Cultispher微载体构建组织工程软骨修复关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.30.007

摘要/Abstract

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文题释义：

Cultispher微载体：是一种市售的商业化微载体，直径150-300 μm，其主要成分为猪源性明胶，具有良好的生物相容性。其具有较大的比表面积，能适用于贴壁细胞生长，可用于哺乳动物细胞的大规模培养。

搅拌式生物反应器：是一种常见的三维悬浮培养体系，可为细胞生长提供一个均一的生长环境，细胞在其内悬浮生长可更充分的获取营养物质并更利于气液交换。

背景：纤维蛋白胶和微载体均可作为软骨组织工程的良好载体，但因力学性能差和可塑性差等缺点限制其广泛应用。

目的：以负载软骨细胞的Cultispher微载体为基础，复合纤维蛋白胶，构建Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架，观察其用于修复兔膝关节软骨缺损的效果。

方法：将兔软骨细胞与Cultispher微载体置于搅拌式生物反应器中三维悬浮共培养，待细胞帖附至微载体表面并大量扩增后，将负载有软骨细胞的Cultispher微载体与纤维蛋白胶复合，构建Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架，并用于修复兔膝关节股骨滑车软骨缺损。实验按不同的软骨缺损处植入物分为3组：MCF组以负载软骨细胞的Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架修复软骨缺损；MF组以单纯Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架修复软骨缺损；空白对照组旷置软骨缺损，不作任何处理。术后3，6个月取材。检测并记录大体观、大体观评分、病理学染色、病理学评分、Micro-CT扫描等指标，评估软骨修复效果。

结果与结论：①大体观显示MCF组的软骨修复效果明显优于MF组和空白对照组；②番红“O”、天狼猩红病理染色结果显示MCF组的修复组织主要以透明软骨为主，而MF组和空白对照组的修复组织主要以纤维组织为主；③Micro-CT扫描结果显示，MCF组较MF组和空白对照组获得更好的软骨下骨重建；④MCF组的大体观评分与病理学评分均明显高于MF组和空白对照组；⑤结果证实，负载软骨细胞的Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架能成功修复兔股骨滑车软骨缺损。

ORCID: 0000-0002-7160-1933(常彬)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 微载体, 纤维蛋白胶, 软骨组织工程, 软骨损伤修复

Abstract:

BACKGROUND: Both Cultispher microcarrier and fibrin can act as carriers in cartilage tissue engineering, but their application is limited by poor mechanical properties and poor plasticity.

OBJECTIVE: To combine Cultispher microcarrier carrying chondrocytes with fibrin glue to construct Gultispher/fibrin composite scaffold, and to investigate the effect of this composite scaffold in the articular cartilage repair in a rabbit model.

METHODS: Rabbit chondrocyte and Cultispher microcarriers were co-cultured in a stirred bioreactor until the chondrocytes adhered to and proliferated quickly on the microcarrier surface. Chondrocytes-seeded microcarries were then combined with fibrin glue to construct microcarrier/fibrin glue composite scaffolds, to repair trochlear cartilage defects of the knee joint in the rabbit model. In the experiment, three different treatments were respectively done for repair of cartilage defects, including implantation of chondrocytes-seeded microcarries/fibrin glue composite scaffold (MCF group), implantation of Gultispher/fibrin composite scaffold (MF group), and no treatment (blank control group). At 3 and 6 months after surgery, gross observation, histological evaluation, pathological evaluation and Micro-CT scanning were conducted to evaluate the cartilage repair effects.

RESULTS AND CONCLUSION: Gross observation showed that the MCF group achieved better effect on cartilage repair, compared to the other two groups. Histopathological evaluation revealed hyaline-like cartilage tissues in the MCF group while ?brocartilage tissues were seen in the other two groups, shown by safranin O staining and sirius red staining. Micro-CT scanning results showed better subchondral bone remodeling was found in the MCF group than the other two groups. Gross observation and pathological observation showed better outcomes in the MCF group than the MF and blank control groups. To conclude, the chondrocyte-seeded Cultispher microcarrier/fibrin glue composite scaffold succeeds in the articular cartilage repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Hydrogel, Stents, Cartilage, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

常彬，肖统光. Cultispher微载体构建组织工程软骨修复关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(30): 4793-4798.

