新型生物可降解支架材料生物特性及在损伤胆道修复中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.30.004

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
生物可降解胆道支架：生物可降解胆道支架材料应该具备良好的生物学性能。考虑到胆道损伤的特点，支架材料应该具备良好的可降解性，随着治疗时间的延长，在完成其使命后可以完全降解，以免导致吻合口长期存在异物，引发一系列不良后果。同时还要具有理想的降解速度，以满足治疗的需要。
胆道损伤：临床手术操作等均可能会导致胆道损伤的出现，损伤后的修复难度较大。胆管壁热灼伤是一种常见的胆道损伤，临床治疗可以选择直接缝合或者进行胆总管空肠吻合，但存在一定的不足之处。

背景：多种原因会导致胆道损伤的出现，损伤后的修复重建难度较大。支架置入是一种常用的方法，但以往大多使用金属或者塑料支架，容易导致一定不良反应的出现。
目的：探讨新型生物可降解支架材料的生物特性及其在胆道损伤中的修复效果。
方法：利用人新鲜胆汁检测新型生物可降解支架材料生物特性，观察其在不同时间的降解情况。纳入巴马小型猪30只，随机分为观察组和对照组，每组15只，均制备胆道损伤模型。对照组实施胆管间断缝合修复，观察组实施新型生物可降解支架联合大网膜修复治疗。观察支架的生物学性能，对比观察2组动物不同时间肝酶及血总胆红素检测水平，苏木精-伊红染色、Masson染色结果以及α-平滑肌肌动蛋白免疫组化检测结果。
结果与结论：①术前及术后1，3，6个月对2组的肝酶及血总胆红素进行检测，不同时间组间及组内比较差异均无显著性意义(P均>0.05)；②苏木精-伊红染色和Masson染色观察结果发现，术后不同时间观察组的吻合口炎性反应与纤维增生程度均轻于对照组；③术后1，3个月，2组α-平滑肌肌动蛋白阳性评分均呈现出不断增加的情况，术后3个月均达到最大值，之后开始下降。且术后3，6个月，观察组的α-平滑肌肌动蛋白阳性评分均显著低于对照组(P < 0.05)；④结果表明，制备的新型生物可降解支架材料具有良好的生物特性，应用于胆道损伤中可以获得理想的修复效果。

ORCID: 0000-0002-5803-5076(马利锋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 胆道损伤, 支架, 可降解材料, 生物特性, 肝酶, 血总胆红素, 修复

Abstract:

BACKGROUND: A variety of factors contribute to biliary injury that is difficult to be repaired. Stent implantation is extensively used for bile duct injury, but either scaffolds made by metal or plastics can lead to certain adverse reactions.
OBJECTIVE: To explore the biological characteristics of a novel biodegradable scaffold and its repair effects on bile duct injury.
METHODS: The biological characteristics of the novel biodegradable scaffold were detected by fresh bile, and its degradation was observed at different time points. Thirty Bama mini pigs were included and were randomly divided into observation group (n=15) and control group (n=15). After bile duct injury models were prepared, the control group was subjected to the bile duct interrupted suture, while the observation group was subjected to the novel biodegradable scaffold combined with omentum majus. The biological properties of the scaffolds were observed. Hepatic enzymes and serum total bilirubin levels were detected, as well as hematoxylin-eosin staining, Masson staining and immunohistochemistry detection of α-smooth muscle actin were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: Before and 1, 3 and 6 months after surgery, hepatic enzymes and total bilirubin of two groups were detected, and neither intra-group nor intergroup comparisons had significant differences (P > 0.05). Hematoxylin-eosin staining and Masson staining revealed that inflammatory reactions and fiber hyperplasia at the anastomotic site in the observation group were lighter than those in the control group at different time points after surgery. The α-smooth muscle actin-positive scores in both two groups were in a rise at 1 and 3 months after surgery, and peaked at the 3rd month, and then began to decline. Moreover, the α-smooth muscle actin-positive scores in the observation group were significantly lower than those in the control group at 3 and 6 months after surgery (P < 0.05). These results show that the novel biodegradable scaffold has good biological characteristics and can obtain ideal repair effects in the bile duct injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Billary Tract, Stents, Immunochemistry, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 10

2.1 新型生物可降解支架材料的生物特性随着时间的推移支架开始逐渐发生降解，支架管壁厚度逐渐变小(图1)，内径逐渐变大(图2)，并处于匀速的失重状态(图3)，横坐标均为时间(d)。扫描电子显微镜观察支架表面形态，降解前材料表面光滑，4周时表明出现大量孔洞，可见细小片状脱落，10周时材料表面呈较均匀的鳞片状改变，并可见较多片状脱落(图4)。

