activation of ERK1/2 and CREB phosphorylation pathways. J Neurosci. 2007;27(39):10578-10587.

[27] Dineley KT, Westerman M, Bui D, et al. Beta-amyloid activates the mitogen-activated protein kinase cascade via hippocampal alpha7 nicotinic acetylcholine receptors: in vitro and in vivo mechanisms related to Alzheimer's disease. J Neurosci. 2001;21(12):4125-4133.

[28] Adams JP, Sweatt JD. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annu. Rev Pharmacol Toxicol. 2002;42: 135-163.

[29] Selcher JC, Atkins CM, Trzaskos JM, et al. A necessity for MAP kinase activation in mammalian spatial learning. Learn Mem. 1999;6:478-490.

[30] Zhang L, Xie JW, Yang J, et al. The Tyrosine Phosphatase STEP61 Negtively Regulates Aβ-mediated ERK/CREB Signaling Pathways via α7 Nicotinic Acetylcholine Receptors. J Neurosci Res. 2013;91(12): 1581-1590.

引言

阿尔茨海默病的一个主要病理学特征是脑部出现淀粉样沉积，即老年斑。老年斑的核心成分是一种由39-43个氨基酸残基构成的小神经肽-β淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)，Aβ由淀粉样前体蛋白经过β-分泌酶及γ-分泌酶水解并分泌至细胞外，存在于血浆、脑脊液和脑组织间液中。Aβ全长为Aβ_1-40或Aβ_1-42，是老年斑的主要结构物质，Aβ的沉积是阿尔茨海默病理的始发因素和中心环节，是多种因素导致阿尔茨海默发生发展的共同通路^[1]。

近来人们早已注意在阿尔茨海默脑中，突触数量减少较神经元丧失更显著，还伴有突触病理性结构的改变，而且突触丧失还先于乙酰胆碱转移酶活性降低，所以突触丧失是阿尔茨海默痴呆的结构基础。电生理研究表明，转基因阿尔茨海默小鼠的海马环路的突触传递异常早于Aβ沉积和神经细胞变性^[2]。突触功能损伤是阿尔茨海默病理过程的早期阶段^[3-5]。研究表明，Aβ是引起突触损伤的重要因素。Aβ聚集后损伤突触、激活胶质细胞和星形细胞、损伤神经元、最后出现痴呆。Aβ在突触失衡中的作用是在第37届神经科学年会上提出的，Aβ诱导突触功能缺失的机制研究目前仍处于初期阶段，其中包含许多细胞内的信号转导通路。

纹状体富集的酪氨酸磷酸酶(Striatal-enriched phosphatase，STEP)位于后突触末端，影响突触增强的形成^[6-8]，可能的机制是使关键性信号蛋白如MAPK激酶ERK1/2，p38和Fyn去磷酸化并失活。STEP也能使AMPAR的GluR2亚单位和NMDAR的GluN2B亚单位去磷酸化，进而导致GluR1/GluR2和GluN1/GluN2B的内化。STEP的水平和活性是通过磷酸化，局部的翻译，泛素-蛋白酶系统受损，变性和蛋白酶的裂解来调节的^[9]。

ERK1/2通路参与长时程记忆的形成增加了实验对突触可塑性形成的理解。ERK1/2信号级联在长时记忆的巩固中发挥作用已经有很多证实，如海马的空间记忆能力，岛叶皮质的条件味觉的转移等^[10]。虽然ERK1/2参与长时程记忆的功能已经得到较多证明，但调控ERK1/2信号蛋白的机制尚不清楚。据推测STEP₆₁可能调控ERK1/2信号通路，但是在阿尔茨海默中STEP₆₁是否调控ERK1/2，机制仍不清楚。因此，实验探讨STEP₆₁负性调控阿尔茨海默病细胞模型中Aβ介导的ERK信号通路的机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点于2011年5月至2012年5月在中国医科大学中心实验室完成。

1.3 材料妊娠15 d雌性C57BL/6孕鼠15只，体质量 23-25 g，由中国医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(辽)2013-0007。

