两种不同来源间充质干细胞的生物学特性比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0500

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
沃顿胶：又称华通氏胶(Wharton's Jelly)，为构成脐带的凝胶状物质，主要成分是黏多糖，也含有成纤维细胞和巨噬细胞，是一种黏膜组织。华通氏胶内的部分细胞具有干细胞的特性。
细胞克隆形成率：即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要特征。

摘要
背景：间充质干细胞来源广泛，不同组织来源的间充质干细胞在生物学特性上可能存在差异。
目的：比较脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的生物学特性。
方法：分离及体外培养脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞，绘制生长曲线，计算细胞倍增时间和克隆形成率，检测免疫表型、分化能力及分泌因子水平。
结果与结论：①两种间充质干细胞均为梭形，漩涡状生长；②两种间充质干细胞的生长曲线均为S型；③第2代和第5代脐带间充质干细胞的倍增时间均短于同代数的壁蜕膜间充质干细胞，差异均有显著性意义(P < 0.05)；④第2代和第5代脐带间充质干细胞的克隆形成率高于同代数的壁蜕膜间充质干细胞，差异均有显著性意义(P < 0.05)；⑤两种间充质干细胞的表面标记CD73、CD90以及CD105的阳性率均在95%以上，CD34和CD45的阳性率均在1%以下；⑥两种间充质干细胞均可诱导分化为成骨细胞、成脂细胞；⑦脐带间充质干细胞分泌的表皮生长因子水平显著高于壁蜕膜间充质干细胞(P < 0.05)；脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子和干细胞生长因子水平显著低于壁蜕膜间充质干细胞(P < 0.05)；⑧结果提示，两种间充质干细胞具有相似的功能，但脐带组织可能是一个更有应用前景的干细胞来源。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9640-5154(王刚)

关键词: 壁蜕膜, 间充质干细胞, 脐带, 生物学特性, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Although mesenchymal stem cells (MSCs) from different sources share many similar characteristics, they also exhibit individual properties.
OBJECTIVE: To compare the biological characteristics of MSCs derived from umbilical cord and decidua parietalis.
METHODS: Growth curve, cell doubling time, clone formation rate, immune phenotype, differentiation capacity and secreted cytokine levels were analyzed in MSCs derived from umbilical cord and decidua parietalis.
RESULTS AND CONCLUSION: MSCs from umbilical cord and the decidua basalis exhibited similar morphology, spiral growth, S-shaped growth curve, immunophenotype, and differentiation potentials to osteogenesis and adipogenesis. For two kinds of MSCs, the positive rates of CD73, CD90 and CD105 were over 95% and the positive rates of CD34 and CD45 were below 1%. The growth rate, cell doubling time and clone formation rate of umbilical cord derived MSCs at passages 2 and 5 were significantly higher than those of decidua parietalis derived MSCs at passages 2 and 5 (P < 0.05). The level of epidermal growth factor secreted from umbilical cord MSCs was significantly higher that that from decidua basalis derived MSCs, while the levels of vascular endothelial growth factor and stem cell growth factor from umbilical cord derived MSCs was significantly lower those from decidua basalis derived MSCs (P < 0.05). These findings indicate that MSCs from both sources have similar biological properties, but umbilical cord derived MSCs are deemed to have better application prospects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Umbilical Cord, Decidua, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王刚，李东升，管玉涛，朱瑜苑，廖品福，许峻荣，陈智聪. 两种不同来源间充质干细胞的生物学特性比较[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2705-2710.

Wang Gang, Li Dong-sheng, Guan Yu-tao, Zhu Yu-yuan, Liao Pin-fu, Xu Jun-rong, Chen Zhi-cong . A comparative study on biological characteristics of mesenchymal stem cells from two different sources[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2705-2710.

图/表（结果） 3

2.1 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的形态 从两种不同组织中得到较均一的间充质干细胞，两种细胞均为梭形成纤维样细胞，漩涡式生长(图1)，但壁蜕膜间充质干细胞的长度明显长于脐带间充质干细胞。

2.2 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的增殖能力比较

2.2.1 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的生长曲线 两种间充质干细胞的生长曲线均为S型。在同一时间段，第2代和第5代的脐带间充质干细胞的数量均多于壁蜕膜间充质干细胞，随着代数的增长，细胞增殖速度逐渐减慢(图2)。

2.2.2 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的倍增时间 如图3所示，第2代脐带间充质干细胞的倍增时间为(17.73±0.51) h，第2代壁蜕膜间充质干细胞的倍增时间为(21.93±0.72) h，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)。第5代脐带间充质干细胞的倍增时间为(14.50±0.81) h，第5代壁蜕膜间充质干细胞的倍增时间为(19.63±1.1) h，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.2.3 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的克隆形成率 两种间充质干细胞的克隆着色较为明显，克隆面积较大。第2代脐带间充质干细胞的克隆形成率为(16.00±1.41)%，第2代壁蜕膜间充质干细胞的克隆形成率为(13.60±1.50)%，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)。第5代脐带间充质干细胞的克隆形成率为(12.80±0.75)%，第5代壁蜕膜间充质干细胞的克隆形成率为(8.60±1.85)%，两者比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.3 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的免疫表型分析 第3代脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞表面CD73、CD90和CD105表达阳性，大于95%，而CD34、CD45表达阴性，小于1%，见图5和表1。

