猪小肠黏膜下层海绵的构建与细胞黏附性观察

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.34.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

交联改性：是通过化学键的形式将线型的聚氨酯大分子连接在一起，形成具有网状结构的聚氨酯树脂，是将热塑性的聚氨酯树脂转变为热固性树脂较有效的一种途径。按照交联方法的不同，可将其细分为内交联法和外交联法。

EDC交联剂：为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，是个可溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶连物的制取。使用时的pH范围为4.0-6.0，常和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-羟基硫代琥珀酰亚胺连用，以提高偶联效率。

背景：虽然小肠黏膜下层的结构与皮肤非常类似，但它的孔径大小与孔径率不如皮肤那样有利于种子细胞的长入。

目的：利用EDC对于猪小肠黏膜下层进行化学改性，观察其改性后形态学结构及细胞相容性。

方法：将小肠黏膜下层支架材料放入含0.2%胃蛋白酶的3%乙酸水溶液中，使小肠黏膜下层的质量浓度分别为1%、2%、3%、4%，磁力搅拌与冷冻干燥后获得小肠黏膜下层海绵，分别应用50，100，150 mmol/L的EDC进行交联改性，通过孔径及吸水率结果选取最佳质量浓度的小肠黏膜下层与EDC交联浓度，进行细胞培养。将第2代骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层海绵共培养，1，2，3周后进行扫描电镜观察。

结果与结论：①当小肠黏膜下层海绵质量浓度为1%时，在100 mmol/L EDC交联下的空间结构弹性好，结构规整，无空洞现象，孔径为100-150 µm；②在100 mmol/L EDC交联下，质量浓度1%小肠黏膜下层海绵的吸水能力比2%高出0.35倍，质量浓度3%与4%小肠黏膜下层海绵的吸水能力相差不明显，质量浓度1%小肠黏膜下层海绵的结构更利于水分的流动与变化；③质量浓度1%的小肠黏膜下层海绵经100 mmol/L EDC交联后的结构、孔径及吸水率最好，可进行细胞实验。培养3周时，细胞变形相对完整且快，细胞形态在孔隙位置相对较大，外形接近长梭形，数目较多，在孔隙周围细胞形态较小，似圆盘形，数目相对较少，产生铺路石样改变，覆盖于大部分支架表面，并有大量颗粒样物质在周围出现，尤其在细胞集中位置更多见；④结果表明，EDC交联改性的小肠黏膜下层海绵具有良好细胞相容性。

ORCID: 0000-0001-7254-7759(孙慧哲)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 小肠黏膜下层, 海绵, 三维重建, 细胞黏附, 体外观察

Abstract:

BACKGROUND: Although the porcine small intestinal submucosa is very similar to the skin in the structure, its pore size and porosity are not beneficial to the growth of seed cells as the skin does.

OBJECTIVE: To observe the morphological and cytocompatibility of porcine small intestinal submucosa after chemical modification using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).

METHODS: A porcine small intestinal submucosa sample was immersed in 3% acetic acid solution containing 0.2% pepsin to make 1%, 2%, 3%, 4% small intestine submucosa solutions. After magnetic stirring and freeze-drying, small intestinal submucosa sponge was obtained and modified by cross-linking with 50, 100, 150 mmol/L EDC. Based on the detection of pore size and water absorption, we selected the best concentrations of small intestinal submucosa and EDC, which were further used for cell culture. Passage 2 bone marrow mesenchymal stem cells were cocultured with the small intestinal submucosa sponge, and observed under scanning electron microscope at 1, 2, 3 weeks after co-culture.

RESULTS AND CONCLUSION: When cross-linked with 100 mmol/L EDC, the small intestinal submucosa sponge at a mass concentration of 1% showed a reasonable structure and good elasticity with no appearance of voids, and the pore size ranged 100-150 µm. Moreover, the small intestinal submucosa sponge at a mass concentration of 1% showed a 0.35-fold increase in the compared with that at a mass concentration of 2%, and its structure was more conducive to water flows and changes. The small intestinal submucosa sponges at a mass concentration of 3% and 4% showed no difference in the water absorbing capacity. After cross-linked with 100 mmol/L EDC, the small intestinal submucosa sponge at a mass concentration of 1% showed the best structure, pore size and water absorption, which were used for cell culture. At 3 weeks after cell culture, cell deformation was relatively intact and fast; there were many cells in the pores that were relatively large and approximately spindle-shaped, while there were less cells around the pores that were relatively small and disk-shaped. A paving stone-like alteration was observed in cells that covered the most of the scaffold surface with a large number of particle-like substances, especially in the site of cell concentration. All these findings indicate that EDC-modified small intestinal submucosa sponge has good cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Skin Transplantation, Cell Adhesion, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙慧哲，田伟，曾亮，裘锦云，张茜. 猪小肠黏膜下层海绵的构建与细胞黏附性观察[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(34): 5487-8492.