Chang Bin, Xiao Tong-guang.

Tissue-engineered cartilage construction by Cultispher microcarrier for articular cartilage repair

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(30): 4793-4798.

图/表（结果） 5

2.1 Micro-CT扫描结果 Micro-CT下扫描结果显示，各组软骨下骨以从四周到中央，从下至上的趋势，均得到不同程度重建。MCF组软骨下骨重建效果最佳，骨软骨界面整合良好(图1A)。而其他两组软骨下骨只见部分重建，骨软骨界面整合欠佳，存在明显不连续现象(图1B，C)。骨软骨修复组织形态计量学参数可见MCF组骨体积分数、骨小梁厚度、骨密度、骨小梁数量等数值均明显高于其他两组，表明MCF组软骨下骨重构效果明显优于MF组和空白对照组(表1)。

2.2 修复组织大体观察及评分术后3个月修复组织大体观察：MCF组可见软骨缺损基本被新生组织填平，修复组织色泽与周围正常软骨相近，修复平面光整，与周围正常组织整合界限模糊；MF组可见软骨缺损已大部分被新生组织填充，修复组织色泽暗淡，修复界面粗糙，与周围组织界限明显；空白对照组可见软骨缺损仅小部分被暗红色的肉芽组织填充，修复界面粗糙，与周围正常软骨组织整合差。术后6个月观察：MCF组可见修复平面光整、平滑，与周围正常软骨整合良好；MF组可见软骨缺损基本被乳白色新生组织填充，修复平平面欠平整，与周围正常软骨整合仍欠佳；空白缺损组可见软骨缺损大部分被新生组织填充，修复组织色泽苍白，与周围正常软骨界限明显。MCF组3，6个月的ICRS大体评分均著高于MF组和空白缺损组(表2)(P < 0.05)。

2.3 病理学染色及评分番红“O”染色结果显示术后3个月，MCF组可见修复组织着色与周围正常软骨相似，主要为透明软骨样修复，新生组织中的细胞类型主要为透明软骨样细胞，软骨陷窝明显，细胞排列较规则；MF组可见修复组织着色明显浅于周围正常软骨组织，主要为纤维软骨修复，新生组织中的细胞类型主要为纤维样细胞；空白缺损组可见修复组织基本不被番红“O”染料着色，为纤维组织修复，新生组织内可见大量纤维细胞，细胞排列杂乱无序。术后6个月，MCF组可见修复组织为透明软骨，基质着色与周围正常软骨组织基本无异，其内细胞类型为透明软骨细胞，排列有序(图2A，D)；MF组可见修复组织以纤维组织为主，基质染色较浅，其内以纤维样细胞为主，可见部分有软骨陷窝的透明软骨细胞(图2B，E)；空白缺损组可见修复组织为纤维组织，基质基本不着色，与周围正常组织分界明显，其内可见大量纤维细胞，细胞排列紊乱(图2C，F)。

天狼星红染色显示：术后3个月，MCF组可见修复组织富含Ⅱ型胶原，胶原排列类似正常软骨组织；MF组可见修复组织以Ⅰ型胶原为主，伴少量Ⅱ型胶原，胶原排列杂乱无序；空白缺损组可见修复组织主要为Ⅰ型胶原，胶原排列无序。术后6个月，MCF组可见修复组织主要为Ⅱ型胶原，胶原排列基本与正常软骨组织无异(图3A，D)；MF组可见修复组织仍以Ⅰ型胶原为主，可见少量Ⅱ型胶原，胶原排列不规则(图3B，E)；空白缺损组可见修复组织以Ⅰ型胶原为主，胶原排列仍无序(图3C，F)。

