制备缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.008

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (22): 3488-3493.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.22.008

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制备缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架

黄文良¹，叶鹏²，莫刚¹，田仁元¹，马立坤³，阮世强¹，徐林¹，邓江¹

¹遵义医学院第三附属医院，贵州省遵义市 563002；²遵义医学院第一附属医院，贵州省遵义市 563000；³湖南省洞口县人民医院，湖南省邵阳市 422300

收稿日期:2017-05-24 出版日期:2017-08-08 发布日期:2017-09-01
通讯作者: 邓江，主任医师，教授，硕士生导师，遵义医学院第三附属医院，贵州省遵义市 563002
作者简介:黄文良，男，1981年生，广西壮族自治区南宁市人，硕士，主治医师，主要从事四肢与关节研究工作。
基金资助:
遵义市科技创新团队项目(遵市科合社字[2012]16号)；贵州省科技攻关发展项目(黔科合SY字[2013] 3017)；贵州省自然科学技术重点基金(黔科合基础[2016]1420号)；国家自然科学基金(81660367)

Preparation of silk fibroin/chitosan/nano-hydroxyapatite scaffold for sustained release of bone morphogenetic protein-2

Huang Wen-liang¹, Ye Peng², Mo Gang¹, Tian Ren-yuan¹, Ma Li-kun³, Ruan Shi-qiang¹, Xu Lin¹, Deng Jiang¹

¹Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China;²First Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; ³People’s Hospital of Dongkou Country, Shaoyang 422300, Hunan Province, China

Received:2017-05-24 Online:2017-08-08 Published:2017-09-01
Contact: Deng Jiang, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
About author:Huang Wen-liang, Master, Attending physician, Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563003, Guizhou Province, China
Supported by:
the Scientific Innovation Team Project of Zunyi City, No. [2012]16; the Scientific and Technological Research and Development Project of Guizhou Province, No. [2013]3017; the Natural Science Foundation of Guizhou Province, No. [2016]1420; the National Natural Science Foundation of China, No. 81660367

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

药物缓释：将小分子药物与载体通过一定的方式混合，通过扩散、渗透等控制方式，在规定的时间范围内，以设定的浓度持续地释放出来，达到对疾病更有效治疗目的。

骨形态发生蛋白2：大量研究证实，骨形态发生蛋白2是骨缺损修复调控过程中最重要的细胞生长因子。但骨形态发生蛋白2在体内半衰期短，易被降解或体液中流失等问题使其不能持续作用于靶细胞，这就要求反复给予骨形态发生蛋白2才能促进成骨，而且将骨形态发生蛋白2直接注射到组织，骨形态发生蛋白2会快速扩散到临近组织，容易引起不良反应。因此构建能够持续缓释的骨形态发生蛋白2的支架对骨缺损修复具有重要意义。

背景：骨形态发生蛋白2在骨形成及修复过程中起着至关重要的作用，但存在易流失、易降解、难以持续作用等缺点。

目的：探讨缓释骨形态发生蛋白2丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架的制备方法及性能。

方法：将蚕丝脱胶、溶解并提纯得到2%丝素蛋白溶液，将骨形态发生蛋白2溶于2%壳聚糖溶液中，搅拌均匀后与等体积丝素蛋白溶液和适量纳米羟基磷灰石充分混合，采用冷冻干燥法制备成缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物生物支架，作为实验组；以相同浓度骨形态发生蛋白2浸泡丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架材料，作为对照组；采用阿基米德法测定两组支架的孔隙率，扫描电子显微镜观察两组支架表面形貌，万能测试机测试两组支架的抗压强度。将两组支架分别浸泡于PBS中，与不同的时间点采用ELISA法检测骨形态发生蛋白2的释放量。

结果与结论：①两组支架为不规则多孔结构，孔间相通，孔壁凹凸不平，两组支架平均孔径、孔隙率及最大抗压强度比较差异无显著性意义；②实验组第1天的骨形态发生蛋白2释放量为4.63%，释放曲线缓慢上升，第28天之后释放曲线转入平台期；对照组第1天的骨形态发生蛋白2释放量高达58.84%，呈显著的初始爆发释放，并迅速上升，在第10天之后释放曲线转入平台期。两组第1，2，4，10天的骨形态发生蛋白2释放量比较差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架可持续缓慢释放骨形态发生蛋白2。

ORCID: 0000-0003-0123-1559(邓江)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 缓释材料, 骨形态发生蛋白2, 丝素蛋白, 壳聚糖, 纳米羟基磷灰石, 药物缓释, 生物支架, 骨诱导, 骨组织工程, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) is a key to bone formation and repair. However, it has some disadvantages such as easy to lose and degrade and difficult to sustain continuous effect.

