雷公藤甲素治疗骨关节炎的网络药理学分析与实验验证

doi:10.12307/2026.549

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (4): 805-815.doi: 10.12307/2026.549

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雷公藤甲素治疗骨关节炎的网络药理学分析与实验验证

陈伊娴1，陈晨2，卢立恒2，汤锦鹏1，于晓巍2

1江西中医药大学，江西省南昌市 330000；2上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海市 200233

收稿日期:2024-10-29 接受日期:2024-12-31 出版日期:2026-02-08 发布日期:2025-05-15
通讯作者: 于晓巍，博士，主任医师，博士生导师，上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海市 200233
作者简介:陈伊娴，女，江西省赣州市人，江西中医药大学在读硕士，主要从事骨关节疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82372387)，项目负责人：于晓巍；上海交通大学医工交叉基金(YG2024ZD19)，项目负责人：于晓巍

Triptolide in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and animal model validation

Chen Yixian1, Chen Chen2, Lu Liheng2, Tang Jinpeng1, Yu Xiaowei2

1Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330000, Jiangxi Province, China; 2Department of Orthopedics, the Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China

Received:2024-10-29 Accepted:2024-12-31 Online:2026-02-08 Published:2025-05-15
Contact: Yu Xiaowei, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200233, China
About author:Chen Yixian, Master candidate, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330000, Jiangxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82372387 (to YXW); Shanghai Jiao Tong University Medical-Industrial Cross Fund, No. YG2024ZD19 (to YXW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
雷公藤甲素：又称雷公藤内酯，是从雷公藤根中提取的一种二萜类三环氧化物，分子式是C20H24O6，相对分子质量为360.40，难溶于水，易溶于甲醇、二甲基亚砜、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿等，具有免疫抑制、抗炎、抗增殖和抗肿瘤的药理作用。
网络药理学：能够基于药物的主要成分，将疾病与药物成分的作用靶点进行网络分析，从多途径强调对相关信号通路的调节，提高药物的治疗效果，降低不良反应，从而提高新药临床试验的成功率，节省药物的研发费用。

背景：骨关节炎是一种具有致残性的慢性关节退化性疾病，以持续性炎症和软骨破坏为主要病理特征。雷公藤甲素可用于治疗各种慢性关节疾病，但雷公藤甲素治疗骨关节炎的作用机制尚未明确。
目的：通过网络药理学筛选雷公藤甲素治疗骨关节炎的有效靶点，并利用骨关节炎模型探讨雷公藤甲素对骨关节炎的治疗效果。
方法：利用网络药理学预测雷公藤甲素治疗骨关节炎的潜在靶点和信号通路，之后应用分子对接技术对核心靶点进行验证。采用前交叉韧带横断术建立大鼠骨关节炎模型，造模8周后予雷公藤甲素及玻璃酸钠关节腔注射给药6周。干预6周后进行苏木精-伊红染色及番红O-固绿染色观察大鼠膝关节病理变化；ELISA法检测大鼠血清中炎症因子的水平；免疫组织化学染色法检测大鼠关节软骨中蛋白聚糖、含Ⅰ型血小板反应蛋白的解聚素金属蛋白酶5、Ⅱ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶13的蛋白表达。
结果与结论：①网络药理学结果表明，雷公藤甲素的作用靶点可能与抑制白细胞介素6、肿瘤坏死因子ɑ、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶9等因子的释放，及NF-κB/JAK2-STAT3信号通路的过度活化相关；②雷公藤甲素可减轻骨关节炎大鼠的关节肿胀程度；改善关节软骨组织病理状态，维持软骨结构；降低骨关节炎大鼠血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶3的水平；减少关节软骨中基质金属蛋白酶13和含Ⅰ型血小板反应蛋白的解聚素金属蛋白酶5的蛋白表达，增加软骨中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达，达到保护软骨的作用。

https://orcid.org/0009-0001-7389-4835(陈伊娴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨关节炎, 雷公藤甲素, 网络药理学, 炎症, 关节软骨, 基质金属蛋白酶13, 核因子κB信号通路, 工程化组织构建

