牙髓干细胞在组织工程研究中的进展和应用前景

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0429

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2126-2132.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0429

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牙髓干细胞在组织工程研究中的进展和应用前景

邵苗苗¹，刘钟西¹，许诺²，柳清华¹，王栋¹，何建亚¹，李晓杰¹

¹大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116044；²大连医科大学中山学院，辽宁省大连市 116000

出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 李晓杰，硕士，副教授，大连医科大学口腔医学院，辽宁省大连市 116044
作者简介:邵苗苗，女，1992年生，安徽省淮南市人，汉族，2016级口腔临床医学在读硕士。并列第一作者：刘钟西，女，1993年生，辽宁省葫芦岛市人，汉族，2017级口腔临床医学在读硕士。
基金资助:
辽宁省科技厅立项(201602230)

Dental pulp stem cells in tissue engineering: application and development

Shao Miao-miao¹, Liu Zhong-xi¹, Xu Nuo², Liu Qing-hua¹, Wang Dong¹, He Jian-ya¹, Li Xiao-jie¹

¹School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; ²Zhongshan College of Dalian Medical University, Dalian 116000, Liaoning Province, China

Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Li Xiao-jie, Master, Associate professor, School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China
About author:Shao Miao-miao, Studying for master’s degree, School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China. Liu Zhong-xi, Studying for master’s degree, School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China. Shao Miao-miao and Liu Zhong-xi contributed equally to this work.
Supported by:
the Project of Liaoning Provincial Department of Science and Technology, No. 201602230

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
牙髓干细胞：牙髓组织的主要成分是牙髓细胞，它是一种来源于神经脊的间充质细胞。牙髓干细胞是牙髓细胞中具有多向分化和高增殖潜能的细胞，不仅存在于恒牙牙髓中，也存在于脱落牙齿和牙乳头中。
牙髓干细胞的发展趋势：随着创新性的3D技术的出现，利用牙髓干细胞向骨骼、软骨、脂肪组织或神经组织等多种组织分化的潜能，有望启动新型的替代治疗方案。牙髓干细胞不仅对牙体组织及牙周组织再生有影响，而且对其他组织如神经修复和骨组织再生方面也显示出有意义的临床应用潜力。

摘要
背景：牙髓干细胞作为特殊的干细胞来源，具有高度增殖和自我更新能力，能在特定条件诱导下分化成多种组织细胞，为组织工程领域的发展寻觅了一条新的途径。
目的：对牙髓干细胞的生物学特征、来源、分离方法及其在组织工程学中的应用和研究等方面作一综述。
方法：由第一作者以“dental pulp stem cell,differentiation,regenerative medicine,tissue engineering”为英文关键词，以“牙髓干细胞，分化，再生医学，组织工程”为中文关键词，检索2005至2017年期间收录在PubMed，Medline，中国知网，万方等数据库中与牙髓干细胞和组织工程医学相关的文献，排除与文章研究目的无关及重复性的文献，纳入符合标准的66篇文献进行综述。
结果与结论：随着组织工程医学和再生医学应用的不断发展，牙髓干细胞和组织工程支架的有效结合得以实现，目前研究的重点不仅仅关注于牙髓干细胞的成牙、成骨特性，其在神经修复、血管构建、角膜重建、软骨形成等方面也得到广泛应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-4529-313X(李晓杰)

关键词: 牙髓干细胞, 多向分化, 组织工程医学, 再生医学, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: As a special source of stem cells, dental pulp stem cells (DPSCs) make much progress in the development of tissue engineering field due to their high proliferation and self-renewal ability. In the certain conditions DPSCs can be induced to differentiate into a variety of specialized tissue cells, providing a new way for tissue engineering development.
OBJECTIVE: To review the main progress in the DPSCs biological characteristics, original source, isolation method, and its related application in tissue engineering research.
METHODS: “Dental pulp stem cell, differentiation, regenerative medicine, tissue engineering” in English and Chinese were termed as the keywords to search relevant articles about DPSCs and tissue engineering published from 2005 to 2017 in PubMed, Medline, WanFang, and CNKI databases. After removal of repetitive or irrelevant articles, 66 articles were finally reviewed.
RESULTS AND CONCLUSION: With the development of tissue engineering and regenerative medicine, the effective combination of DPSCs and tissue engineering scaffolds have be further achieved. Recent studies on DPSCs focus on the properties of DPSCs differentiating into odontoblasts and osteocytes/osteoblasts and on the potential of nerve repair, vascular remodeling, corneal reconstruction and chondrogenic differentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Dental Pulp, Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