2.2 实验流程与动物数量分析入组的动物均进入最后的结果分析，未出现死亡和脱落现象，实验流程见图5。

2.3 两组动物一般情况 2组动物均顺利完成整个手术，术后未出现黄疽和胆漏、切口感染等。

2.4 两组不同时间肝酶及血总胆红素检测结果术前及术后1，3，6个月对2组的肝酶及血总胆红素进行检测，不同时间组间及组内比较差异均无显著性意义(P均> 0.05)，见表1。

2.5 两组苏木精-伊红染色与Masson染色结果见图6及7。术后1个月对照组可观察到黏膜下固有层胶原出现显著的增生现象，并伴有纤维化，新生胆管上皮生长并存在腺体增生，吻合下方存在丰富的新生小血管，观察组血管增生程度较之对照组较轻。

术后3个月观察组吻合口可见新生胆管上皮生长，并伴腺体增生现象，存在少量慢性炎症细胞浸润；对照组腺体增生程度较轻，存在慢性炎症细胞浸润，且有明显的黏膜下胶原增生及纤维化，胆管壁纤维化明显增厚。

术后6个月2组吻合口表面均可观察到单层柱状上皮覆盖，且排列整齐有序，黏膜下固有层纤维组织存在轻微的增生，胶原纤维呈有序排列。

2.6 两组不同时间α-平滑肌肌动蛋白免疫组化检测结果术后不同时间进行α-平滑肌肌动蛋白免疫组化检测，术后1个月，2组均存在少量淡棕黄色阳性细胞；术后3个月，对照组存在大量深棕黄色阳性细胞，观察深棕黄色阳性细胞数量明显偏少；术后6个月，2组深棕黄色阳性细胞数量较之术后3个月均出现减少，但对照组深棕黄色阳性细胞数量仍多于观察组(见图8)。评分结果显示，可得术后1，3个月，2组α-平滑肌肌动蛋白阳性评分均呈现出不断增大的情况，术后3个月均达到最大值，之后开始下降。且术后3，6个月，观察组的α-平滑肌肌动蛋白阳性评分均显著低于对照组(P < 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2015年5至12月在河北医科大学附属第二医院实验室完成。

1.3 材料纳入巴马小型猪30只，均为雄性，体质量25 kg左右，由广州中医药大学(大学城校区)实验动物中心提供，许可证号：SYXK(粤)2014-0085。按随机数字表法分为2组，每组15只，均制备胆道损伤模型，对照组实施胆管间断缝合修复，观察组实施新型生物可降解支架联合大网膜修复治疗。新鲜人胆汁由本院标本室提供。实验相关方案均提交本院医学伦理部门审核，并经批准，符合相关伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 支架材料生物学特性检测设计空腔脏器吻合支架外形，开发相应模具利用癸二酸、丙二醇通过注塑的办法制备聚癸二酸丙二醇聚酯支架。将支架浸泡于新鲜人胆汁中，连续观察期4个月或支架崩解。每周取出试件进行观察，洗涤烘干后测量不同时间支架的内径和管壁厚度，并计算支架的失重率。计算方法：失重率=(原始质量-残质量)/原始质量×100%^[6-7]。取4，10周的支架各1个，低电流喷金后扫描电镜观察支架表面形态。

1.4.2 胆道损伤动物模型制备与分组治疗^[8-11] 动物随机分为2组，均制备胆道损伤模型。动物常规禁食12 h，戊巴比妥钠肌肉注射麻醉。待达到理想麻醉效果之后，动物取仰卧位，四肢固定在手术台上。常规消毒备皮之后，于剑突下正中做切口，切口长度为6-8 cm。进腹后依次推开胃、小肠，寻找胆总管，电刀烧灼至出现穿孔现象，制备胆道损伤模型。对照组实施胆管间断缝合修复，观察组实施新型生物可降解支架联合大网膜修复治疗。观察组在距离受损胆管两端正常胆管组织端做荷包缝合，先于胆总管的近端置新型生物可降解支架，使支架头侧凸环超过荷包线，收紧荷包线，把近端胆管捆绑于支架头侧凸环的下方。同法将胆总管远端捆绑固定于尾侧凸环的上方以重建胆道的连续性，控制捆绑力度，以卡住凸环、胆汁无渗漏且支架无法滑动为标准，避免过于用力导致荷包线对胆管的切割，游离部分大网膜，经修整后缝合固定于损伤胆管表面，确保网膜血供，避免张力。腹腔内彻底止血，生理盐水冲洗后在吻合处旁置腹腔引流管并引至腹外固定腹膜层和肌层用丝线间断缝合关闭，皮肤和皮下组织使用丝线间断缝合。对照组直接按照常规间断缝合胆管壁，余步骤同观察组。