OBJECTIVE: To study the preparation and properties of silk fibroin/chitosan/nano-hydroxyapatite (SF/CS/nHA) scaffold loading BMP-2.

METHODS: After silk degumming, dissolution and purification, 2% SF solution was obtained. BMP-2 was dissolved in 2% CS solution, and then fully mixed with equal volume of SF solution and proper amount of nHA. At last, the SF/CS/nHA scaffold loading BMP-2 was prepared using freeze-drying method as experimental group. The SF/CS/nHA scaffold was soaked in the BMP-2 solution as control group. The scaffold porosity was measured by Archimedes method, the surface morphology of the scaffold was observed by scanning electron microscope, the compressive strength was measured by universal testing machine. Scaffolds in the two groups were soaked in PBS, and the release of BMP-2 was measured by ELISA method at different time points.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The scaffolds in the two groups had irregular porous structure, interconnected pores and uneven pore wall. There was no significant difference between the two groups in mean pore diameter, porosity and maximum compressive strength. (2) On the 1^st day, the release rate of BMP-2 was 4.63% in the experimental group, and the release curve increased slowly. After 28 days, the release curve of BMP-2 was transferred to the plateau stage. But in the control group, the release rate of BMP-2 on the 1^stday was 58.84%, and it was a significant initial burst release. The release curve increased rapidly, and was transferred to the platform stage on the 10^th day. The release rate of BMP-2 release was significantly different between the two groups at days 1, 2, 4, 10 (P < 0.05). These results show that the SF/CS/nHA scaffold loading BMP-2 could sustainably and slowly release BMP-2.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Morphogenetic Proteins, Silk Fibroin, Chitosan, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄文良，叶鹏，莫刚，田仁元，马立坤，阮世强，徐林，邓江. 制备缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(22): 3488-3493.

Huang Wen-liang, Ye Peng, Mo Gang, Tian Ren-yuan, Ma Li-kun, Ruan Shi-qiang, Xu Lin, Deng Jiang.

Preparation of silk fibroin/chitosan/nano-hydroxyapatite scaffold for sustained release of bone morphogenetic protein-2

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(22): 3488-3493.

图/表（结果） 4

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引言

材料方法

1.1 设计组织工程支架材料制作实验。

1.2 时间及地点实验于2015年7至12月在遵义医学院中心实验室完成实验。

1.3 材料骨形态发生蛋白2(Sigma，美国)；蚕丝(四川南充市丝绸进出口公司)；壳聚糖(山东潍坊市海之源生物公司)；纳米羟基磷灰石(南京埃普瑞纳米材料有限公司)；纤维素半透膜透析袋(上海普易生物技术有限公司)；碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(江苏南京德宝生化公司)；恒温加热磁力搅拌器(美国C-MAG HS4)；低温冷冻干燥机(美国VIRTIS)；电子分析天平(德国sartorius)；instron 1011材料试验机(英斯特朗公司，美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 丝素/壳聚糖/羟基磷灰石三维复合支架的制备

(1)将蚕丝去污、脱胶及溶解后得到丝素蛋白原液，再用截流分子质量为3 500 u的纤维素半透膜透析袋透析、提纯，得到2%丝素蛋白溶液。

(2)将2%的壳聚糖溶液，将适量粉末状骨形态发生蛋白2溶于溶液中，充分搅拌，使骨形态发生蛋白2最终质量浓度为20 µg/L。

(3)以等体积丝素蛋白及壳聚糖溶液混合，同时称取适量粉末状纳米羟基磷灰石加入混合溶液中，使纳米羟基磷灰石及骨形态发生蛋白2最终浓度分别为2%及10 µg/L，并将混合液于磁力搅拌机上充分搅拌后，倒入铸模中，置于-80 ℃冰箱中过夜，最后通过真空干燥法，获得携带骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架。

