血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白在骨组织工程中的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：在临床中由于骨质疏松性骨折、创伤、先天性骨发育不良、进行性骨骼紊乱引起的大段结构性骨缺损非常常见，组织工程骨为骨缺损的修复提供了新希望。骨组织工程研究中关于生长因子的研究较多，已取得了一些成果，如何在时间上控制各种不同生物活性的生长因子是研究热点。

目的：综述血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白在血管化组织工程骨中的研究进展。

方法：由第一作者用计算机检索中国期刊全文数据库(CNKI：1990至2015年)Medline(1990至2015年)数据库，检索词分别为“成骨因子、成血管因子、组织工程骨、骨修复、血管化、血管内皮生长因子、骨形态发生蛋白、序贯释放、种子细胞、细胞支架”和“osteogenic factors，angiogenic factors，tissue engineering bone，bone repair，vascularization，VEGF，BMPs，sequential release，seed cells，cytoskeleton”，语言分别设定为中文和英文。检索有关血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白在骨修复作用中的研究，并总结作用机制及研究方向。

结果与结论：共检索到313篇文献，按纳入及排除标准筛选后，纳入文章87篇。结果表明，骨缺损的重建伴随着多种不同的生物活性分子，各自具有不同的潜能和效率。血管和成骨是骨修复两个最为重要的过程，成骨生长因子在维持骨骼结构和骨形成中发挥重要的作用，而成血管生长因子可以为组织的生长、分化和功能化提供氧气和营养物质，双因子或多因子联合作用是目前但骨组织工程中的一个发展方向，成骨与成血管生物因子比单独使用其中一种具有更好的成骨效果，但是控制外源性成骨与成血管生物因子的释放剂量是在治疗过程中的关键研究问题。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 成骨因子, 成血管因子, 组织工程骨, 骨修复, 血管化, 血管内皮生长因子, 骨形态发生蛋白, 序贯释放, 种子细胞, 细胞支架, 天津市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Segmental bone defects resulting from osteoporotic fractures, trauma, congenital bone dysplasia and progressive bone disorder are very common, and bone tissue engineering provides a new approach to bone defect repair. Growth factors related to bone tissue engineering bone have been reported a lot and have achieved some results. How to mimick the natural timing of different growth factors with different bioactivities has become the current hotspot in bone repair.
OBJECTIVE: To review the new developments in vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein in bone tissue engineering.
METHODS: The first author searched CNKI (1990/2015) and Medline database (1990/2015) for related articles using the key words of “osteogenic factors, angiogenic factors, tissue engineering bone, bone repair, vascularization, vascular endothelial growth factor, bone morphogenetic protein, sequential release, seed cells, cytoskeleton” in Chinese and English, respectively. Mechanism of action and research direction about vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein were summarized.
RESULTS AND CONCLUSION: Totally 313 papers were searched initially, and finally 87 papers were enrolled in result analysis. The results show that different growth factors play different roles in bone repair. Vascularization and osteogenesis are the most important processes in bone repair. The osteogenic factors play an important role in maintaining bone structure and bone formation. The angiogenic factors can provide oxygen and nutrients for tissue growth, differentiation and functionalization. The combination of osteogenic and angiogenic factors has a better osteogenic effect than osteogenic or angiogenic factors used alone. However, the most important problem is how to control the exogenous osteogenesis and the release dosage of angiogenic factors in bone repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Stents, Vascular Endothelial Growth Factors

中图分类号:

R318

纪经涛，胡永成，夏群，苗军，陈晓鹏，方程. 血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白在骨组织工程中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5356-5363.

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图/表（结果） 1

2.1 纳入资料基本概况纳入文章87篇，其中中文文章2篇，英文文章85篇，其中骨修复研究背景类文章4篇，骨形态发生蛋白研究背景类文章29篇，血管内皮生长因子研究背景类文章38篇，血管化组织工程骨研究背景类文章16篇。各类文章对血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白在组织工程骨中的应用进行了阐述。检索流程图见图1。 2.2 纳入资料的研究结果特征