1.4.3 术后处理 2组动物术后均予以常规喂食、喂水，并予以头孢唑林钠肌肉注射以抗感染。

1.4.4 肝酶及血总胆红素检测^[12-14] 术前及术后1，3，6个月分别收集2组动物的前腔静脉血送检，检测肝酶及血总胆红素，并观察动物的肝功能变化，检测指标包括碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶及总胆红素。

1.4.5 苏木精-伊红染色、Masson染色术后1，3，6个月，分别麻醉后处死2组各5只动物，获得胆管组织，分为3份。其中一份用于进行苏木精-伊红染色，常规石蜡包埋、脱蜡后添加甲基苯进行处理，梯度乙醇脱水后添加苏木精进行染色，水洗后进行伊红染色。乙醇洗涤后利用二甲苯进行洗涤，中性树胶封固后置于镜下进行观察并摄片。另一份进行Masson 染色，常规石蜡包埋、脱蜡后添加天青、Harrisl进行细胞核染色，胞浆染色后利用醋酸进行洗涤，添加磷酸钼，作用2 min后去掉磷酸钼，醋酸洗涤，淡绿染色后再次进行醋酸洗涤。常规脱水、封固，置于镜下进行观察并摄片。

1.4.6 α-平滑肌肌动蛋白免疫组化检测^[15] 术后6个月，将上述第3份切片置于二甲苯中，10 min后取出，利用无水乙醇进行洗涤，添加甲醇、双氧水孵育后进行热修复。冷却至室温条件，添加山羊血清进行封闭，孵育15 min 后添加α-平滑肌肌动蛋白一抗进行孵育。1 h后利用PBS进行洗涤，并添加聚合物增强剂，孵育10 min后添加EnVision^TM Pplus/HRP山羊抗鼠/兔聚合物。置于室温环境下进行孵育，30 min后利用PBS进行洗涤，添加DAB显色剂。待显色完全后利用蒸馏水进行洗涤，添加苏木精复染。梯度乙醇脱水后加入二甲苯，中性树脂封固，烘干后置于镜下观察。α-平滑肌肌动蛋白阳性表达于肌成纤维细胞的胞浆、血管及胆管平滑肌、中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞中，镜下以细胞浆染为棕黄色作阳性。按照阳性细胞的着色强度进行评分，评分标准为：①“-”为阴性细胞，0分。②“+”为细胞膜和/或细胞浆染成淡棕黄色，1分。③“+++”为深棕色，3分。④“++”则介于两者之间，2分。阳性细胞面积评分：①阳性细胞所占面积小于总细胞数的25%以下，1分。②25%-50%，2分。③> 50%，3分。2项分数相加，即为该片得分。每个时间点的得分以4个样本的平均值表示。

1.5 主要观察指标观察支架的生物学性能，观察2组动物术前及术后1，3，6个月肝酶、血总胆红素检测水平以及苏木精-伊红染色、Masson染色结果，并比较2组术后1，3，6个月α-平滑肌肌动蛋白免疫组化评分。

1.6 统计学分析使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，差异存在显著性意义的标准为P < 0.05。

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讨论

临床手术操作等均可能会导致胆道损伤的出现，损伤后的修复难度较大^[16]。例如，腹腔镜胆囊切除术是开展最广泛的手术之一，但术中胆道损伤是难以避免的严重并发症，尤其是胆管横断损伤，一旦发生需要多次开腹手术，一些患者甚至可能死于肝功能衰竭。胆管壁热灼伤也是一种常见的胆道损伤，临床治疗可以选择直接缝合或者进行胆总管空肠吻合，但存在一定的不足之处^[17-19]。文章中选择通过胆管支架联合大网膜方式进行修复治疗，以期为临床胆道损伤的治疗提供一定的参考依据。

研究过程中需要使用一定的胆道支架，相应的支架材料应该具备良好的生物学性能。考虑到胆道损伤的特点，支架材料应该具备良好的可降解性，随着治疗时间的延长，在完成其使命后可以完全降解，以免导致吻合口长期存在异物，引发一系列不良后果^[20]。同时，还要具有理想的降解速度，以满足治疗的需要^[21-23]。