(4)将上述所得支架浸入交联剂(含50 mmol/L碳化二亚胺、20 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺和50 mmol/L玛啡琳乙基磺酸)中，室温交联8 h，然后再将支架真空干燥，得到生物支架作为实验组。将前期制备的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架浸泡于含10 µg/L浓度的骨形态发生蛋白2溶液中，48 h后放入真空干燥机低温干燥18 h，得到生物支架作为对照组。

1.4.2 缓释骨形态发生蛋白2细胞因子的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架性能检测

生物支架的表征：①将冷冻干燥的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架在真空下喷金后，用扫描电镜观察其超微结构；每组支架取6个样本，每个样本取4个视野，每个视野取6个孔径并测量其平均孔径的大小；②将支架材料制备成大小为15 mm×8 mm的圆柱体，用instron 1011 材料试验机以1.5 mm/min速度对支架材料进行抗压强度测试，压缩样品长度减少65%为止；③用阿基米德法测量生物支架孔隙率^[11]：量筒中预先放入体积为V₁的无水乙醇，将支架浸入时乙醇体积为V₂，取出支架后剩余乙醇的体积为V₃，按孔隙率(%)=(V₁-V₃)/(V₂-V₃)×100%计算，取6样本的平均值。

生物支架体外缓释骨形态发生蛋白2的测定：取两组支架各6个样本，放入5 mL 0.01 mol/L的PBS(pH=7.4)中，温度37 ℃水浴箱中30 r/min平衡振摇，分别在第1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32天时，两组各取浸泡液1 mL/次并补充等量PBS，利用ELISA测定两组缓冲液中骨形态发生蛋白2水平，通过标准方程分别计算出两组不同时间点骨形态发生蛋白2累计释放的百分率，并绘制骨形态发生蛋白2释放曲线。

1.5 主要观察指标两组生物支架平均孔径、抗压强度、孔隙率及体外释药率。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析，以x(_)±s表示，两组间独立样本比较用t 检验，率的比较采用χ²检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

随着社会经济的快速发展，由外伤导致的骨折日见增多，骨缺损在临床工作中也比较常见。自体骨或异体骨移植是修复骨缺损是目前常用的治疗方法，自体骨移植由于具有取材方便、操作简单、骨传导及骨诱导较好等优点，是临床治疗骨缺损的“金标准”。但自体骨来源不足，尤其是比较大的骨缺损。而异体骨移植有感染传染病及免疫排弃反应的风险。因此，在自体骨移植或者异体骨的移植治疗时存在不足^[12]，使其临床应用受限。目前组织工程技术修复骨缺损是研究的热点^[13-17]。在组织工程研究的3大要素当中，细胞因子是研究的重点之一。

在骨的形成和重建过程需要一系列的细胞生长因子共同调控诱导成骨细胞增殖分化，如骨形态发生蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子1等，其中以骨形态发生蛋白为趋化、诱导成骨细胞增殖分化修复骨缺损的首选重要因子^[18]。大量研究证实，骨形态发生蛋白2是骨缺损修复调控过程中最重要的细胞生长因子^[19]。但骨形态发生蛋白2在体内半衰期短，易被降解或体液中流失等问题使其不能持续作用于靶细胞，这就要求反复给予骨形态发生蛋白2才能促进成骨^[20]，而且将骨形态发生蛋白2直接注射到组织，骨形态发生蛋白2会快速扩散到临近组织，容易引起不良反应。因此构建能够持续缓释的骨形态发生蛋白2的支架对骨缺损修复具有重要意义^[21]。