Sun Hui-zhe, Tian Wei, Zeng Liang, Qiu Jin-yun, Zhang Qian.

Preparation of porcine small intestinal submucosa sponge and observation of cell adhesion

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(34): 5487-8492.

图/表（结果） 10

2.1 小肠黏膜下层海绵的苏木精-伊红染色观察结果小肠黏膜下层海绵与小肠黏膜下层膜的大体结构见图1。苏木精-伊红染色显示，交联前，小肠黏膜下层海绵存在分层现象，没有均匀的孔隙结构；交联后，小肠黏膜下层海绵则呈蜂窝状，具有立体结构，结构较规整，无极性且孔隙分布均匀，内部和外部结构一致，无分层现象，具有均匀的三维孔隙(与小肠黏膜下层膜对照)，并未发现蓝染的核物质和细胞碎片，不同质量浓度的小肠黏膜下层海绵结构无差别，见图2。

2.2 小肠黏膜下层海绵的扫描电镜观察结果随着小肠黏膜下层海绵质量浓度的增高，其孔径密度与大小出现了变化，当其质量浓度在1%时，在100 mmol/L EDC作用下的空间结构弹性好，结构规整，无空洞现象，孔径为100-150 µm；当其质量浓度2%时，孔径大小为150- 200 µm，此后随其质量浓度的增高，孔径值逐渐下降，并且结构出现松散现象，见图3。随着EDC浓度的增加，海绵内部逐渐从松散状态转变为互相交织的现象，形成大量较均匀的三维孔隙，尤其以100 mmol/L显著，此后随着EDC浓度升高，在孔隙交界处出现了空洞。

2.3 小肠黏膜下层海绵吸水率的测定结果质量浓度1%小肠黏膜下层海绵(100 mmol/L EDC交联)的吸水率最高可达到80%，见表1，这样的变化可能与小肠黏膜下层海绵交联后的亲水能力增加，即羧基增加有关，并且多孔样结构的增加导致吸水能力的变化。

从平均值看，质量浓度1%小肠黏膜下层海绵的吸水能力比2%高出0.35倍，质量浓度3%与4%小肠黏膜下层海绵的吸水能力相差不明显，说明质量浓度1%小肠黏膜下层海绵的结构更利于水分的流动与变化，结果可得出如下结论：小肠黏膜下层海绵的浓度大小决定着吸水性，在一定质量浓度下，孔径大小和吸水力呈正比，但是当质量浓度到了4%时吸水力已没有了明显改变。

2.4 小肠黏膜下层海绵孔径大小的测量结果冷冻干燥法制出的小肠黏膜下层海绵是多孔连通性分布的，质量浓度1%组支架的孔径为100-150 μm，质量浓度2%组的孔径为150-200 μm，其他两质量浓度组的孔径逐渐下降，此外，以质量浓度1%组支架各层之间的连接多数是较细的纤维般结构，导致整个支架内部结构较粗糙，利于细胞黏附(表2)。实验观察结果显示，在100 mmol/L EDC交联下1%质量分数的小肠黏膜下层海绵效果最好。

在50 mmol/L EDC交联下，质量浓度1%-2%组小肠黏膜下层海绵的孔径减少较小，2%-3%组孔径大小减小增大，3%-4%组孔径依旧减小，但无2%-3%组变化大。在100 mmol/L EDC交联下，质量浓度1%-2%组小肠黏膜下层海绵的孔径几乎无明显差异，2%-4%组孔径缩小趋势变大。在150 mmol/L EDC交联下，质量浓度1%-2%组肠黏膜下层海绵的孔径有细微增大，2%-3%组孔径明显缩小，3%-4%组孔径缩小程度减小(图4)。

随着EDC交联浓度的升高，质量浓度1%组小肠黏膜下层海绵的孔径逐渐减少，2%组的孔径逐渐减少；3%组的孔径在交联浓度50-100 mmol/L时增大，在交联浓度100-150 mmol/L时明显缩小；4%组的孔径逐渐增大。

2.5 骨髓间充质干细胞培养结果刚刚接种时，骨髓细胞悬液中的细胞大小不一，呈圆形，无法辨认其细胞核，2 d之后细胞开始贴壁，以多角形为主，还有梭形与三角形，悬浮血细胞在换液后逐渐被清除，纯化过程在2次换液后基本完成。细胞集落约在7 d后形成，没有接触抑制，大多数层次不清，形状不规则，2周后细胞则长满全层，见图5。