Abstract: BACKGROUND: Osteoarthritis is a chronic degenerative disease of the joints that can lead to disability. Its main pathological features are persistent inflammation and cartilage destruction. Triptolide has been used to treat a variety of chronic joint diseases. However, the mechanism of triptolide in the treatment of osteoarthritis has not been clarified
OBJECTIVE: To identify the effective targets of triptolide in the treatment of osteoarthritis by network pharmacology, and to investigate the therapeutic effect of triptolide on osteoarthritis in the osteoarthritis model.
METHODS: Network pharmacology was used to anticipate the potential targets and signaling pathways of triptolide in the treatment of osteoarthritis, and molecular docking technology was used to validate the core targets. A rat osteoarthritis model was established by anterior cruciate ligament transection. Eight weeks after modeling, the rats were administered with triptolide and sodium hyaluronate by intra-articular injection for 6 weeks. After 6 weeks of intervention, the pathological changes in rat knee joints were observed by hematoxylin-eosin staining and safranin O-fast green staining. The levels of inflammatory factors in rat serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The expression of aggrecan, type I platelet-responsive protein-containing desmoglein metalloproteinase 5, type II collagen and matrix metalloproteinase 13 proteins in rat articular cartilage was tested by immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of network pharmacology indicated that the target of triptolide may be related to the inhibition of the release of factors such as interleukin 6, tumor necrosis factor ɑ, interleukin 1β, matrix metalloproteinase 9, and the over-activation of the nuclear factor-κB/JAK2-STAT3 signaling pathway. (2) Triptplide could reduce the degree of joint swelling in osteoarthritic rats; pathologically improve the articular cartilage and maintain the cartilage structure; decrease the serum levels of interleukin 6, tumor necrosis factor ɑ, interleukin 1β, matrix metalloproteinase 9, and matrix metalloproteinase 3 in osteoarthritic rats; reduce the protein expression of matrix metalloproteinase 13 and type I platelet-responsive protein-containing desmoglein metalloproteinase 5 in the articular cartilage; and increase the expression of type II collagen and aggrecan in the cartilage, thereby achieving cartilage protection.

Key words: osteoarthritis, triptolide, network pharmacology, inflammation, articular cartilage, matrix metalloproteinase 13, nuclear factor-κB signaling pathway, engineered tissue construction

中图分类号:

陈伊娴, 陈晨, 卢立恒, 汤锦鹏, 于晓巍. 雷公藤甲素治疗骨关节炎的网络药理学分析与实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(4): 805-815.

Chen Yixian, Chen Chen, Lu Liheng, Tang Jinpeng, Yu Xiaowei. Triptolide in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and animal model validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(4): 805-815.

图/表（结果） 11

2.1 雷公藤甲素治疗骨关节炎的潜在作用靶点通过CTD、PharmMapper、Pubchem和TCSMP数据库筛选获得雷公藤甲素相关靶基因218个，此外合并DisGeNET、GeneCards、OMIM三个数据库去重得到骨关节炎相关基因1 399个。将药物与疾病的靶点基因导入Venny平台，获得雷公藤甲素与骨关节炎共同基因靶点70个，见图1及表4。