Wakitani 组织学评分显示MCF组3，6个月均明显高于MF组和空白缺损组(表2)(P < 0. 05)。

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引言

关节软骨损伤是骨科常见的运动性损伤。关节软骨因缺乏血管、神经支配，一旦损伤很难自身修复^[1-2]。随着病情进展，势必发展成为骨性关节炎，到了骨性关节炎晚期，人工关节置换成为无可奈何之选。因此对损伤的关节软骨进行有效的修复十分重要^[3]。近些年来，基于细胞治疗的组织工程策略为关节软骨损伤修复带来了新的希望。而种子细胞的选择是一大重要因素。自体或异体关节软骨细胞是常用的细胞类型。临床上，往往自患者关节非负重区取材一小块软骨组织，体外培养扩增至足够数量后再回植至患者软骨缺损处。而软骨细胞在体外平面培养的过程中易于失去表型^[4-5]。因此，探索扩增软骨细胞的新方法十分必要。

研究发现，微载体可用于扩增软骨细胞并维持其表型。研究者使用微载体扩增软骨细胞后，胰酶消化收集细胞待用。胰酶消化收集细胞的弊端在于不仅会损伤细胞，而且造成细胞外基质流失。因此本研究设想在不经过胰酶消化的情况下，直接将负载有软骨细胞的微载体用于构建组织工程软骨，这样势必提高组织工程软骨的质量。但是微载体具有很强的流动性，不易于固定^[6]。生物支架是软骨组织工程另一大要素。天然来源的水凝胶材料具有良好的生物相容性，但缺乏足够的生物力学强度^[7-9]。实验创新性将负载有软骨细胞的微载体与水凝胶复合，构架微载体/水凝胶复合物。水凝胶包裹微载体，可以限制其流动性。而微载体的加入也增强了水凝胶的力学性能。同时，本研究尝试将Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架用于修复兔膝关节全层软骨缺损，并评估其修复效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2015年3月至2016年8月在长治医学院附属和平医院完成。

1.3 材料

实验动物：1.5月龄健康新西兰大白兔，体质量(1.5± 0.5) kg，用于体外关节软骨原代培养；6月龄健康新西兰大白兔，体质量(2.5±0.5) kg，用于软骨修复体内实验，均由长治医学院附属和平医院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SXCM-2014-0002。实验方案经长治医学院附属和平医院动物实验伦理委员会批准。实验动物在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

试剂及仪器：纤维蛋白胶(Sigma公司，美国)；Cultispher G微载体(PercellBiolytica公司，瑞典)；Ⅱ型胶原酶 (Sigma公司，美国)；DMEM细胞培养液(Lonza公司，瑞士)；胎牛血清(Lonza公司，瑞士)；Micro-CT(GE公司，美国)；番红“O”染液(Sigma公司，美国)；天狼猩红染液(Sigma公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 兔软骨细胞的分离培养麻醉状态下处死1.5月龄新西兰大白兔，常规消毒备皮，无菌条件下取出兔膝关节软骨，至于培养皿中。将取出的软骨组织用PBS洗3遍后转至青霉素小瓶内，用眼科剪将其剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小的颗粒，加入2倍体积浓度为0.075%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃条件下磁力搅拌消化4 h。加入含有体积分数为10%胎牛血清的培养液终止消化，1 000 r/min 10 min离心，去掉上清液，PBS洗3遍，加入含有体积分数10%胎牛血清吹打均匀后接种至培养瓶中，置于37 ℃，体积分数5% CO₂培养箱中孵育。

第2天更换培养液，其后每两三天更换培养液。待细胞长至60%融合，使用0.25%胰酶进行消化传代培养。P3代兔软骨细胞待用于兔体内软骨修复实验。

1.4.2 Cultispher微载体生物反应器中扩增兔软骨细胞取Cultispher G微载体粉末2 g置于玻璃瓶中，加入200 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS，室温下浸泡膨胀12 h。弃上清液，新配置PBS洗涤10遍，120 ℃，103 kPa高温高压蒸汽消毒后，保存于4 ℃环境下备用。将预处理过的250 mg Cytodex-3与10 mL含有1×10⁵兔软骨细胞的细胞悬液混合，置于搅拌烧瓶式生物反应器中三维悬浮共培养。为了更利于细胞贴附至微载体表面生长，拌烧瓶式细胞培养器的运转参数设置为：25 r/min震荡30 s后暂停30 min，48 h后，加入100 mL培养液，50 r/min持续震荡。搅拌烧瓶式细胞培养器置于37 ℃体积分数5%CO₂培养箱中，培养基每两三天更换1次。