Heistermann等^[24]研制了一种被覆自体静脉的可降解胆管支架，支架材料仍为聚乳酸，该支架被植入12头猪体内用于连接胆管，第3，4，5个月后各处死2只猪行组织学检查。6个月后处死剩余6只猪，发现4个月后支架已经完全降解，自体静脉移植物很好的衬于胆道内皮，从而将胆道连接。Meng等^[25]通过体内和体外实验测试一种自膨螺旋型左旋聚乳酸支架，将支架置入于胆管损伤的犬模型体内及置入人体内。结果表明，左旋聚乳酸生物可降解支架不但具有很好的生物相容性，还具有一定的自净能力，可以清除黏附的胆泥等。这种自膨式支架的特性使得其在内镜下置入成为可能，当然，还需要更加深入的研究。文章中利用人新鲜胆汁检测新型生物可降解支架材料生物特性，观察其在不同时间的降解情况。结果显示，随着时间推移支架开始逐渐发生降解，支架管壁厚度逐渐变小，内径逐渐变大，并处于匀速失重状态。上述结果表明，该支架材料具有良好的生物学特性，可稳定降解，为治疗提供足够的支撑作用，并最终被降解^[26]。实验过程中，还利用该支架对存在胆道损伤的动物进行修复治疗。术后不同时间检测发现，术前及术后1，3，6个月对2组的肝酶及血总胆红素各项指标进行检测，不同时间组间及组内比较差异均无显著性意义(P均> 0.05)。即提示两种治疗方案均不会对动物的肝酶及血总胆红素水平产生不良影响。另外，研究结果还显示，苏木精-伊红和Masson染色观察可以发现，术后不同时间观察组吻合口炎性反应与纤维增生程度均轻于对照组。上述结果表明，术后不同时间观察组的吻合口炎性反应与纤维增生程度均轻于对照组。分析出现上述结果的原因，可能是因为在观察组的修复治疗中，没有对胆管予以过多的游离，所使用的支架也具有理想的生物相容性和支撑作用，术后炎症反应较轻，纤维化程度也相对较轻^[27]。在发生胆道损之后，成纤维细胞会大量的转化为肌成纤维细胞，导致大量细胞外基质的出现，例如胶原等^[28-29]。这一情况的出现，极易导致过度愈合的出现，愈合部位也会出现纤维增生等情况，导致术后胆道瘢痕狭窄的发生^[30-31]。α-平滑肌肌动蛋白是成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的重要标志之一，表达于肌成纤维细胞胞浆之中。其中表达水平的强弱与肌成纤维细胞状态之间密切相关，可以较为直观的体现出肌成纤维细胞的数量和功能等。在文章中为了进一步比较2组愈合部位的情况，选择对不同时间的α-平滑肌肌动蛋白表达情况进行免疫组化检测和评分。经检测发现，术后1个月2组均存在少量淡棕黄色阳性细胞；术后3个月对照组存在大量深棕黄色阳性细胞，观察深棕黄色阳性细胞数量明显偏少；术后6个月2组深棕黄色阳性细胞数量较之术后3个月均出现减少，但对照组深棕黄色阳性细胞数量仍多于观察组。对应的评分结果也显示，术后3，6个月，观察组的α-平滑肌肌动蛋白阳性评分均显著低于对照组。上述结果表明，术后前3个月是吻合口瘢痕形成的重要阶段，之后吻合口瘢痕会逐渐趋于稳定状态。

梁岳龙^[32]通过研究新型生物可降解支架材料的生物学特性，并将其应用于胆道损伤动物实验之中发现，支架具有良好生物学特性及可在胆道修复中获得理想的效果，与文章的实验结果一致。分析出现这一结果的原因，是因为在术后的前3个月，观察组使用的可降解支架发挥出重要的支撑作用，为吻合口提供了所需的力学支撑，对抑制纤维组织过度增生予以有效的抑制。支架可以在体内缓慢降解，留置时间较长，体外不需要携带引流管。如果长期放置在胆管内，对胆管壁黏膜没有损害，不会引起组织纤维化，上皮增生性反应^[33]。进而有效防止瘢痕增生等出现，避免发生术后胆管狭窄^[34]。

综上所述，实验制备了新型生物可降解支架材料，其具有良好的生物特性，应用于胆道损伤中可以获得理想的支撑效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程