2.2.1 骨形态发生蛋白在骨修复中的作用生长因子是由细胞分泌的蛋白质，其主要作用是与相应的靶细胞结合而发挥功能^[7-8]。自骨形态发生蛋白发现25年以来，学术和商业界上展开了以骨形态发生蛋白为基础治疗骨重建的研究。骨重建过程中，对骨形态发生蛋白基因时间和空间上表达的信号分析显示其非常类似于骨发生和骨折愈合。据此，骨形态发生蛋白在空间和时间上的动态表达对骨功能是必需的。目前，临床上已经使用骨形态发生蛋白2分子治疗临界骨缺损，取得了一定疗效^[9-10]。有研究认为骨形态发生蛋白2有希望替代自体骨移植来治疗骨缺损不愈合、胫骨开放骨折、脊柱融合等，来增加骨修复的速度^[11-12]。骨形态发生蛋白属于转化生长因子β家族蛋白；是由2个单体以1个硫化物键结合而成的一种二聚体分子^[13]。 骨形态发生蛋白在骨骼中的表达：骨形态发生蛋白在维持骨骼结构和骨形成中发挥重要的作用。研究最多的实验动物是小鼠和鸟类，其间骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7的mRNAs位于外胚层脊的顶部^[14]，随着发展，骨形态发生蛋白2在软骨前体细胞和间质中也发现聚集。这些研究表明骨形态发生蛋白发挥形态功能需要时间和空间上序贯表达。Alexanderd及Monteiro等^[15-16]报道通过转基因小鼠和具有骨形态发生蛋白反应元件可以驱动lacZ和eGFP基因的斑马鱼，对胚胎骨形态发生蛋白信号的动力做了研究，结果表明骨形态发生蛋白信号在肢体发育的早期限制在顶外胚层嵴(apical ectodermal ridge，AER)，此后局限在骨的软骨内骨化的软骨前体细胞浓集。另外，骨形态发生蛋白反映原件在肢体指间间质的活性也与血管化的发展相关。因此，这些数据表明骨形态发生蛋白信号在空间和时间上序贯表达与软骨和骨胚胎发育特定的形态相关。

骨形态发生蛋白在骨愈合过程中的作用：损伤愈合过程中在胚胎发育时的很多修复程序被重新激活^[17]。因此，骨折区域的新骨形成是通过结合软骨内化骨和原始骨化的过程，这个过程中需要骨形态发生蛋白^[18]。Tsuji等^[19]认为骨形态发生蛋白2是骨形成中必不可少的因子，缺少骨形态发生蛋白2甚至可以抑制止骨折的早期修复，即便补充上调骨形态发生蛋白4和7也无法逆转。Bais等^[20]研究证实，骨形态发生蛋白2不但将间充质干细胞聚集到骨愈合部位，还通过成骨转录因子Runx2为成骨细胞的矿化提供必要的信号。

骨折愈合过程会激活很多促成骨因素，但是在表达时间上有所不同。骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7是经过FDA认证的最强的成骨诱导因子，允许在临床使用。骨形态发生蛋白2在骨折愈合过程中的早期升高，而骨形态发生蛋白7的表达比骨形态发生蛋白2要晚，两周以后达到高峰。Huri等^[21]研究证实以序贯的方式携带成骨生长因子(骨形态发生蛋白2早期，骨形态发生蛋白7晚期)具有积极的效应，将它们包被入PLGA和PHBV制作的不同的纳米颗粒中，使其具有不同的释放率，在体内可提高这些生长因子在时间上的生物利用效率。随着骨折愈合过程的进行，骨形态发生蛋白具有时间和空间上是波动的方式表达。在小鼠长骨中，骨形态发生蛋白2的mRNA在骨折后很快被诱导产生，后出现暂时性的降低，随后当软骨骨痂矿化时又出现第2次高峰，骨形态发生蛋白2表达在伤口愈合后又回到基线水平。与骨形态发生蛋白2相比，骨形态发生蛋白3、4、7和8只有一次高峰^[22]。在小鼠和人类组织中，骨形态发生蛋白在蛋白水平出现与转录水平相一致的波动，骨形态发生蛋白会出现在原始软骨细胞、成骨细胞和骨折时骨痂中骨膜细胞中^[23]。此外，骨形态发生蛋白也在重建部位肉芽组织和内皮细胞中表达^[24]。Sojo等^[25]对不同的骨形成模型的研究发现，在牵张性骨生成模型中骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白4在牵张后第5天才表达，第7天达到高峰，2周后下降。此外，Matsubara等^[26]同样在牵张性骨生成模型中，发现从骨膜和周围软组织中散发出来新血管组织成为骨形态发生蛋白2的来源。Maes等^[27]认为由于血管周围的前体成骨细胞与内皮细胞共聚集到骨痂，具有启动骨化的作用，骨重建过程中，骨形态发生蛋白局限在新生血管周围可以识别促进骨生成的间充质干细胞。因此，骨形态发生蛋白在空间和时间上序贯表达决定了骨重建部位血管新生和骨生成。然而，Kamiya等^[28]和Seeherman等^[29]研究表明骨形态发生蛋白信号可以通过骨形态发生蛋白受体促进小鼠和非人类灵长类动物骨缺损部位的骨吸收，说明骨形态发生蛋白在骨发育和重建的过程中具有合成代谢和分解代谢的双重作用。