2.4 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的诱导分化

2.4.1 成脂诱导能力 两种来源间充质干细胞成脂诱导14 d，油红O染色后出现红色脂滴(图6)。

2.4.2 成骨诱导能力 两种来源间充质干细胞成骨诱导14 d，经茜素红染色可见细胞爬片上出现红色钙结节(图7)。

2.5 脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞分泌的细胞因子水平 脐带间充质干细胞分泌的表皮生长因子水平显著高于壁蜕膜间充质干细胞(P < 0.05)；脐带间充质干细胞分泌的血管内皮生长因子和干细胞生长因子水平显著低于壁蜕膜间充质干细胞(P < 0.05)；脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子和转化生长因子β水平差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验观察。

1.2 时间及地点 实验于2017年3至7月在佛山市第一人民医院临床研究所细胞工程实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 组织样本 佛山市第一人民医院足月健康剖宫产孕妇自愿捐献的胎儿脐带和壁蜕膜组织，均在无菌环境下采集。产妇艾滋病毒、梅毒螺旋体、乙肝病毒、丙肝病毒、嗜T细胞病毒、细菌和真菌检测呈阴性，实验经医院伦理委员会评审通过，所有供者均签订知情同意书。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F12、胎牛血清、β-巯基乙醇、胰蛋白酶(Gibco公司)；小鼠抗人CD34，CD45，CD73，CD90，CD105抗体以及同型对照抗体(BD-Biosciences公司)；间充质干细胞成脂、成骨分化培养基(赛业生物科技公司)；细胞因子ELISA检测试剂盒(eBioscience公司)；倒置光学显微镜(Leica公司)；流式细胞仪(BD公司)。

1.4 方法

1.4.1 脐带间充质干细胞的分离和培养 取5-8 cm脐带组织，经体积分数为75%乙醇消毒清洗后剪切成合适长度的小段，分离脐带表面的羊膜和脐带内的血管，撕取脐带内的沃顿胶组织并清洗，均匀剪碎成1.0-2.0 mm³小块。天平称质量为3 g的沃顿胶组织碎块，加入10 mL完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)，接种入75 mL细胞培养瓶，放入37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中进行组织块贴壁法培养。待有细胞贴壁游出后更换培养基，培养7-12 d，去除组织块；培养约2周，细胞达到80%-90%融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1︰3比例进行传代，定期在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.2 壁蜕膜间充质干细胞的分离和培养 完整胎盘组织用体积分数为75%乙醇浸泡1 min，然后用组织保护液对其进行清洗。用手术器械刮取靠近母体一侧粗糙面的壁蜕膜组织，浸泡在PBS中。取2 g壁蜕膜组织转移到50 mL离心管中，剪碎至1.0-2.0 mm²小块，加入0.1%Ⅰ型胶原酶，放入摇床，37 ℃、150 r/min振荡消化1.5 h，加入完全培养基终止消化。加入PBS至50 mL，倒入200目滤网过滤，滤液转移到50 mL离心管，1 300 r/min离心6 min，加入10 mL完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基)，接种入75 mL细胞培养瓶，放入37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中进行培养。细胞达到80%-90%融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1︰3比例进行传代，定期在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.3 两种来源间充质干细胞增殖能力的比较

绘制生长曲线：取第2代和第5代的脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞，胰酶消化后接种(细胞浓度为1.0×10⁷ L^-¹)于24孔板中，置于37.5 ℃、含体积分数为5% CO₂的培养箱中进行培养；每天随机抽取6个孔用胰酶消化，采用Counstar细胞计数仪计数，每孔计数3次取平均值，持续7 d；绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞数。

计算群体倍增时间：根据生长曲线的对数增殖期计算群体倍增时间。Patterson公式为Td=T×[lg2/lg(Nt2/Nt1)]，T代表生长曲线中的对数增殖时间段(t2-t1)，Nt1是对数增殖期起始时间拐点的细胞数，Nt2是对数增殖末期的细胞数，根据此公式分别计算脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞的群体倍增时间。

细胞克隆形成率检测：取第2代和第5代的脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞，经胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度以每板100个细胞的密度接种到60 mm培养皿中，每组实验重复3次。连续培养7 d后，40 g/L多聚甲醛固定5 min。0.1%结晶紫染色15 min。ddH₂O洗去染液，统计克隆个数，克隆形成率=克隆数/接种细胞数× 100%。

1.4.4 两种来源间充质干细胞免疫表型分析 分别取第3代脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞，按每个检测标记2×10⁵个细胞分管，每管加入小鼠抗人PE或FITC标记的单抗CD34，CD45，CD73，CD90，CD105及同型对照各10 μL，4 ℃避光处理30 min，PBS洗涤后用多聚甲醛固定5 min，流式细胞仪检测并分析结果。