细胞鉴定：将1周的细胞传代，培在养瓶中放入多聚赖氨酸包被的载玻片，铺满后，将其取出，钙钴法碱性磷酸酶染色呈弱阳性，见图6。扫描电镜观察，小肠黏膜下层海绵上的骨髓基质干细胞多为星形和多角形，与光镜观察结果一致，见图7。

2.6 骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层海绵的联合培养结果培养1周时，细胞在海绵中都表现为圆形，无明显变形和贴服，于支架内分布均匀且大小一致，局部出现细胞集中现象和重叠分布，细胞生成许多凸起及接触；培养2周时，细胞形态由圆形变成长梭形和星形，重叠现象在孔隙附近更为多见，产生铺路石样改变，覆盖于小部分支架表面，并有颗粒样物质在周围出现，尤其在细胞集中位置；培养3周时，细胞变形相对完整且快，细胞形态在孔隙位置相对较大，外形接近长梭形，数目较多，在孔隙周围细胞形态较小，似圆盘形，数目相对较少，产生铺路石样改变，覆盖于大部分支架表面，并有大量颗粒样物质在周围出现，尤其在细胞集中位置更多见(图8)。

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引言

材料方法

1.1 设计观察性实验。

1.2 时间及地点实验于2015年3月至2016年10月在沈阳医学院基础医学院实验中心完成。

1.3 材料猪小肠购于沈阳大众肉联公司；胃蛋白酶、EDC购买于sigma公司；TritonX-100购买于Chemical Co,St.Louis；DMEM培养基购自GIBCO公司。

实验动物：1月龄昆明小白鼠20只，雌雄不拘，体质量18 g左右，由中国医科大学实验动物部提供，许可证号：SCXK(辽)2003-0009。

1.4 实验方法

1.4.1 小肠黏膜下层支架材料的制备^[6] 取经过检疫的健康成年猪的新鲜近段空肠，沿管腔垂直面切取10 cm，保证管壁无破损，于40 ℃水持续冲洗干净后，浸于无菌生理盐水中。翻转小肠，使黏膜面向外，套于直径3.0-4.0 cm的塑料棒上，用40 ℃去离子水反复冲洗，机械刮除黏膜层、浆膜层和肌层组织。采用顺序化学浸泡法脱细胞，先后顺序分别为：100 mmol/L EDTA和10 mmol/L NaOH溶液浸泡16 h，1 mmol/L HCl和1 mmol/L NaCl溶液浸泡6-8 h，含1 mmol/L NaCl的PBS浸泡16 h，PBS浸泡2 h，在含0.1%C₂H₂O₃的体积分数20%乙醇溶液中浸泡8 h，用含0.05% NaN₃的PBS清洗2 h，期间以去离子水反复冲洗。将处理后的小肠黏膜下层在液氮中反复研磨成均匀一致的颗粒，以1∶1的比例加入PBS，常温调至糊状，加入水溶性交联剂。将悬浊液移入模具，置于冷冻干燥机中(-50 ℃，真空度< 7 Pa)干燥20 h，制得成型的海绵状小肠黏膜下层支架材料，分装密封，环氧乙烷消毒备用。

1.4.2 小肠黏膜下层海绵的制作与准备将小肠黏膜下层支架材料剪成1 cm×1 cm大小的组织小块，再放入含0.2%胃蛋白酶的3%乙酸水溶液中，使小肠黏膜下层的质量浓度分别为1%、2%、3%、4%，37 ℃磁力搅拌72 h，充分溶解小肠黏膜下层后，倒入培养皿中，先冷冻24 h再干燥24 h，将所有浓度的小肠黏膜下层海绵修剪成直径为 1 cm的圆形，放入12孔培养板中，分3组，分别用含有50，100，150 mmol/L EDC的乙醇水溶液(体积比为95∶5)交联24 h，取出后在40 ℃水浴中反复冲洗，取出未反应的小肠黏膜下层，再次冷冻干燥，使用环氧乙烷消毒(沈阳市中心医院)，并在4 ℃冰箱中保存备用。

1.4.3 猪小肠黏膜下层海绵的形态学观察

苏木精-伊红染色：取大小为1 cm×2 cm的小肠黏膜下层海绵，进行石蜡常规切片，苏木精-伊红染色，对照未染色的小肠黏膜下层膜。

扫描电镜观察：将预冷的2.5%戊二醛溶液内放入小肠黏膜下层海绵，完全浸泡12 h后，将其取出放入 0.1 mol/LPBS(pH=7.2)中一整夜，并且进行系列梯度乙醇脱水，用醋酸异戊酯置换，二氧化碳至临界点干燥，真空喷金，采用JSM-T300扫描电镜观察。

孔径大小测量：取12组经苏木精-伊红染色的石蜡切片，每组随机抽取10个切片，一个切片有4个视野，用Luzex-F实时图像分析系统对实验结果进行图像分析，计算其孔径率及孔径大小。