2.2 蛋白相互作用网络图的构建及核心靶点的筛选将交集靶点导入STRING数据库获得靶点基因对应的蛋白互作网络，见图2A。通过Cytoscape软件将蛋白互作网络进行可视化，得到67个节点和1 084条边，见图2B。采用CytoNCA插件对度中心性、介数中心性、接近中心性、特征向量中心性、基于局部平均连通性的方法和网络中心性进行参数运算以筛选核心靶基因，运算范围为分别大于6个参数的中位数，循环运算2次。最终获得14个核心基因，分别为 NFKB1、MMP9、IL6、TNF、IL1β、TP53、STAT3、BCL2、MYC、PTEN、JUN、PTGS2、CASP3、IFNG，见图3。说明雷公藤甲素治疗骨关节炎与细胞炎症、细胞凋亡等关系密切。
2.3 GO及KEGG富集分析通过DAVID数据库获得GO功能400条(P < 0.05)，其中生物过程325条、细胞组分29条、分子功能46条。选取排名前10的条目借助微生信平台进行可视化，生成GO功能条形图，见图4。雷公藤甲素可能通过调控细胞凋亡、炎症反应、细胞因子活性、基因表达、聚合酶Ⅱ启动子的转录等方式发挥治疗骨关节炎作用。KEGG富集分析共获得123条通路(P < 0.05)，选取其中具有代表性的25条通路进行可视化分析，见图5。雷公藤甲素治疗骨关节炎主要涉及核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通路、Janus激酶信号转导和转录激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、白细胞介素17信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis
factor，TNF)信号通路、Toll样受体通路、核苷酸结合寡聚化域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)样受体通路、缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)通路、P53通路、T细胞受体通路、C型凝集素受体信号通路等。
2.4 分子对接结果运用AutoDockTools软件对雷公藤甲素与核心靶点NFKB1、MMP9、IL6、TNF、IL1β进行分子对接，结果显示分子结合能均≤-29.29 kJ/mol，说明雷公藤甲素与骨关节炎的核心靶点具有较好的结合作用，见表5。最后通过PyMOL软件，将对接结果进行可视化分析，见图6。

2.5 动物实验结果
2.5.1 对大鼠体质量及关节肿胀度的影响造模第2，4周，各组大鼠的体质量变化差异不显著(P > 0.05)；造模第6，8周，与空白组比较，模型组、玻璃酸钠组及雷公藤甲素组大鼠体质量均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)；造模8周后开始进行药物干预，结果显示，第10，12周玻璃酸钠组及雷公藤甲素组较模型组大鼠体质量有一定程度的上升，但差异不显著(P > 0.05)，仍显著低于空白组体质量(P < 0.01)；第14周，与模型组比较，玻璃酸钠组、雷公藤甲素组大鼠体质量明显增加(P < 0.01，P < 0.05)，见图7A及表6。表明雷公藤甲素和玻璃酸钠能够有效抑制骨关节炎大鼠的体质量下降。
造模第2周，各组大鼠同侧膝关节肿胀程度不明显(P > 0.05)；造模第4，6，8周，与空白组比较，模型组、玻璃酸钠组及雷公藤甲素组大鼠膝关节肿胀度显著上升(P < 0.05，P < 0.01)；给药第10周，玻璃酸钠组、雷公藤甲素组大鼠膝关节肿胀增长程度下降，但较模型组关节肿胀度差异不明显(P > 0.05)；给药第12，14周，与模型组比较，玻璃酸钠组、雷公藤甲素组大鼠膝关节肿胀度

明显减少(P < 0.05，P < 0.01)。见图7B及表7。说明雷公藤甲素和玻璃酸钠能够一定程度缓解骨关节炎大鼠膝关节肿胀。
2.5.2 对大鼠膝关节病理变化的影响与空白组比较，模型组大鼠关节软骨表面粗糙，可见明显裂隙和组织缺损，软骨细胞减少且排列无序、层次混乱(蓝色箭头)，潮线难以辨别，基质着色不均匀，软骨中的蛋白多糖明显减少，软骨纤维化明显(红色箭头)；与模型组比较，玻璃酸钠组和雷公藤甲素组大鼠关节软骨表面相对光滑平整，

未见组织裂隙及缺损，软骨细胞排列整齐、层次分明，潮线清晰可见，基质着色较均匀，蛋白多糖明显增多，软骨纤维化不明显，见图8。
2.5.3 对大鼠膝关节软骨中蛋白聚糖、ADAMTs5、Ⅱ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶13蛋白表达的影响与空白组比较，模型组大鼠关节软骨中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的蛋白表达均显著降低(P < 0.001)，ADAMTs5与基质金属蛋白酶13的蛋白表达均显著增加(P < 0.001)；与模型组比较，玻璃酸钠组、雷公藤甲素组大鼠膝关节中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的蛋白表达均明显增加(P < 0.001，P < 0.01，P < 0.05)，ADAMTs5与基质金属蛋白酶13的蛋白表达水平均显著降低(P < 0.001)；雷公藤甲素组与玻璃酸钠组大鼠膝关节中此4种蛋白表达水平相比差异不明显(P > 0.05)。见图9。
2.5.4 对大鼠血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶3水平的影响与空白组比较，模型组大鼠血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶3水平显著升高(均P < 0.001)；与模型组比较，玻璃酸钠组和雷公藤甲素组大鼠血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶3水平均显著降低(P < 0.001，