1.4.5 两种来源间充质干细胞的诱导分化

成脂分化：传代后的脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞接种于6孔板中，待达到90%融合后，吸去旧培养基，换用成脂诱导完全培养液，每3 d换液1次，共诱导8-14 d，油红O染色鉴定脂滴的形成。

成骨分化：传代后的脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞接种于6孔板中，待达到90%融合后，吸去旧培养基，换用成骨诱导完全培养液，每3 d换液1次，共诱导8-14 d，茜素红染色鉴定钙结节的形成。

1.4.6 两种来源间充质干细胞分泌细胞因子的检测 采用抗体夹心ELISA法检测脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞培养上清中表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞生长因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、转化生长因子β(TGF-β)和血管内皮生长因子(VEGF)水平，按试剂盒说明书操作后，立即使用酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度值，每个样本设置6个重复，取平均值。

1.5 主要观察指标 ①间充质干细胞形态学；②间充质干细胞增殖能力；③间充质干细胞免疫表型；④间充质干细胞诱导分化能力；⑤间充质干细胞分泌能力。

1.6 统计学分析 使用SPSS 19.0软件处理各项数据，计量资料以x(_)±s表示，采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

间充质干细胞具有跨系分化和自我增殖的特性，在退化性疾病、损伤性疾病及免疫相关疾病的研究和临床应用中具有广阔的前景。间充质干细胞是来源于发育早期中胚层间质的一类多潜能干细胞^[8-9]。间充质干细胞有很强的跨胚层潜能及可塑性，可以在体内和体外合适的环境下长期生长，具有自我更新、高度增殖特性，在一定诱导条件下，可以分化为脂肪细胞、骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、神经细胞、内皮细胞等^[10-11]。间充质干细胞来源广泛，例如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、皮肤等不同组织器官，不同组织来源的间充质干细胞在生物学特性上存在差异^[12-13]。

实验比较了脐带间充质干细胞和壁蜕膜间充质干细胞生长曲线、倍增时间、克隆形成率、表面标志、诱导分化能力、分泌因子水平等指标的差异性。两种间充质干细胞形态相似，均为长梭状，呈漩涡式生长。两种间充质干细胞的生长曲线形状基本一致，但在倍增时间和克隆形成率上存在一定差别。同一个代数的细胞，脐带间充质干细胞的倍增时间短于壁蜕膜间充质干细胞，克隆形成率高于壁蜕膜间充质干细胞，说明脐带间充质干细胞的体外增殖能力强于壁蜕膜间充质干细胞，脐带间充质干细胞可以作为一种良好的干细胞制剂来源用于多种疾病的治疗。在显微镜下观察发现脐带间充质干细胞稍小于壁蜕膜间充质干细胞，在形态上存在一定的差异。体外诱导分化实验显示两种不同来源间充质干细胞具有向骨、脂肪细胞分化的能力。两种来源干细胞虽然在形态和生长特性上存在一定的差异，但两种细胞同属间充质干细胞，其主要特性基本一致。

细胞表面标记物可以体现细胞的一些基本特征，细胞的表面标记与其特定的功能相关，间充质干细胞具有独特的细胞表型^[14]。目前人类间充质干细胞表面比较肯定存在的标记物有CD10，CD13，CD29，CD73，CD90和CD105，而CD14，CD34，CD45表达阴性^[15]。利用其表面标记分子进行鉴定分选，也就成为间充质干细胞研究中的一项重要任务和目标^[16]。两种不同来源的间充质干细胞表面标志均高表达CD73、CD90、CD105，极低表达CD34、CD45。

不同来源间充质干细胞具有相似的细胞因子分泌谱，有关学者检测了脐带间充质干细胞的细胞因子表达，发现脐带间充质干细胞表达粒细胞集落刺激因子和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子，而骨髓来源间充质干细胞则不表达^[17]。该实验通过检测两种来源间充质干细胞的细胞因子分泌能力，发现脐带间充质干细胞分泌的表皮生长因子水平高于壁蜕膜间充质干细胞，分泌的血管内皮生长因子和干细胞生长因子水平低于壁蜕膜间充质干细胞。经研究发现表皮生长因子具有促进表皮细胞及其他细胞生长分裂和增殖的作用，能增强内皮细胞的胶原和DNA的合成，加速创面愈合，同时在生殖系统和呼吸系统中扮演重要角色^[18]，提示脐带间充质干细胞可能在创面修复等方面强于壁蜕膜间充质干细胞。血管内皮生长因子作为血管内皮细胞的特异性的肝素结合生长因子，可在体内有效的促进血管再生，增加血管通透性^[19]。干细胞生长因子具有促进细胞分裂和抑制凋亡的作用^[20]。前期的研究表明，干细胞生长因子可促进骨损伤愈合及血管形成，提示壁蜕膜间充质干细胞可能在修复血管损伤类疾病方面更具优势。

随着干细胞研究的不断深入，应用的干细胞种类也越来越多^[21]。细胞治疗产品最终会用于人体，因此，必须建立质量控制和质量保证体系，确保产品的安全性、有效性及稳定性^[22-23]。针对脐带和壁蜕膜来源干细胞的生物学特性进行分析和比较，为干细胞临床试验研究奠定基础。

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