邵苗苗，刘钟西，许诺，柳清华，王栋，何建亚，李晓杰. 牙髓干细胞在组织工程研究中的进展和应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2126-2132.

Shao Miao-miao, Liu Zhong-xi, Xu Nuo, Liu Qing-hua, Wang Dong, He Jian-ya, Li Xiao-jie. Dental pulp stem cells in tissue engineering: application and development[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2126-2132.

图/表（结果） 1

2.1 牙髓干细胞的定义 牙髓干细胞是起源于神经脊细胞的自体组织细胞。Gronthos等于2000年首次分离并命名了牙髓干细胞，与骨髓间充质干细胞类似，牙髓干细胞中CD105，CD90，CD70等标记物表达阳性，CD34，CD45，CD31，CD14，HLA-DR等造血细胞标记物阴性(图1)。然而牙髓干细胞也有其独特之处^[1-2]，2003年，Shi与Gronthos证实，大多数牙髓干细胞都可以表达膜细胞的标志物3G5，而骨髓间充质干细胞则很少表达^[3]。王亦菁等^[4]通过免疫组化方法研究牙髓干细胞的细胞表型，结果显示除了表达成纤维细胞的标志波形丝蛋白、成纤维细胞生长因子，还表达内皮细胞相关标志如VCAM-1、第Ⅷ因子，平滑肌标志如平滑肌动蛋白，骨标志如Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、骨桥素等。牙髓干细胞对软骨标志Ⅱ型胶原和上皮细胞标志EMA不表达。牙髓干细胞表型的多样性及表达强弱的差异表明牙髓干细胞克隆株的不均一性，它可能是由处于分化和发育不同阶段的细胞组成(表1)。2011年，Karaoz等^[5]为了更进一步区分上述两种干细胞，将骨髓间充质干细胞定义为骨髓来源的间充质干细胞，他们认为牙髓干细胞有内在的神经胶质的特性，在体外既可以分化成神经细胞，也可以分化成血管内皮细胞。

2.2 牙髓干细胞来源和分离培养

2.2.1 牙髓干细胞来源 牙髓干细胞取材容易，来源广泛，主要是从临床废弃和拔除的牙齿中获取，其中第三磨牙是主要来源。其次正畸治疗所需的减数牙和感染的牙髓也是潜在的组织应用来源^[1^，^6]。已有研究报道，从冠折牙中获取牙髓干细胞也是一种简单易行的方法。当患者有不可逆性牙髓炎时，临床医生往往会采用牙髓摘除术治疗受损的患牙，研究表明，炎症牙髓中也有牙髓干细胞，且性能与正常牙髓中提取的牙髓干细胞无差别。尽管感染牙髓来源的牙髓干细胞中Stro-1^＋细胞比例及成骨分化能力与后者相比无显著差异，但潜在的致病原仍可能限制其在组织工程中的应用。Miura等在2003年也从儿童脱落的乳牙牙髓中成功提取了牙髓干细胞。牙髓干细胞不仅能从人类牙髓中提取，从鼠、犬、猪、羊，兔、猩猩、恒河猴等其他物种中也能提取^[7]。

2.2.2 牙髓干细胞分离与储存 牙髓干细胞可以用不同的方法进行筛选，如高增殖潜能、各种表面标记物和核染色的高通量荧光。尽管不同牙髓干细胞的标志物可能不同，但分离所得的细胞都具有多向分化能力。