1.4.3 Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架的制备收集生物反应器中负载有软骨细胞的Cultispher微载体，与纤维蛋白原溶液充分混合，使微载体均匀分布，加入2%凝血酶溶液致凝成胶，获得负载有软骨细胞的Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架(Cultispher微载体+软骨细胞+纤维蛋白胶)。作为对照组的单纯Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架中使用的微载体为不负载细胞的单纯微载体(Cultispher微载体+纤维蛋白胶)。

1.4.4 Cultispher微载体/纤维蛋白胶支架修复兔膝关节软骨缺损选取24只6月龄雄性健康新西兰大白兔，体质量(2.5±0.5) kg(由长治医学院附属和平医院实验动物中心提供，并通过医院伦理委员会审核)。随机均分为3组：①MCF组，Cultispher微载体(Microcarrier，M)+软骨细胞(Cell，C)+纤维蛋白胶(Fibrin，F)复合支架组；②MF组，Cultispher微载体(Microcarrier，M+纤维蛋白胶(Fibrin，F)单纯支架组；③空白缺损组。肌肉注射速眠新(3 mL/kg)辅助麻醉后，腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)诱导麻醉，常规消毒铺巾，双侧膝关节作内侧切口，外侧脱位髌骨，暴露股骨滑车，使用无菌环钻作一直径2.5 mm，深1.0 mm的全层骨软骨缺损。MCF组以负载软骨细胞的Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架修复软骨缺损；MF组以单纯Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架修复软骨缺损；空白缺损组旷置软骨缺损，不作任何处理。术后3，6个月取材。检测并记录大体观、大体观评分、病理学染色、病理学评分、Micro-CT扫描等指标，评估软骨修复效果。

1.5 主要观察指标

1.5.1 Micro-CT扫描术后6个月处死实验动物，取出膝关节，浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定24 h后置于Micro-CT下扫描。对扫描结果用标准体模校准后，以缺损区为中心，建立圆柱体(直径 4 mm、高 3 mm)三维兴趣区 (region of interest，ROI)，保证ROI内均为缺损区的修复组织。重建修复区图像，使用MicroView图像分析软件对相应的ROI进行三维重建，并分析各组骨软骨修复组织形态计量学参数：骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨矿物质密度(BMD)、骨小梁数量(Tb.N)等。

1.5.2 大体观察及评分术后3，6个月处死实验动物，取出膝关节，仔细观察每组修复组织的颜色、光泽、与周围正常组织整合情况的，并由3名不同的观察组根据ICRS大体评分规则进行大体观评分^[1⁰^]。

1.5.3 病理学染色及评分术后3，6个月处死实验动物，取出膝关节，40 g/L多聚甲醛中固定24 h后进行组织脱水、石蜡包埋。切片后进行番红“O”染色和天狼猩红，并由3名不同的观察组根据Wakitani提出的评分原则进行病理学评分^[1¹^]。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料以x(_)±s表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

因创伤、炎症、肿瘤、退变等导致的关节软骨损伤是骨科常见的疾病^[1-2]。流行病学研究显示膝关节手术中软骨损伤患者占60%以上。关节软骨是覆盖于关节表面厚1-5 mm的透明软骨，其营养液主要来自于关节滑液，自身缺乏血管、神经、淋巴支配。关节软骨内的软骨细胞分布稀疏，细胞外基质稠密，限制了软骨细胞迁移。关节软骨的这些结构特点导致其一旦损伤后，很难以进行自我修复。随着损伤的加重，软骨下骨暴露，进而发展为骨性关节炎。导致患者肢体功能障碍，生活质量下降。因此对软骨损伤患者给予有效的治疗，避免其进一步发展成为骨性关节炎至关重要。目前治疗关节软骨损伤的方法主要有内科保守药物治疗、微骨折、骨膜修复、马赛克移植、异体软骨移植等。但治疗效果均差强人意^[4-5]。近些年来，软骨组织工程技术的兴起和发展为关节软骨手术这一常见疾病提供了新的治疗思路。但目前软骨组织工程仍存在一些缺陷有待改进。