兔抗STEP₆₁多克隆抗体(Abgent，美国) (1∶300)，兔抗β-actin单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国) (1∶500)，兔抗单克隆抗体Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴) (Cell signaling technology，美国) (1∶500)，兔抗多克隆抗体Phospho-GluN2B(Tyr¹⁴⁷²) (Cell signaling technology) (1∶500)。BCA蛋白浓度测定试剂盒、5×上样缓冲液、预染蛋白分子量标准等购自江苏碧云天生物技术公司。

1.4 实验方法

1.4.1 C57BL/6小鼠原代皮质神经元细胞培养采用胚胎期十五六天的C57BL/6胎鼠，参照以往文献方法进行^[11]。孕十五六天的C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死，剖腹取胚胎。胎鼠断头取脑，显微镊分离大脑皮质并小心剔除脑膜和血管。组织用体积分数0.025%胰酶EDTA进行消化(ybiotech，Shanghai，China)，在汉克斯平衡盐溶液(Beyotime，Jiangsu，China)中分离细胞。皮质细胞在含B27添加剂和体积分数5%胎牛血清的培养基FBS(Hyclone，Shanghai，China)中悬浮，接种于含有多聚赖氨酸(Sigma)包被的 18 mm德国盖玻片的12孔培养皿。细胞保持在37 ℃，加湿体积分数5%的二氧化碳培养箱中，用无血清Neurobasal培养基培养14至15 d。实验中利用1 μmol/L凝聚态的Aβ_1-42加入皮质神经元细胞中1 h作为阿尔茨海默病细胞模型。将Aβ_1-42置入37 ℃培养箱中1周即获得凝聚态的Aβ_1-42^[12]。

1.4.2 分组及干预实验分3组：正常组为C57BL/6小鼠原代皮质神经元细胞；阿尔茨海默病细胞模型组是利用 1 μmol/L凝聚态的Aβ_1-42加入皮质神经元细胞中1 h作为阿尔茨海默病细胞模型；Aβ_1-42+RNAi组为在阿尔茨海默病细胞模型基础上，利用sRNAi技术制作STEP₆₁基因沉默组。

1.4.3 Aβ_1-42和谷氨酸处理将皮质神经元细胞按照1×10⁴的浓度接种，增殖至40%-50%时置换为无血清培养基，加入0.2，0.3，0.5，1，2，3 μmol/L Aβ_1-42。37 ℃、体积分数5%CO₂温箱孵育0.5，1，2 h。部分实验用含 100 μmol/L谷氨酸的DMEM/高糖培养基作用细胞5，10，15，30，60，120 min。

1.4.4 STEP₆₁基因沉默

(1)siRNA制备：采用体外化学合成法制备siRNA。

(2)siRNA序列：STEP siRNA序列：5' UUC UUU GAA AUC CCC AUG ATT 3' (sense) and 5' UCA UGG GGA UUU CAA AGA ATT 3' (anti-sense), non-silencing siRNA序列: 5' UUC UCC GAA CGU GUC ACG Utt 3' (sense) and 5' ACG UGA CAC GUU CGG AGA Att 3' (anti-sense)。STEP引物序列见表1。

(3)siRNA-lipofectamine 2000转染混合制备：将2 nmol的siRNA溶于1 mL DEPC水中，分装20份，-20 ℃冰箱保存待用。每次干扰前的混合液配制按照说明书推荐量进行(表2)。

1.4.5 RNAi 将单层生长的细胞制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，接种于6孔板及培养皿中。培养24 h后，见细胞贴壁生长状态良好，换无双抗培养液，加入siRNA-lipofectamine 2000转染混合液，前后晃动使之均匀分布于培养液中，放入培养箱中培养，分别于各时间点取材，制备标本。