Gronthos等根据牙髓干细胞的高增殖潜能首次提取出牙髓干细胞，之后他们将牙髓细胞分成单个细胞，提取出生长率最高的克隆群体。虽然牙髓干细胞增殖速度很快，但是传代频繁且接种密度极低的情况下，牙髓干细胞仅仅表现其多向分化潜能。基于细胞表面标志物使用流式细胞术或抗体共轭表面标志的微珠也能分离特异性细胞。Kawashima^[7]在2012年的一篇综述中系统描述了牙髓干细胞中潜在的生物标志物，并讨论了它们神经脊的来源，包括STRO-1，CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD146，CD166，CD271。利用干细胞具有排出Hoechst染料33342的能力，可以从牙髓组织中提取干细胞，它可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞(图2)^[8]。

组织块法或者酶消化法是分离牙髓干细胞的有效方法^[6]。酶消化法所得的牙髓干细胞克隆形成率及增殖能力优于组织块法。牙髓中克隆形成细胞率明显高于骨髓中间质细胞形成率。牙髓干细胞在传代80-100次后仍然具有高增殖、高分化的潜能^[9-10]。冷冻保存是现在常用的储存牙髓干细胞的方法，但是费时又昂贵。Takebe等^[11]开发了新型冷冻保存方法(NCM)，冷冻的牙髓组织解冻后仍适用于牙髓干细胞的提取。他们评估了从冷冻牙髓组织提取的牙髓干细胞(DPSCs-NCM)和不用冷冻储存即外植方法(DPSCs-C)获得的牙髓干细胞的细胞属性，发现两者的增殖能力无差别。流式细胞仪分析表明，二者都在相同水平上表达间充质干细胞的特性，且都不表达造血细胞标志物。此外，二者在不同的诱导培养基中都可以分化为成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞。因此，新型冷冻保存方法可能会降低冷冻保存牙髓干细胞的成本，从而为牙髓干细胞适用于以细胞为基础的组织疗法提供更好的理论基础。

2.3 牙髓干细胞在组织工程领域的应用

2.3.1 牙组织和牙周组织再生领域 牙齿或牙列缺失是口腔疾病的头号杀手，义齿修复和种植牙是目前临床上的主要解决方案。牙髓干细胞被广泛认定是牙组织工程领域最有潜力的干细胞，通过干细胞疗法实现牙齿再生有希望治疗牙齿缺损和牙齿缺失。牙齿组织工程是将牙齿来源干细胞接种于组织工程支架上，辅以促进牙齿发育的生长因子或组织液，实现牙齿的再生或牙列的修复^[12-16]。Ronthos等将人的第三磨牙牙髓组织行原代培养，分离牙髓干细胞并将其置于含矿化液的培养液中，待形成矿化结节后将其与羟磷灰石-磷酸三钙支架复合，再将其移植到免疫缺陷小鼠的背部皮下，6周后内衬成牙本质细胞样细胞的牙本质样结构环绕在牙髓样组织周围形成牙本质牙髓样复合体。Liu等^[17]研究表明，不同浓度的β-甘油磷酸盐可以调节牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。郑丽珠等^[18]实验结果表明壳聚糖-纤维蛋白原复合支架材料有利于牙髓干细胞的增殖与黏附，可为临床治疗年轻恒牙牙髓感染及外伤等提供基础性的研究依据。研究者们已证实牙髓干细胞在体外经诱导后可以分化为成牙本质样细胞，而且在体内可以形成牙髓牙本质复合体样结构，是牙髓组织中最具有应用潜能的组织化活性细胞，可与生物材料有效的结合，在牙髓牙本质复合体再生及牙再生中具有广泛的应用前景^[19-21]。这些研究发现为牙髓干细胞在牙齿组织工程的应用奠定了理论依据。