P < 0.05)；与玻璃酸钠组相比，雷公藤甲素组大鼠血清中肿瘤坏死因子α水平显著下降(P < 0.001)，基质金属蛋白酶3和白细胞介素6水平仍较高(P < 0.001，P < 0.05)，白细胞介素1β和基质金属蛋白酶9水平差异不明显(P > 0.05)。见图10及表8。

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引言

骨关节炎是一种常累及手、髋、膝等关节的慢性退行性疾病，主要表现为晨僵、慢性疼痛、关节肿胀及活动障碍，是60岁以上成年人残疾的主要原因[1]。随着人口老龄化及肥胖人口的增多，骨关节炎的患病率呈逐年上升的趋势且发病年龄有所下调，加重社会及家庭的经济负担[2-4]。目前骨关节炎治疗主要包括运动、体质量管理、药物、手术、替代疗法等[5]，然而骨关节炎发病机制复杂，药物治疗效果有限，手术治疗存在感染、假体松动等风险。因此，了解骨关节炎的发病机制并寻找更好的治疗方法意义重大。
雷公藤属于卫矛科雷公藤的根，广泛分布于中国长江中下游地区，其味苦、辛，性寒，有大毒。《本草纲目拾遗》记载雷公藤主治：“臌胀、水肿、痞积、黄白疸、疟疾久不愈、鱼口便毒、疬串跌打”。临床上用于治疗痛风性关节炎、类风湿性关节炎、僵直性脊柱炎、肾病综合征、克罗恩病、系统性红斑狼疮等慢性疾病[6]。雷公藤甲素是从雷公藤中提取的二萜类三环氧化物，分子式是C20H24O6，相对分子质量为360.40，已被证实具有抗炎、抗增殖、抗氧化、免疫抑制、抗肿瘤等药理作用[7-11]。有研究报道雷公藤甲素能够显著降低小鼠半月板失稳模型中白细胞介素1β、干扰素γ、白细胞介素17A、肿瘤坏死因子α等炎症因子的mRNA表达，缓解骨关节炎的进
展[12-14]。为进一步探究雷公藤甲素治疗骨关节炎的作用机制，此次研究通过网络药理学预测其相关作用靶点及信号通路并进行动物实验验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计网络药理学预测雷公藤甲素治疗骨关节炎的靶点，并进行分子对接及动物实验验证。
1.2 时间及地点实验于2023年11月至2024年5月在上海交通大学医学院附属第六人民医院动物房及中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 数据库及分析工具见表1。

