血管内皮生长因子受体2基因敲低大鼠模型的构建及功能验证

doi:10.12307/2026.454

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (35): 9174-9181.doi: 10.12307/2026.454

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血管内皮生长因子受体2基因敲低大鼠模型的构建及功能验证

钱嘉铭1，李玉梅1，王小乐1，方婷1，刘福水1，2

1江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006；2江西中医药大学，江西省南昌市 330004

收稿日期:2025-09-19 修回日期:2026-02-12 出版日期:2026-12-18 发布日期:2026-04-28
通讯作者: 刘福水，博士，教授，江西中医药大学附属医院，江西省南昌市 330006；江西中医药大学，江西省南昌市 330004
作者简介:钱嘉铭，男，1995年生，江西省樟树市人，汉族，2025年江西中医药大学毕业，博士，主要从事脊柱外科的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82360940)，项目负责人：刘福水；江西省自然科学基金重点项目(20224ACB206041)，项目负责人：刘福水；江西省研究生创新专项资金项目(YC2023-B223)，项目负责人：钱嘉铭；江西省中医药管理局科技计划项目(2025020818)，项目负责人：钱嘉铭

Construction and functional verification of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene knockdown rats

Qian Jiaming1, Li Yumei1, Wang Xiaole1, Fang Ting1, Liu Fushui1, 2

1Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 2Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China

Received:2025-09-19 Revised:2026-02-12 Online:2026-12-18 Published:2026-04-28
Contact: Liu Fushui, PhD, Professor, Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Qian Jiaming, PhD, Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82360940 (to LFS); Key Project of Natural Science Foundation of Jiangxi Province, No. 20224ACB206041 (to LFS); Jiangxi Graduate Student Innovation Fund Project, No. YC2023-B223 (to QJM); Scientific Plan Project of Jiangxi Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 2025020818 (to QJM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)：又名KDR，是细胞膜上的一个信号传导受体，参与调控细胞自噬、凋亡等，与血管生成和肌肉修复密切相关。
基因敲低：是指通过特定技术手段降低目标基因的表达水平，从而抑制其功能。通过合成短发卡RNA或小干扰RNA分子，与目标基因的mRNA结合，阻止其被翻译成蛋白质，从而降低目标基因的表达水平。

背景：血管内皮生长因子受体2主要在血管内皮细胞中表达，在血管生成、组织修复以及疾病发生发展过程中发挥重要作用。腺相关病毒因其独特优势，在机制研究、疾病建模和基因治疗领域得到广泛应用。
目的：构建针对大鼠肌肉组织的血管内皮生长因子受体2基因敲低腺相关病毒载体，检测血管内皮生长因子受体2基因敲低腺相关病毒在大鼠颈部头夹肌的敲低效率，及其对肌肉和血管的影响。
方法：构建载体，并将载体包装进入腺相关病毒，经过SD大鼠筛靶实验，免疫荧光检测病毒感染效率及血管内皮生长因子受体2蛋白表达，荧光定量PCR检测血管内皮生长因子受体2 mRNA表达，最终敲定最佳shRNA序列为Y29478及对照Y9957。取12只SD大鼠随机分为腺相关病毒组和对照腺相关病毒组进行功能验证。将腺相关病毒注射入大鼠头夹肌，20周后利用荧光定量PCR和Western blot检测颈肌血管内皮生长因子受体2 mRNA和蛋白表达，苏木精-伊红染色检测颈肌肌纤维面积，CD31免疫组化检测颈肌微血管数目。
结果与结论：①成功筛选能够敲低血管内皮生长因子受体2表达的shRNA序列及剂量，原位注射血管内皮生长因子受体2基因敲低腺相关病毒的大鼠肌肉组织血管内皮生长因子受体2敲低效率达到60%。②与对照腺相关病毒组比较，腺相关病毒组大鼠的血管内皮生长因子受体2的mRNA和蛋白表达均下降，肌纤维面积减小，微血管数目减少。③成功构建血管内皮生长因子受体2基因敲低大鼠模型，肌肉组织血管内皮生长因子受体2敲低引起肌纤维面积缩小和微血管数目减少。
https://orcid.org/0000-0002-1837-7768 (钱嘉铭)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 血管内皮生长因子受体2, 腺相关病毒, 基因敲低, 原位注射, 血管生成, 肌纤维面积, 肌肉血管

Abstract: BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor receptor 2 is mainly expressed in vascular endothelial cells and plays a crucial role in angiogenesis, tissue repair, and the occurrence and development of diseases. Adeno-associated virus, due to its unique advantages, has been widely applied in mechanism research, disease modeling, and gene therapy fields.
OBJECTIVE: To construct an adeno-associated viral vector for vascular endothelial growth factor receptor 2 gene knockdown in rat muscle tissue, determine the knockdown efficiency of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene-knockdown adeno-associated virus in the rat sternocleidomastoid muscle and assess its effects on muscle and blood vessels.
METHODS: The vector was constructed, and packaged into adeno-associated virus. Following target screening experiments in Sprague-Dawley rats, immunofluorescence assays were conducted to assess viral infection efficiency and vascular endothelial growth factor receptor 2 protein expression. Quantitative real-time PCR was used to measure vascular endothelial growth factor receptor 2 mRNA expression. Ultimately, the optimal shRNA sequences were determined to be Y29478 and the control sequence Y9957. Twelve Sprague-Dawley rats were randomly divided into an adeno-associated virus group and a control adeno-associated virus group for functional validation. Adeno-associated virus was injected into the rat splenius capitis muscle. Twenty weeks later, fluorescent quantitative PCR and western blot were used to detect vascular endothelial growth factor receptor 2 mRNA and protein expression in the neck muscles. Hematoxylin-eosin staining was used to measure the cross-sectional area of muscle fibers in the neck muscles, and CD31 immunohistochemistry was used to detect the number of microvessels in the neck muscles.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The shRNA sequence and adeno-associated virus dose that could knock down the expression of vascular endothelial growth factor receptor 2 were successfully screened, and the vascular endothelial growth factor receptor 2 knockdown efficiency of rat muscle tissue after in-situ injection of adeno-associated virus with vascular endothelial growth factor receptor 2 reached 60%. (2) Compared with the control adeno-associated virus group, the mRNA and protein expression of vascular endothelial growth factor receptor 2, the muscle fiber area and the number of microvessels in the adeno-associated virus group decreased. (3) A rat model of vascular endothelial growth factor receptor 2 knockdown was successfully established. Knockdown of vascular endothelial growth factor receptor 2 in muscle tissue resulted in reduced muscle fiber cross-sectional area and decreased microvessel number.