骨形态发生蛋白与种子细胞联合修复骨缺损：Li等^[30]报道了利用脂肪来源干细胞和骨形态发生蛋白2的来治疗骨缺损。通过X射线检查，在转染16周后的组织学和组织形态计量学评价表明，骨形态发生蛋白2基因修饰的脂肪来源干细胞促进了新骨形成。因此，其得出结论骨形态发生蛋白2基因修饰的脂肪来源干细胞可增强实验动物的骨修复能力。Knippenberg等^[31]使用骨形态发生蛋白2对骨髓间充质干细胞诱导成骨，通过骨形态发生蛋白2对细胞进行15 min的诱导进行成骨分化，他结果显示骨形态发生蛋白2诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化，只需15 min 骨形态发生蛋白2即可诱导成骨被触发。Hollinger等^[32]研究了一种复合重组人骨形态发生蛋白2和再生骨胶原。重组人骨形态发生蛋白2联合可吸收胶原(重组人骨形态发生蛋白2胶原)治疗单侧临界骨缺损，并与未经处理的临界骨缺损进行对比。结果发现联合重组人骨形态发生蛋白2的胶原可以有效的恢治疗结构性骨缺损。

2.2.2 血管内皮生长因子在骨修复中的作用目前，组织工程主要难点是缺乏足够的血管系统。目前组织工程中血管化组织的构建方法主要有2种：第一种方法是基于内皮细胞及其形成新生血管的能力，即新血管形成。因此，预血管化技术是综合了生物分子，如生长因子、细胞因子、多肽和蛋白，以及细胞共同参与心血管形成。第二种方法是目前较常用的以支架为基础的技术，将血管包被入自然来源的支架不同于合成制造的基质。

骨缺损的重建伴随着多种不同的生物活性分子，各自具有不同的潜能和效率。除了骨诱导外，血管生成对于合适的骨重建也是必须的，组织构建过程中最关键的是产生和维持有功能的微血管网络，为组织的生长、分化和功能化提供氧气和营养物质^[33-34]。血管新生的过程是从已经存在的血管网络中形成新的血管。这些新形成的血管对于足够的营养供应其关键作用，可以运输大分子，帮助细胞侵入以及骨愈合过程中合适的代谢微环境。因此，当缺乏足够的微血管网络时可以使植入的工程组织细胞缺氧而死亡，那些促进血管新生的生长因子对于骨折愈合过程中的成骨反应也是必要的。

血管内皮生长因子作用方式：成血管生长因子是血管生成强有力的启动因素。他们可以激活内皮细胞，刺激他们以因子的浓度梯度募集。此外，它们促进细胞整合，血管形成和成熟。主要上调的成血管生长因子是血管内皮生长因子，成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子。另外细胞因子，如血小板衍生生长因子和转化生长因子β也参与了一个复杂的过程，作为间接成血管因子参与内皮化管的再生。为了更加了解所有生长因子的功能，Nomi等^[35]认为采用成血管因子是作为组织工程新血管生成常用的方法。为了更有效的使用成血管因子，一些问题比需要解决。体内的成血管因子高度不稳定，因此，需要大量注射生长因子被长期局部注射替代^[36]。开发新的材料方法用于克服昂贵生长因子的不稳定。这些材料包括哪些可溶性蛋白，能够在植入部位以时间依赖的方式释放。因此，设计出具有不同释放速率的自然、合成及复合的材料^[37-40]。具有可降解、多孔结构的生物材料或预包被微球能够提高生长因子的使用效率^[41]。对于长期使用的方法，生长因子能够包被入生物降解的多聚物，例如PLGA或PLL。设计那些系统的降解速率来控制生长因子的释放速率。为了控制其传递，Layman等^[42]设计了白蛋白离子微球可以控制两种生长因子以时间依赖的方式释放。