1.3.2 实验动物 8周龄雄性SD大鼠24只，SPF级，体质量(180±20) g，由上海必凯科翼生物科技有限公司供应[许可证号：SCXK(沪)2023-0009]，在上海市第六人民医院动物实验室饲养[许可证号：SYXK(沪)2021-0028]，适应性喂养1周后进行实验。此次实验经上海市第六人民医院动物伦理委员会批准，审批号：DWSY2023-0132。
1.3.3 实验试剂及仪器
主要试剂：雷公藤甲素(triptolide，源叶，纯度≥
98%，货号：B20709)；玻璃酸钠(hyaluronic acid sodium，麦克林，纯度> 99%，货号：H6350)；戊巴比妥钠(Sigma，货号：P3761)；PBS(塞维尔)；通用型组织固定液(塞维尔，货号：G1 101)；二甲基亚砜(索莱宝，货号：B8371)；苏木精-伊红染色试剂(索莱宝，货号：G1120)；改良番红O-固绿软骨染色试剂盒(索莱宝，货号：G1371)；磺丁基醚β-环糊精SBE-β-CD(MCE，批号：HY-17031)；大鼠白细胞介素1β检测试剂盒(博研，批号：BY-ER330206)；肿瘤坏死因子α检测试剂盒(博研，批号: BY-ER331063)；大鼠白细胞介素6检测试剂盒，博研，批号：BY-ER330219)；大鼠基质金属蛋白酶9检测试剂盒(博研，批号：
BY-ER330473)；大鼠基质金属蛋白酶3检测试剂盒(博研，批号：BY-ER330194)；ELISA试剂盒(博研)；含Ⅰ型血小板反应蛋白的解聚素金属蛋白酶5(a disintegrin and
metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTs5)一抗(博奥森，货号：bs-357312)；Ⅱ型胶原蛋白一抗(英国Abcam公司，货号：ab34712)；基质金属蛋白酶13一抗(亲科生物，货号：AF5355)；蛋白聚糖一抗(武汉三鹰，货号：13880-1-AP)。
主要仪器：脱水机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JJ-12J)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，型号：JB-P5)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)；正置荧光显微镜(日本康尼，型号：NIKON ECLIPSE TI-SR)。
1.4 实验方法
1.4.1 网络药理学实验
雷公藤甲素相关靶点筛选：在TCMS、PubChem、PharmMapper及CTD数据库中以“triptolide”为关键词，检索雷公藤甲素的相关作用靶点，其中CTD数据以“interaction count”> 5及PharmMapper数据以“Norm Fit”> 0.5为条件进行靶点筛选。数据整合去重后利用UniProt数据库规范雷公藤甲素靶点的基因名称和ID，限定物种为“Homo sapiens”。
骨关节炎相关靶点筛选：以“osteoarthritis
disease”“ostarthritis”为关键词，在OMIM、DisGeNET、
GeneCards数据库中获取骨关节炎的相关靶点基因，其中DisGeNET数据以“score”> 0.01及GeneCards数据以“Relevance score”> 2倍中位数为条件筛选靶点，合并去重后得到骨关节炎最终靶点基因。
蛋白相互作用网络的构建及核心靶点筛选：利用Venny 2.1.0平台筛选雷公藤甲素治疗骨关节炎的潜在靶点，并绘制韦恩图。将共同靶点上传至STRING数据库进行分析，物种限定为“Homo sapiens”，置信度为“medium confidence(0.400)”，隐藏无联系的节点，构建靶蛋白相互作用图。将其TSV文件导入Cytoscape3.9.0软件，使用CytoNCA插件中的6种算法：度中心性、介数中心性、接近中心性、特征向量中心性、基于局部平均连通性的方法和网络中心性，根据各种算法的中位值筛选雷公藤甲素治疗骨关节炎的核心靶点，循环运行2次。
基因本体论(Gene Ontology，GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析：将交集靶点导入DAVID数据库，
Identifier选择为“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，物种选择为“Homo sapiens”，列表类型为“Gene List”，进行GO生物过程分析与KEGG通路生物信息学分析，保留
P < 0.05及错误发生率< 0.05的结果。最后借助微生信平台对富集结果进行可视化处理。
分子对接验证：通过TCMSP数据库下载雷公藤甲素的MOL2文件作为配体；通过PDB数据库下载核心靶蛋白的3D结构，并利用PyMOL2.6.0软件去除水分子、配体后作为受体。运用AutoDockTools1.5.6、
AutoDockVina1.1.2及PyMOL2.6.0软件对雷公藤甲素的配体和靶蛋白受体进行分子结构处理、分子对接及3D可视化分析。依据分子对接评分判断其结合活性，若配体与受体结合能越低，则结合越稳定。通常认为结合能≤
-29.29 kJ/mol时，意味着两者之间结合活性高[15]。
1.4.2 动物实验
造模：参考文献方法[16]，采用前交叉韧带横断法建立大鼠骨关节炎模型。4%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位膝关节屈曲90°固定，于两侧膝关节内侧作3 cm左右纵行切口；沿髌腱内缘切开，用纱布将髌骨外翻暴露膝关节；剪断与髁间窝相连的髌下皱襞，后可见其下的前交叉韧带；显微剪离断前交叉韧带，抽屉实验验证手术成功与否；生理盐水冲洗并逐层缝合伤口。术后连续肌肉注射青霉素3 d，预防感染。
药物制备、分组及给药：雷公藤甲素粉末溶于2%的二甲基亚砜，利用超声充分溶解，使用前用20%SBE-β-CD溶液稀释至所需浓度；2 g SBE-β-CD粉末溶于10 mL的生理盐水中，完全溶解至液体澄清，4 ℃保存。
将24只SD大鼠按随机数字表法随机分为4组，即空白组、模型组、玻璃酸钠组、雷公藤甲素组，每组6只。除空白组外大鼠均采用前交叉韧带横断术进行骨关节炎模型制备，术后8周玻璃酸钠组予玻璃酸钠溶液关节腔注射，雷公藤甲素组予1 mg/kg的雷公藤甲素溶液关节腔注射[17]，每只膝关节注射体积为30 μL[18]；空白组及模型组同期给予同体积生理盐水注射。每周1次，持续干预6周后处死取材。
大鼠体质量及关节肿胀度检测：造模前1周、造模后及给药后每2周，对大鼠体质量及右侧膝关节周径进