吸水率的测定：取 0.05 g 100 mmol/L EDC交联的质量浓度1%-4%的小肠黏膜下层海绵，用20 mL去离子水浸泡,每组分别取5个样品，每间隔24 h就吸取多于水分，直到烧杯中没有看不见水分存在为止，测量浸泡前后小肠黏膜下层海绵的质量，连续测量5 d，计算水的吸收能力的方程为：小肠黏膜下层海绵的吸水率=[(F-0.05)/0.05]×100%，其中F为浸泡后小肠黏膜下层海绵的质量，计算平均值。

1.4.4 骨髓基质干细胞复合小肠黏膜下层海绵的形态学观察

骨髓基质干细胞的培养与鉴定^[7]：取昆明小白鼠，在腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉剂，在无菌条件下暴露股骨，并将附带的肌肉和骨膜剔除干净，取出中段股骨，再用加入含肝素的PBS进行冲洗，冲洗液中加入10 mL离心管中，1 000 r/min离心10 min，弃上清，再加入3 mL DMEM培养基吹打，接种在20 mL的培养瓶中，然后将5 mL DMEM培养基加入其中，置于体积分数5%CO₂、37 ℃饱和湿度的CO₂孵箱中培养，2 d后进行首次换液，以去除混杂的血细胞和单核细胞，2 d换液1次，每天观察，2周后细胞长满单层，传代培养，取一部分细胞进行碱性磷酸酶染色及光、电镜观察。

骨髓基质干细胞与小肠黏膜下层海绵联合培养：取第2代骨髓基质干细胞，调整细胞浓度为1.1×10⁷ L^-1，加入事先准备好的12孔培养板内，充分湿润质量浓度1%小肠黏膜下层海绵(100 mmol/L EDC交联)，并置于体积分数5%CO₂、37 ℃饱和湿度的CO₂孵箱中进行培养，6 h后将培养液进行更换，以后每2 d换1次，联合培养1，2，3周后，分别取出复合物。把其中部分用体积分数10%甲醛固定，石蜡包埋，切片、苏木精-伊红染色。部分标本用2.5%戊二醛固定，做电镜扫描观察。

1.5 主要观察指标小肠黏膜下层海绵与骨髓基质干细胞共培养前后的形态。

1.6 统计学分析采用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计学分析，差异显著性可采用方差分析检验，对比得出结论。

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讨论

对于细胞生长和物质能量交换来说，组织工程材料适宜的孔径和孔径分布非常必要，同时吸收过程也受材料孔隙率影响，也有利于干细胞于其上黏附、增殖、分化^[8-10]。此次研究采用胃蛋白酶-EDC冷冻干燥法制作小肠黏膜下层海绵支架，观察其孔隙率、吸水率及干细胞在其上的分布、黏附性能，来确定其是否可作为组织工程皮肤的支架。组织工程的理想支架材料应具有良好的组容性、低抗原性、一定的孔隙率、机械强度和可控的降解速率，还要维持在其上面生长的细胞形态和表型，促进细胞的增殖，诱导组织再生。

小肠黏膜下层海绵强度较弱，需进行交联，构成三维网状的结构，进而增强机械强度^[11-19]。研究其对支架材料性能的作用通常选用无污染低毒的交联剂EDC。从实验结果可见加入EDC并没有改变小肠黏膜下层海绵的密度，反而使支架材料的孔隙率提高。小肠黏膜下层海绵能为细胞提供附着和迁移的自然环境，与细胞具有良好的黏附性，通过相差显微镜和扫描电镜观察，可见骨髓基质干细胞在小肠黏膜下层海绵表面能够良好地黏附，生长活跃，增殖旺盛。

大体观察小肠黏膜下层海绵为圆片状的乳白色微粒聚合体，扫描电镜观察其支架内部的纤维互相交织，形成大量较均匀的三维孔隙。理想的组织工程三维支架应模拟体内细胞生存的微环境，诱导干细胞与支架材料黏附，使其最终在三维支架上伸展、增殖和分化^[19-25]。以此理念，此次实验制备了小肠黏膜下层海绵，证实其具有良好的细胞相容性。在小肠黏膜下层海绵材料中，胶原蛋白海绵为细胞保证了一定密度的正电荷，在静电作用下，与细胞膜上带有负电荷的细胞更具亲和力^[26-32]。此外，有大量负电荷存在于骨髓基质干细胞表面，同时胶原蛋白是细胞生存必需的胞外基质，所以，此次经修饰后的小肠黏膜下层海绵功能和结构与细胞外基质相类似，具有保证骨髓基质干细胞伸展、黏附与增殖功能的能力，可将此作为组织工程皮肤的支架。

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