如何获得足够数量、状态良好的种子细胞用于移植至体内软骨修复处是软骨组织工程面临的一大问题^[12-13]。目前最常用的种子细胞类型的软骨细胞。自体软骨细胞移植手术中，于患者关节非负重区取一块软骨组织，体外培养扩展，获得足够数量的软骨细胞后，再二次手术移植至关节软骨缺损处。但是，软骨细胞在体外培养过程中易于丢失软骨表现、去分化，从而失去分泌软骨细胞外基质的能力，这严重影响了软骨修复效果。因此，如何在短时间内扩增软骨细胞，并在培养过程中维持其表型是一大亟需解决的难题。

微载体是指直径在100-300 μm，能适用于贴壁细胞生长的微球。1967年，Van Wezel等首次用DEAE-Sephadex A 50研制出第一种微载体，用于哺乳动物细胞的大规模培养。目前已有包括Cultispher G微载体在内的多种商业化微载体问世。微载体具有较大的比表面积，可以在短时间内大量扩增细胞^[14-16]。近些年来，大量研究显示微载体用于培养软骨细胞可在短时间内大量扩增软骨细胞，并且可维持软骨细胞的表型^[17-20]。另外，微载体扩增间充质干细胞可促进其成软骨分化。因此，微载体被认为是扩增软骨组织工程种子细胞的良好载体。本研究中使用的Cultispher G微载体是一种市售的商业化微载体，其主要成分为猪源性明胶，具有良好的生物相容性。将兔软骨细胞与Cultispher G微载体置于搅拌式生物反应器中三维悬浮共培养，可见软骨细胞可在短时间内贴附至微载体表面，并大量增殖。搅拌式生物反应器可为细胞生长提供一个均一的生长环境，细胞在其内悬浮生长可更充分的获取营养物质并更利于气液交换^[21-24]。微载体具有流动性，因此将负载有细胞的微载体直接移植至体内软骨缺损处，难以固定，这阻碍了微载体直接应用于体内软骨修复。支架的选材是软骨组织工程另一大问题。天然来源的水凝胶因具有良好的生物相容性、可塑性、可降解性、降解产物无毒性等特点，被认为是生物支架的良好材料来源。但由于水凝胶生物力学性能欠佳，不能为软骨损伤修复提供足够的力学支撑而限制其广泛应用^[25-28]。

本研究创新性的结合微载体和水凝胶的优点，将Cultispher G微载体与纤维蛋白胶结合，制作Cultispher G微载体-纤维蛋白胶复合支架。纤维蛋白胶将微载体包裹，限制了其流动性，同时微载体也加强了复合支架的力学强度。这很大程度说克服了各自应用于软骨组织工程的缺点。

本研究生物反应器培养条件下，用Cultispher微载体扩增软骨细胞，发现软骨细胞可以在短时间内帖附至微载体表面，并大量扩增。这种扩增软骨细胞的方法可以防止软骨细胞因为去分化而失去分泌软骨细胞外基质的能力。接着，无需胰酶消化，将负载软骨细胞的Cultispher微载体与纤维蛋白胶直接复合，用于修复兔膝关节软骨缺损。这不仅避免了胰酶消化对细胞造成损害，而且避免了因胰酶消化引起的细胞外基质流失。使得组织工程软骨构建物具有更高的质量。

负载有兔软骨细胞的Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合物用于修复兔膝关节软骨缺损。Micro-CT结果显示，MCF组获得更佳的软骨下骨重建。大体观、病理学结果显示，Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架修复兔关节软骨缺损可获得透明软骨修复，修复组织内可见大量具有典型软骨陷窝的软骨细胞，细胞排列有序。而其他两组修复组织主要为纤维组织。

综上所述，Cultispher微载体/纤维蛋白胶复合支架可有效修复兔膝关节软骨缺损，这种组织工程软骨的构建方法为软骨修复提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程