1.4.6 神经元细胞膜片段制备将取得的神经元细胞在1×PBS中快速清洗1遍，加入提取液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，20 mmol/L NaF，1 mmol/L Na₃VO₄，和蛋白酶抑制剂)。用玻璃匀浆器匀浆，100 000×g离心1 h，沉淀溶解在包括体积分数1% Triton X-100的提取液中，室温下超声处理30 min。留沉淀离心15 000×g，20 min，上清即为膜片段。以上操作均在4 ℃完成^[13]。

1.4.7 Western blot检测将细胞从培养箱中取出，弃培养液4 ℃ PBS冲洗，弃冲洗液，加入1 mL 4 ℃ PBS刮取细胞，移至离心管中，按上述方法提取膜片段，加入蛋白裂解液，4 ℃冰箱内摇床摇晃裂解1 h，12 000×g低温4 ℃离心30 min，取一上清，BCA法进行蛋白定量，每管60 μg蛋白分装，-80 ℃冻存待用。10% SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白样品，4 ℃转膜过夜，体积分数5%脱脂奶粉封闭，STEP₆₁，pERK1/2，total ERK1/2，β-actin抗体4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，ECL发光系统采图，分析。

利用蛋白检测发光鉴定(HRP-ECL发光法) (Pierce Technology，Rockford，IL，USA)检测标本，使用Image J软件包分析吸光度值。Western blot进行至少3次，以确保可重复性。

1.5 主要观察指标各组STEP₆₁蛋白及磷酸化水平。

1.6 统计学分析数据均用x(_)±s表示，应用SPSS 18.0软件进行数据分析。多组间数据差异的比较采用单因素方差分析，组间数据两两比较比较采用LSD和SNK法检测，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

实验采用RNAi技术进行STEP₆₁基因沉默，有效地抑制STEP₆₁蛋白的表达，是探讨STEP₆₁功能并分析其参与阿尔茨海默发生机制的有效手段^[14]。重要的是实验发现在阿尔茨海默细胞模型中STEP-RNAi可上调pERK1/2的蛋白表达，提示STEP₆₁可能参与阿尔茨海默发病的分子机制。

ERK1/2通路参与长时程记忆的形成增加了实验对突触可塑性形成的理解^[15-17]。ERK1/2信号级联在长时记忆的巩固中发挥作用已经有很多证实，如海马的空间记忆能力，岛叶皮质的条件味觉的转移等^[18]。虽然ERK1/2参与长时程记忆的功能已经得到较多证明，但调控ERK1/2信号蛋白的机制尚不清楚。据推测STEP₆₁可能调控ERK1/2信号通路，但是在阿尔茨海默中STEP₆₁是否调控ERK1/2，机制仍不清楚。

有研究表明STEP调控ERK信号通路，在ERK活化区域的Tyr²⁰⁴位点使其去磷酸化并失活^[19-22]。实验发现谷氨酸刺激5 min出现了ERK的快速激活，磷酸化的ERK在作用后的5 min内即在皮质神经元细胞检测到，15 min后才回到基线水平附近，1 h之后再次增加。这与之前的报道结论是一致的^[23-25]。然而是否活化的STEP₆₁在阿尔茨海默中对于ERK信号级联发挥作用目前还不清楚。最近的研究表明在老龄的阿尔茨海默转基因鼠(Tg2576)中Aβ的增加与ERK2 MAPK的下调有关^[26-29]。实验发现，pERK1/2的蛋白表达水平在阿尔茨海默动物模型(APP/PS1)和细胞模型中也显著降低，同时伴随着 STEP₆₁蛋白水平和活化形式的增加。更重要的是在阿尔茨海默细胞模型中STEP₆₁-RNAi上调了pERK1/2的蛋白表达。因此，STEP₆₁蛋白水平和活化形式的变化可能参与了ERK1/2 的磷酸化水平的减少，而且利用RNAi干扰的方法使STEP₆₁基因沉默能够在Aβ_1-42处理的皮质神经元中上调pERK1/2的蛋白表达^[30]。实验在动物水平(以往研究)和细胞水平的数据表明STEP₆₁引起了Aβ-介导的ERK活性的下调，这是到目前为止还未被报道过，为STEP₆₁成为阿尔茨海默有效的新的靶点提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程