牙周疾病是一种慢性感染性疾病，也是导致缺牙的另一主要原因，疾病发展的后期往往伴有牙槽骨吸收等牙周组织的严重破坏。牙周组织工程指利用合适的再生细胞，以合适的支架为平台，在信号分子的辅助下实现功能性牙周组织的再生。牙周韧带干细胞是牙齿组织工程中另一个生物工程干细胞。Ding等^[22-23]用同种异体牙髓干细胞和牙周韧带干细胞实现了治疗小型猪牙周炎的技术过程。生长因子和形态因子是牙周组织工程中必不可少的组分，二者主要用来提高干细胞的增殖和分化能力，同时刺激干细胞的合成和分泌矿物基质。多种生长因子已被成功证实可以支持牙周再生，例如牙釉质基质衍生物。它所包含的低分子量蛋白质能吸收牙根表面的羟基磷灰石和胶原纤维，诱导牙骨质形成和牙周组织的再生。

牙槽骨吸收是口腔医学面临的棘手问题，牙槽骨的吸收是缓慢进行性的，也具有一定破坏性和不可逆性，因此实现牙槽骨的再生至关重要。D’Aquino等^[24]从无用的第三磨牙中提取牙髓干细胞，并利用胶原海绵支架，发现可以修复第二磨牙远端牙槽嵴的骨吸收。影像学评估显示在3个月后有大量新生的层状样骨形成，同时邻近的第二磨牙也有较多的附着形成。3年之后，再生组织完全形成密质骨，这是一项具有突破性的发现^[25]。Brunelli等^[26]试图利用牙髓干细胞完成窦道的改建，进行了为期4个月的实验，发现骨形成越来越多。牙科植入物表面的粗糙度能影响成人骨髓间充质干细胞的增殖和分化。Iaculli等^[27]发现，经特殊处理的钛种植体表面可以通过调控microRNA的表达加速人类牙髓干细胞的骨整合过程，且离子喷砂和酸蚀处理表面似乎对成骨细胞的生长影响显著，这一发现对临床疗效的改善和增强具有一定的意义。

牙髓干细胞既能使牙髓-牙本质复合体再生从而修复受损牙髓，也可以构建组织工程牙和牙周组织，为牙组织和牙周组织再生带来新前景。牙髓干细胞有望在今后成为一种安全有效的治疗手段，为缺牙患者带来福音，对于改善患者的生活质量有重大的指导作用。

2.3.2 骨组织再生领域 体内研究显示，牙髓干细胞具有成骨细胞的潜能。体外研究表明，牙髓干细胞接种于明胶支架能异位形成骨结构，骨组织来源的种子细胞作为特殊的干细胞来源，为骨组织工程开辟新路径。

Yuan等^[28]探讨SOX2对牙髓干细胞成骨分化的影响，并开发了一种新的方法促进牙髓干细胞成骨分化。通过反转录病毒建立了过表达SOX2的牙髓干细胞。结果表明，SOX2 通过调节成骨基因和骨形态发生蛋白家族促进牙髓干细胞向成骨细胞分化。牙髓干细胞在骨组织的应用同样离不开许多新型的组织工程材料。Xia等^[29]利用一种含金纳米颗粒(GNP)的新型磷酸粘结剂(GNP-CPC)，对人类牙髓干细胞的成骨诱导能力进行了研究。含金纳米颗粒的结合改善了牙髓干细胞在磷酸粘结剂上的行为，提高细胞的黏附和增殖以及成骨分化能力(14 d内增加2至3倍)。Paduano等^[30]评估了牙髓干细胞在水凝胶支架和胶原蛋白Ⅰ支架上的成牙成骨分化水平，水凝胶支架来源于骨细胞外基质，而胶原蛋白Ⅰ支架是牙髓细胞外基质的主要成分之一。通过一系列的实验方法验证，结果显示，当牙髓干细胞在水凝胶支架上培养时，DSPP，DMP-1和MEPE基因的mRNA表达水平显著上调，与在胶原蛋白Ⅰ支架上培养差异有显著性意义。此外，生长因子或促成骨(成牙)培养基添加也会进一步上调DSPP，DMP-1和MEPE基因的mRNA表达水平，这些结果证实了水凝胶支架诱导牙髓干细胞成骨成牙分化的潜能。随着研究的深入，体外重建骨组织缺损逐渐成为可能，这对于增加患者预后疗效，改善患者的生活质量有很大的意义。