行测量，比较大鼠的体质量变化并评估关节肿胀程度。关节肿胀度=造模后同侧膝关节周径-造模前同侧膝关节周径[19]。
病理学检查：取膝关节于组织固定液中固定24 h，10%EDTA脱钙8周，随后进行脱水、浸蜡、包埋、切片，进行苏木精-伊红染色及番红O-固绿染色，显微镜下观察大鼠膝关节病理变化。采用国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分和Mankin’s评分来评估和量化关节软骨的退化，评分标准见表2，3[20-21]。
ELISA检测血清相关因子水平：治疗结束后，4%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，使用一次性采血管心脏采血，室温静置2 h后离心15 min收集上层血清，-20 ℃保存用于ELISA检测。根据试剂盒说明书检测大鼠血清中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9的水平。
免疫组化染色：将石蜡切片脱蜡至水35 min。Ⅱ型胶原蛋白及ADAMTs5使用胰酶溶液抗原修复15 min，基质金属蛋白酶13及蛋白聚糖使用胃酶溶液抗原修复30 min。而后利用H2O2室温避光孵育30 min阻断内源性过氧化物酶，PBS(pH=7.4)各清洗3次后，3%BSA室温封闭30 min。结束后一抗4 ℃过夜(Ⅱ型胶原蛋白及ADAMTs5稀释比为1∶200；基质金属蛋白酶13及

蛋白聚糖稀释比为1∶100)。PBS洗涤3次后，滴加与一抗相应属性的二抗室温孵育50 min(稀释比例均为1∶5 000)，PBS清洗，DAB显色，自来水冲洗，Harris苏木精复染，流水冲洗，脱水，中性树脂封固，光镜下观察。

1.5 主要观察指标 ①网络药理学实验：雷公藤甲素治疗骨关节炎蛋白相互作用图；GO分析及KEGG富集通路分析；核心靶点分子对接；②动物实验：大鼠膝关节肿胀度；血清炎症因子及基质金属蛋白酶水平；苏木精-伊红染色及番红O-固绿染色观察软骨损伤；膝关节软骨OARSI及Mankin’s评分；膝关节软骨Ⅱ型胶原蛋白、ADAMTs5、基质金属蛋白酶13及蛋白聚糖的蛋白表达。
1.6 统计学分析以Image J软件采集免疫组化染色切片的阳性细胞率，GraphPad Prism 8.0软件进行可视化处理；Excel软件汇总数据；通过SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料若满足正态分布和方差齐性检验，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，两两比较采用LSD检验；资料若不满足正态分布和方差齐性，采用非参数检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已得到上海交通大学附属第六人民医院统计学专家审核。