目前研究药物缓释制备工艺主要有基因工程技术、静电纺丝技术、3D打印技术及直接贴附技术等工艺：①基因工程技术是目前研究的热点之一，其将各种外源性的细胞生长因子基因作为目的基因并进行标记，通过物理、化学及病毒载体等方法，把目的基因导入受体种子细胞中，再通过细胞增殖分裂时持续不断表达具有活性功能的细胞生长因子，通过自分泌或旁分泌诱导种子细胞向目的细胞方向分化。通过此方法可解决体内应用的上述难题^[22-24]，但将其临床应用仍存在一段距离，且价格昂贵；②静电纺丝技术的原理主要是带电的聚合物液滴在电场的作用力下被拉成细丝状，通过蒸发或固化，形成纤维网状材料提高载药量，并通过纳米纤维的逐渐降解实现局部缓控释药^[25]。其不足之处是以单一天然或合成材料作为纺丝原料时，机械性能及生物相容性难以满足应用要求；③3D打印技术是目前最有前景的缓释技术，3D打印出来的缓释支架又赋予组织工程支架新的特性。Sandler等^[26]采用3D打印出抗菌支架，抗生素5 d仅释放25%左右，持续释放可长达48 d。3D打印技术应用于骨组织工程支架已取得了较好成果，但费用昂贵仍是限制其应用的最大难题；④直接贴附技术主要是通过物理扩散或降解的方法来实现药物从生物可降解材料，这种技术常见于制备抗生素缓释支架材料，作为局部抗感染药物缓释系统^{[27- 28]}。Krishnan等^[29]将环丙沙星与羟基磷灰石和明胶混合，制备出缓释环丙沙星多孔支架，其抑菌作用可持续60 d。但此技术存在释放时间短、释放速度不稳定、不完全释放等缺点，仍需不断改进材料和制备的工艺。为此，此次研究在前期成骨制备支架基础上，进一步改善技术工艺，尝试将骨形态发生蛋白2溶入丝素蛋白、壳聚糖、纳米羟基磷灰石溶液，试图构建缓释骨形态发生蛋白2的生物支架，增强其骨诱导性。

目前研究显示高分子壳聚糖溶液为凝胶状，具有促进吸收、黏附和可控制药物释放的功能，负载蛋白类药物制备成支架，能够对蛋白进行有效保护，避免药物的快速降解，提高药物的稳定性，增强材料的生物相容性^[30-41]。此次研究在支架制备时，将壳聚糖溶液先与骨形态发生蛋白2充分混合后，再与丝素蛋白、纳米羟基磷灰石溶液混合，使骨形态发生蛋白2达到缓释作用。实验组将生长因子负载于丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架上，第1天的释放量仅为4.63%，第2，4天的释放分别为9.32%和18.18%，之后一段时间释放曲线缓慢上抬，是因为分布于支架材料内部的骨形态发生蛋白2缓慢释放出来，28 d之后释放曲线转入平台期，生物材料对骨形态发生蛋白2的释放起到缓释作用，未出现显著突释现象，显著提高了骨形态发生蛋白2的生物利用度。对照组通过浸渍吸附，第1天的释放量高达58.84%，第2，4天释放曲线迅速上抬，第10天之后释放曲线转入平台期，释放过程出现了明显的初始爆发释放现象。两组支架释放曲线进入平台期后支架中残存的骨形态发生蛋白2含量已很低，两组数据比较差异有显著性意义(P < 0.05)，充分体现了实验组支架达到了缓释骨形态发生蛋白2作用，其作用机制主要为壳聚糖对药物的缓释作用^[42]。

对于理想的骨组织工程材料而言，良好的理化性质是种子细胞生长的必备条件。此次研究中，实验组利用真空干燥法制备缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架的平均孔径为(87.32±0.38) μm，孔隙率为(92.41±0.27)%，该范围的孔径及孔隙率有利于种子细胞的种植和生长^[⁴³^-⁴⁴^]，有利于代谢产物的排泄和营养成分的供应，促使接种细胞通过支架交通孔隙增殖分化；支架的最大抗压为(0.19±0.03) kN，这可给种子细胞提供机械支持。将两组支架孔径、孔隙率及抗压强度比较显示，加入骨形态发生蛋白2后对支架的理化性质变化不大，但提高了支架材料的骨诱导性能。

因此，此次研究通过冷冻干燥法制备的缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石支架材料，不仅理化性质良好，而且在体外可获得长达28 d的持续缓慢释放骨形态发生蛋白2效果，能够满足构建组织工程骨缓释载体的要求。但该生物支架体内的降解吸收、体外生物相容性以及体内促进成骨情况需待下一步继续研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

制备缓释骨形态发生蛋白2的丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石生物支架

Preparation of silk fibroin/chitosan/nano-hydroxyapatite scaffold for sustained release of bone morphogenetic protein-2

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