2.3.3 神经修复 近年来，牙髓干细胞在神经系统疾病的应用也受到极大的关注。移植来源于人类乳牙牙髓的间充质干细胞能有效帮助神经损伤的恢复^[31]。Matsubara等^[32]将收集的乳牙牙髓干细胞的条件培养液在急性损伤后期鞘内注射到大鼠损伤脊髓中，产生了显著的功能恢复，可能与诱导抗炎的M2类巨噬细胞的免疫调节活动有关。

人牙髓干细胞具有分化为许旺细胞的能力，除了这种动态分化能力，还具有旁分泌效应^[33]。王爱等^[34]采用经典的Rice法建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，通过尼氏染色法观察海马CA1区神经元的变化，利用免疫组化法测定环磷酸腺苷效应元件结合蛋白的表达，结果表明人牙髓干细胞移植可通过促进海马CA1区CREB的表达，改善缺氧缺血性脑损伤新生大鼠远期学习记忆能力，从而修复新生大鼠缺氧缺血性脑损伤。IGF1受体是表达在牙髓干细胞上的一种胚胎干细胞多能性的标志物，代表着自我更新和分化的潜力。牙髓干细胞分泌IGF1与IGF1受体作用并通过自分泌信号通路保持自我更新和增殖潜能。在新生缺氧缺血大鼠中立体定向植入IGF1受体后可以通过增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高神经的可塑性^[35]。

2.3.4 血管构建 牙髓是高度血管化和受神经支配的组织，包含有多向分化潜力的一组异质性的干细胞。Gandia等^[36]利用大鼠模型研究人牙髓干细胞对于诱导性心肌梗死的治疗效果，他们发现随着时间的延长，梗死部位缩小并伴有新生血管的生成，这可能是由于旁分泌血管内皮生长因子发挥了一定的作用。Iohara等^[37]在2008年也从猪牙髓中分离出高度成血管样的细胞。CD31/CD146阴性表达的牙髓干细胞能表达CD34和VEGFR2，且在基质胶上能形成髓样和管样结构，证明其具有新生神经血管的能力。CD105⁺阳性的牙髓干细胞也证实有同样的特性^[38]。牙髓干细胞成血管的特性为治疗血管不足相关疾病寻觅了一条新的途径。收集人牙髓干细胞的条件培养液能获得广泛的生长因子包括脑源性神经营养因子、神经生长因子、血管内皮生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。将含有含肽凝胶和牙髓干细胞的三维立体打印的羟基磷灰石支架植入免疫功能低下小鼠，发现有血管生长和牙髓样组织形成，骨形成蛋白沉积表明人牙髓干细胞具有成骨/牙源性分化能力^[39]。Silva等^[40]评估了脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)和Frizz6对牙髓干细胞内皮分化及由牙髓干细胞介导的毛细血管形成的影响。他们发现，脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)介导的信号通路对于牙髓干细胞的血管分化至关重要。牙髓干细胞形成血管的特性为治疗血管不足相关疾病寻觅了一条新的途径。

2.3.5 角膜重建 Gomes等^[41]将一个基于牙髓干细胞制作的组织工程片移植到角膜缺损实验兔模型中，发现能促进实验兔角膜上皮重建。视网膜由神经元、光感受器细胞、双极细胞和视网膜神经节细胞相互连接而成，是一个复杂的三层结构^[42]。研究证明，光感受器移植到视网膜外核层能恢复视觉功能^[43]。然而，从年轻捐赠者的眼睛获得大量光感受器在临床上并不可行^[44-45]。干细胞易获取，能分化成光感受器细胞，因此成为治疗老年性视网膜黄斑变性的最理想来源，具体的机制尚未完全被阐明。最近有报道表明，在损伤的器官模型视网膜中发现牙髓干细胞可以诱导分化为光感受器细胞^[46-47]。牙髓干细胞具有良好的自我更新能力与多向分化潜能，这些都是牙髓干细胞构建角膜应用模型的基础和前提。随着研究的进一步深入，炎症牙髓干细胞在角膜重建方面必将有更深和更广阔的发展。