讨论

近年来，人们越来越关注药用植物及其衍生产物在慢性关节疾病上的应用。雷公藤多苷是从中国传统中草药雷公藤去皮根部提取的总苷，主要含有雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤红素、雷公藤晋碱及雷公藤次碱等化合物，其中生物活性最好的为雷公藤甲素[22]。雷公藤甲素已被证明能够对抗多种免疫系统紊乱、癌症、病毒、纤维化、哮喘、抑郁症和代谢失衡等[23-24]。有研究表明雷公藤甲素能够通过抑制NF-κB活性，减轻炎症、调控细胞凋亡治疗骨骼肌萎缩[25]。王杰等[26]发现雷公藤甲素能够通过调控环状非编码RNA 0003353，干预JAK2/STAT3信号通路，抑制类风湿性关节炎患者成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的炎症反应及细胞迁移。虽然骨关节炎的发病机制与类风湿关节炎不同，但都有滑膜炎症和软骨破坏等病理特征。此次研究通过网络药理学和SD大鼠骨关节炎模型来探讨雷公藤甲素治疗骨关节炎的潜在作用机制。
通过网络药理学筛选得到雷公藤甲素干预骨关节炎的潜在治疗靶点70个，蛋白相互作用网络分析结果显示NFκB1、MMP9、IL6、TNF、IL1β等靶点可能是雷公藤甲素治疗骨关节炎的核心靶点，涉及NF-κB/JAK-STAT/MAPK等信号通路。有研究表明，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等炎症因子会刺激软骨细胞产生基质降解酶，如基质金属蛋白酶和聚蛋白多糖酶(ADAMTS)，破坏软骨完整性，促进骨关节炎的发展[27]。基质金属蛋白酶由机体组织蛋白质生成，是一种胶原蛋白水解酶，按照发现顺序命名，有大约20多种[28]。基质金属蛋白酶9作为一种明胶酶，与蛋白聚酶、Ⅱ型胶原蛋白等细胞外基质主要成分的降解密切相关[29]。研究证实在白细胞介素1β诱导的软骨细胞中基质金属蛋白酶9的基因和蛋白表达显著升高，且随着白细胞介素1β浓度增加而增加，说明基质金属蛋白酶9是骨关节炎发病的潜在生物标志物[30]。JAK是一类非跨膜络氨酸激酶，由JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2组成。STAT为JAK下游靶点，有7个成员：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。JAK-STAT通路可被白细胞介素6、白细胞介素10、白细胞介素4等多种细胞因子刺激，参与调节细胞的增殖、分化和凋亡等生物学过程[31]。MAPKs包括ERK、P38和JNK MAPK亚家族，是细胞病理和生理的重要调节因子，在成软骨分化中也至关重要，其下游分子NF-κB是一种核转录因子，是多种免疫转录程序的重要组成部分，在机体炎症反应、免疫应答、细胞凋亡、衰老等方面发挥重要作用[32]。有研究报道，辛夷脂素能够通过抑制滑膜组织中p38/ERK MAPK和p65/NF-κB信号通路，将M1型细胞转化为M2型细胞来重编巨噬细胞极化，改善关节软骨退变和骨关节炎滑膜炎症[33]。ZHANG等[34]发现亚麻籽提取物能够通过激活核因子红细胞2相关因子2/血红素氧合酶1通路和抑制NF-κB信号通路发挥抗炎与抗细胞外基质降解的作用，减缓骨关节炎进展。以上结果表明，雷公藤甲素治疗骨关节炎是一个多靶点、多途径的复杂过程。
此次研究采用前交叉韧带横断术建立骨关节炎大鼠模型，经雷公藤甲素干预后，骨关节炎大鼠的体质量和关节肿胀度得到明显改善。前交叉韧带能够限制胫骨前移和膝关节旋转，在维持膝关节稳定方面意义重大。前交叉韧带损伤后膝关节旋转失稳和关节力线的改变，加大了关节软骨的摩擦，从而导致骨关节炎的发生[35]。关节软骨由软骨细胞、胶原纤维和蛋白多糖基质组成，没有血管、淋巴管和神经，所以关节在损伤或衰老后难以自我修复。软骨损伤后，软骨碎片和细胞外基质碎片的释放，诱导滑膜细胞产生促炎因子、活化炎症小体，进一步释放滑液中的细胞因子和趋化因子，加速细胞外基质的降解，推动骨关节炎的发展[36]。因此阻止骨关节炎进一步发展，可从抑制细胞因子的释放、减少细胞外基质的降解等方面入手。