另一种方法是将表达生长因子的基因感染细胞，其可以高表达成血管的生长因子。一旦植入支架，这类细胞能够持续提供生长因子。Yang等^[43]比较了包被血管内皮生长因子质粒DNA的间充质干细胞，再将其负载支架。作为对照组，他们采用空载体转染间充质干细胞后负载支架。发现单独血管内皮生长因子转染组可明显提高血管化和骨生成。血管内皮生长因子转染的细胞可促进血管化和支架降解的进程。Zisch等^[44]采用同样的方法在心肌梗死中也能观察到同样的结果，提高了血流灌注。在成血管治疗中，最关键和重要的方面是生长因子使用的剂量和复合形式，如高水平的血小板衍生生长因子使血管不稳定^[45-46]，过表达Ang-1提高3D多空水凝胶支架的血管化可能使得内皮细胞畸形生长，减少血管漏隙^[47-48]。目前，研究多采用一种生长因子，但为了模仿体内成血管过程，往往需要多种生长因子相互作用。目前血管内皮生长因子联合Ang-1，以及血管内皮生长因子联合胰岛素生长因子1和SDF-1取得了良好的疗效，在宿主周围组织中可以观察到诱导形成更多的更多、更大有功能的血管网络。然而，为了实现高反应蛋白可控的作用方式，同时避免控制条件下的不良反应，目前研究的焦点集中在使生长因子在局部发挥作用^[49]。Saik等^[50]使用共价结合的血小板衍生生长因子BB到多聚水凝胶上促进血管化，而共价结合两种生长因子血小板衍生生长因子BB和成纤维细胞生长因子2与单因子相比可以明显提高内皮细胞的迁移^[50-51]。除了固定生长因子外，也可以使修饰生物材料结合特异性的粘附多肽或细胞外基质分子来诱导血管化^[52]。

血管内皮生长因子在骨形成过程中的作用：血管新生因子在骨愈合过程中的主要作用是使软骨骨痂转化为新骨形成^[53]。血管内皮生长因子s和血管生成素是此过程中主要的生长因子。7种血管内皮生长因子s，血管内皮生长因子-A，-B，-C，-D，-E，-F和血小板生长因子为同型二聚体糖蛋白，均有相同的结构。他们均结合酪氨酸激酶受体(血管内皮生长因子R-1，-2和-3)，具有不同的作用^[54]。血管内皮生长因子-A，血管内皮生长因子-C和血管内皮生长因子-D在骨愈合过程中均有发现，特别是软骨生成阶段。这些因子主要是由成骨细胞合成，而且它们的浓度在软骨钙化之间，吸收开始之前达到高峰^[52]。因此，血管内皮生长因子被认为是血管新生主要的调节因子^[55]，同时也具有促进软骨内骨生长作用。Ai-Aql等^[53]认为骨形态发生蛋白也能刺激合成血管内皮生长因子s，证明骨形态发生蛋白与血管内皮生长因子s之间在骨愈合期间具有密切的关系。Gerstenfeld等^[56]认为血管内皮生长因子在骨形成过程中的血管新生其关键的调节作用。血管内皮生长因子在骨重建中的重要作用已经在不同的骨形成模型中得到验证，对添加血管内皮生长因子或抑制可以刺激或干扰体内正常骨的愈合过程^[57-59]。

血管内皮生长因子可刺激血管生成^[60]。当组织血液循环不足时，血管内皮生长因子参与系统恢供养的因子^[61]。骨组织是一个高度血管化的组织，它依赖于血管和骨细胞之间相互作用的状态来维持^[62-63]。血管化在骨骼发育及骨修复过程中扮演重要的角色^[64-65]。血管内皮生长因子的正常功能是在胚胎发育过程中、新的血液血管损伤后、肌肉运动后及建立侧枝循环时创建新的血管^[66]。一些研究表明，脂肪干细胞参与组织再生是通过他们的血管生成因子和调解生产内源性血管来建立血管化^[66-67]。然而，局部高浓度的血管内皮生长因子诱导形成血管畸形，无功能。Wernike等^[68]研究表明使用磷酸钙陶瓷支架连续低浓度的释放血管内皮生长因子可增加其成血管效果。血管内皮生长因子的释放动力学似乎是在促进生物材料的一个重要因素。