2.3.6 软骨形成 牙髓干细胞的一些种群能表达形成软骨的特性。从牙髓中提取SP细胞，Ⅱ型胶原蛋白和聚糖的表达证实有近30%的SP细胞能转化为软骨细胞^[48]，其他牙髓干细胞在体外实验中也验证出具有表达成软骨细胞标志物的能力^[49-50]，培养早期阶段的牙髓干细胞可以分化为成牙本质、骨和软骨的结构，但培养晚期能分化为成骨细胞。Westin等^[51]对牙髓干细胞的黏附、增殖及向软骨细胞分化的现象进行研究，进行这项工作的目的是为了拓宽治疗软骨病变组织工程相关的细胞来源。多孔壳聚糖黄原胶(C-X)用作生物支架，kartogenin作为牙髓干细胞选择性向软骨细胞定向分化的促进剂。扫描电镜观察牙髓干细胞在支架上的生物行为，组织学分析法评价牙髓干细胞的分化。结果表明，此方法能获得一个稳定的平均厚度为(0.89±0.01) mm的生物支架及吸收能力很高的培养基(13.20±1.88) g/g，且 kartogenin浓度低至100 nmol/L也可以有效地诱导牙髓干细胞诱导分化为软骨细胞，这一研究现象表明牙髓干细胞的应用可能是组织工程治疗软骨病变的有效措施^[51]。

2.4 牙髓干细胞在再生医学的最新进展 牙髓间充质干细胞是来源于牙髓的间充质干细胞。牙髓间充质干细胞增殖能力显著，传代多次后仍会保持其干细胞特性^[52]。牙髓间充质干细胞表达STRO-1阳性，且多数表达STRO-1阳性的牙髓间充质干细胞也表达外膜相关抗原。间充质干细胞可以从成年人牙齿、人乳牙、牙周韧带、根尖未成熟恒牙中获取^[53-54]。其中，乳牙来源的间充质干细胞凭借比成人牙齿更高的增殖潜力和多向分化潜力具有其独特的优势。最近的研究表明，牙髓间充质干细胞可诱导宿主免疫调节机制，并证实牙髓间充质干细胞应用于临床实践的可能性^[55-56]。原位肝移植是临床上患难治性肝脏疾病患者获救的惟一方法^[57]。然而，供体短缺、术后严重并发症、成本效益和伦理问题限制其临床应用^[58]。Ishkitiev等^[59]是第一个发现牙髓来源的间充质细胞可以分化为肝细胞，在肝细胞生长因子、地塞米松和抑瘤素存在的条件下，乳牙牙髓干细胞可以转换成肝细胞的形态，并产生IGF-1和白蛋白。已有报道表明，在特定生长因子的诱导下，无血清培养基中的牙髓干细胞具有分化为肝细胞的潜能，这也显示牙髓干细胞是治疗顽固性肝脏疾病有前景的种子细胞。目前，动物实验模型已经证实了基于牙髓干细胞治疗肝脏疾病的安全性和有效性，在再生医学中运用引导性多功能干细胞也引起了较多的临床关注^[60]。

将牙髓干细胞作为临床治疗的细胞来源应用于再生医学引起了越来越多的关注度^[60]，如心肌性糖尿病、类风湿性关节炎、梗死性糖尿病、帕金森综合征、老年痴呆疾病和难治性肌肉疾病^[61-66]。

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牙髓干细胞在组织工程研究中的进展和应用前景

Dental pulp stem cells in tissue engineering: application and development

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