此次研究结果显示，雷公藤甲素和玻璃酸钠能够显著降低骨关节炎大鼠血清中炎症因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9的含量，说明雷公藤甲素具有较好的阻止软骨丢失和减轻关节局部炎症反应的作用。透明质酸是一种酸性黏多糖，具有润滑关节、调节血管壁通透性、运转水电解质、促进创伤愈合等功能，临床上已广泛应用于关节疾病[37]。基质金属蛋白酶3是蛋白水解酶家族的一员，是降解关节软骨最为关键的蛋白酶，有研究报道，肿瘤坏死因子α诱导的软骨细胞中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9表达显著升高，能够激活NF-κB/MAPK信号通路导致活性氧大量产生，进一步促进骨关节炎的炎症及发展[38]。在此次实验中，雷公藤甲素干预后，骨关节炎大鼠血清中基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9水平显著降低，与玻璃酸钠组趋势一致。
关节软骨是关节相连骨表面的一层透明软骨，能够承受负荷、润滑关节、缓冲应力等，对关节正常活动至关重要。骨关节炎发展中最明显的症状之一是关节软骨的损伤及退变，因此病理切片染色是判断关节损伤程度的重要手段[39]。OARSI评分和Mankin’s评分是广泛应用于临床和研究中评估骨关节炎关节损伤程度的通用标准。Mankin’s评分从软骨结构、细胞数量、基质染色及潮线4个方面进行评估，分数越高表明软骨损伤越严重。苏木精-伊红染色结果可见，雷公藤甲素干预后骨关节炎大鼠关节软骨表面相对光滑平整，细胞数量正常、排列整齐，潮线完整；番红O-固绿染色结果可见，模型组大鼠关节软骨大量纤维化(绿色)，雷公藤甲素干预后骨关节炎大鼠关节软骨纤维化减少，厚度明显增加(红色)；而且雷公藤甲素组大鼠关节软骨的OARSI和Mankin’s评分较模型组均显著降低，说明雷公藤甲素能够有效改善关节软骨中蛋白多糖的流失，保护关节软骨，减缓关节退变。细胞外基质主要由Ⅱ型胶原蛋白及蛋白聚糖组成，具有生物力学性能、维持组织内环境稳定、调控细胞功能、帮助组织修复等功能[40]。模型组大鼠关节软骨中Ⅱ型胶原蛋白与蛋白聚糖的蛋白表达显著降低，与WANG等[41]实验中的结果一致，而经过雷公藤甲素干预后关节软骨中Ⅱ型胶原蛋白与蛋白聚糖的蛋白表达明显增加，阳性面积占比提升。基质金属蛋白酶13是一种胶原酶，能够通过其特有的裂解Ⅱ型胶原蛋白的能力参与软骨降解[42]。ADAMTS金属蛋白酶是一种分泌型锌内肽酶，与发育不良、关节炎、心血管疾病、癌症等多种疾病相关。ADAMTs5是 ADAMTS蛋白家族中的一种蛋白聚糖酶，在骨关节炎及健康软骨中均有表达，在白细胞介素1β介导的软骨细胞炎症模型中发现ADAMTs5 mRNA表达显著升高[43-44]。此次实验中，雷公藤甲素干预后骨关节炎大鼠关节软骨中基质金属蛋白酶13和ADAMTs5蛋白表达明显减少，阳性细胞占比降低。结果表明，雷公藤甲素能够有效改善骨关节炎大鼠关节破坏和软骨丢失，延缓骨关节炎进展。
综上所述，网络药理学结果表明，雷公藤甲素治疗骨关节炎的作用可能与抑制白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13等细胞因子的释放和NF-κB/JAK2-STAT3信号通路的过表达有关。实验结果表明，雷公藤甲素能够从减轻关节肿胀、改善病理状态、抑制关节炎症、维持软骨蛋白多糖等多方面发挥减缓骨关节炎的效果。不足之处在于此次实验检测方法较单一，以病理结果和免疫组化检测为主，若能结合免疫荧光和定量PCR等方法进一步验证，就能减少误差，增加实验结果可信度。骨关节炎发病机制复杂，雷公藤甲素对骨关节炎的具体信号通路和其他作用靶点有待进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

雷公藤甲素治疗骨关节炎的网络药理学分析与实验验证

Triptolide in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and animal model validation

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