血管内皮生长因子调节的血管新生对骨生长是基础需要。Zhang等^[69]研究证实血管内皮生长因子在成骨细胞分化和破骨细胞聚集中也发挥重要的作用。血管内皮生长因子对成骨细胞这些功能主要是通过以下3种方式获得：第一，血管内皮生长因子促进血管新生和骨生成；第二，血管内皮生长因子能促进成骨细胞分化和提高成骨活性。第三，VEGR能促进周围细胞分泌各种细胞因子，最终提高成骨细胞活性。Deckers等^[70]发现在成骨细胞分化的早期阶段，血管内皮生长因子表达较低。然而，在成骨分化的最后阶段，它的表达水平逐渐升高，并在组织矿化的时候达到高峰。

2.2.3 血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白联合表达的研究进展一些细胞因子和生长因子在时间和空间上协调作用完成骨重建。这些生物体可利用的生长因子在剂量、释放时间和持续时间上内源性的平衡调节骨重建过程中包括细胞迁移、增殖、分化、基质沉积和血管新生的不同方面^[71]。血管和成骨是骨修复两个最为重要的过程^[72]，Spiller等^[73]研究证实成骨与成血管生物因子联合作用比单因子更能促进血管形成或骨生成，双因子或多因子联合作用是目前但骨组织工程中的一个发展方向。

在过去的10年中，包含外源性干细胞，血管内皮生长因子和骨形成蛋白连同骨传导支架在内的研究策略被作为一种理想的骨组织修复的手段，并被作为构建组织工程骨的长远目标。以往多认为血管内皮生长因子在骨修复过程中仅起到促进血管生成的作用，但最近研究表明在成骨细胞促进干细胞的成骨分化过程中，血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白之间信号通路存在互通体外实验表明中成骨因子和成血管因子在骨生成和血管生成过程中细胞间交流具有重要作用。共培养实验证明，成骨样细胞通过产生血管内皮生长因子刺激内皮细胞增殖，同时内皮细胞通过产生骨形态发生蛋白2刺激成骨祖细胞分化。此外，骨形态发生蛋白诱导的成骨前体样细胞分化提高成骨细胞分泌血管内皮生长因子。这些体外的研究表明骨形态发生蛋白/血管内皮生长因子共同调节骨生成和血管新生。这种骨形态发生蛋白/血管内皮生长因子之间的相互作用在骨重建过程中也得到了验证，其间当生长因子同时释放或表达可提高骨形成^[74-76]。

在正常骨愈合过程中，血管内皮生长因子表达在早期达到高峰，而骨形态发生蛋白在后一个时间点达到高峰^[77-82]。由于骨形成过程中血管床需要在早期建立，使生长因子时间上的释放特性与自然表达相似可能更有益于骨重建。为了解决这个问题，新发展的材料应能够序贯释放血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白。除了要达到生长因子序贯释放的目的，这样的生物材料应具有生物上和生物力学上的相容性，使其提高血管新生、骨生成和力学稳定性。

未来的研究方向是成骨与成血管生物因子在支架中复合，并序贯释放^[83]。Kanczler等^[84]已经开研发一种聚合物系统，用于从一个组织特异性受控释放两种或更多种生长因子的聚合物支架。结果表明，将这种多因子联合转染干细胞可同时出现血管化和成骨，促进血管化的组织工程骨的构建。Patel等^[74]将血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2双因子共同释放，结果显示5/8的大鼠骨缺陷在12周内完全愈合，而单独使用骨形态发生蛋白2只有3/8的大鼠有骨愈合，而单独使用血管内皮生长因子的并没有出现骨缺损的愈合。这表明，共同释放双因子对于骨愈合的作用明显强于单因子。成骨与成血管生物因子应该以适当的释放量持续释放，从而增强骨愈合的能力，从而促进骨组织再生。

然而，生长因子的作用是依赖于释放的剂量和使用的载体^[85]，Young等^[86]使用双因子血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白2的比率>1，结果在促进骨缺损愈合的实验中，双因子协同作用的成骨效果，不如单独使用未能显示出骨形态发生蛋白2 的成骨效果。这就表明使用大剂量的血管内皮生长因子导致干细胞分化的走向内皮细胞，从而减少了成骨细胞的成骨分化能力。此外，高浓度成骨生长因子的使用有发生不良反应的风险，包括异位成骨和慢性炎症^[87]。因此，临床治疗过程中，如何包被生理剂量的生长因子到移植物材料中，使其逐渐被利用成为研究的重点。

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