Key words: vascular endothelial growth factor receptor 2, adeno-associated virus, gene knockdown, in-situ injection, angiogenesis, muscle fiber area, muscle vessel

中图分类号:

钱嘉铭, 李玉梅, 王小乐, 方婷, 刘福水, . 血管内皮生长因子受体2基因敲低大鼠模型的构建及功能验证[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(35): 9174-9181.

Qian Jiaming, Li Yumei, Wang Xiaole, Fang Ting, Liu Fushui. Construction and functional verification of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene knockdown rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(35): 9174-9181.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用24只SD大鼠，其中12只进行筛靶实验，另12只进行功能验证，实验过程大鼠均无脱失，全部进入结果分析。
2.2 病毒感染效率及血管内皮生长因子受体2蛋白表达见图3。免疫荧光检测可见绿色荧光较多，表明病毒成功进入肌肉组织，感染效率较为理想，见图3A。高剂量病毒情况下，4种病毒感染后头夹肌中血管内皮生长因子受体2蛋白表达情况见图3B；其中，Y9957红光最亮，相比之下，其余3个红光较暗；免疫荧光强度分析表明Y29478敲低效果最好，见图3C。

2.3 血管内皮生长因子受体2 mRNA表达荧光定量PCR检测各大鼠头夹肌血管内皮生长因子受体2 mRNA表达水平。相比之下，Y29478敲低效果最好，并且中等剂量能够达到敲低60%的效果，见图4。
2.4 血管内皮生长因子受体2基因敲低大鼠的功能验证经过12只SD大鼠进行筛靶实验，敲定最佳shRNA序列为Y29478，合适的病毒总量为2×1011 v.g.，根据病毒滴度情况保留尽可能大的滴度，后续进行功能验证。经载体的构建和腺相关病毒的包装后，得到Y29478及对照Y9957，具体信息见表6。按照病毒滴度尽可能高、病毒总量及体积一致的原则，按照7.08×1012 v.g./mL的滴度，每只大鼠注射2×1011 v.g.的总量，加PBS定容至30 μL，平均分成4等分注射在两侧头夹肌的头端和尾端4个点位上。

2.4.1 血管内皮生长因子受体2 mRNA表达 20周后取材，荧光定量PCR检测两组大鼠头夹肌mRNA表达。结果表明，与对照腺相关病毒组相比，腺相关病毒组血管内皮生长因子受体2 mRNA表达明显下降(P < 0.05)，见图5。

2.4.2 血管内皮生长因子受体2蛋白表达每组随机选取3只大鼠Western blot检测头夹肌血管内皮生长因子受体2蛋白表达。结果表明，与对照腺相关病毒组相比，腺相关病毒组血管内皮生长因子受体2蛋白表达明显下降(P < 0.05)，见图6。

2.4.3 大鼠肌纤维面积检测腺相关病毒组及对照腺相关病毒组的典型图片及统计数据见图7。腺相关病毒组大鼠头夹肌肌纤维缩小，肌纤维之间出现间隙，见图7A；结果表明敲低血管内皮生长因子受体2后大鼠肌纤维面积明显减小(P < 0.05)，可能发生肌萎缩，见图7B。

2.4.4 大鼠微血管数目检测腺相关病毒组及对照腺相关病毒组的典型图片及统计数据见图8。腺相关病毒组头夹肌血管以成熟、老化血管为主，新生血管较少，见图8A；结果表明敲低血管内皮生长因子受体2后大鼠微血管数目明显减小(P < 0.05)，可能存在微循环障碍，见图8B。

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引言

材料方法

1.1 设计构建血管内皮生长因子受体2基因敲低大鼠模型及功能验证。
1.2 时间及地点实验于2023年11月至2024年10月在江西中医药大学完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂质粒载体、腺相关病毒(上海和元生物)；血管内皮生长因子受体2抗体(武汉三鹰)；血管内皮生长因子受体2引物(武汉赛维尔)；RNA提取液(武汉赛维尔)；CD31抗体(武汉赛维尔)；苏木精-伊红染色液(北京雷根)。
1.3.2 主要仪器微量进样器(上海高鸽)；荧光定量PCR仪(美国Bio-rad，CFXConnect)；石蜡包埋机(德国Leica，EG1150)；石蜡切片机(德国Leica，RM2016)；明美显微镜(广州市明美光电技术有限公司，MF43)；明美数码成像测量分析系统(广州市明美光电技术有限公司，MC50)；免疫组化成像系统(日本Nikon，DS-U3)；电泳仪(BIO－RAD公司，miniprotean3cell)；电转仪(HOEFER，TE77XP)；酶标仪(美国PE公司，VictorNivo)；化学发光成像系统(赛维尔公司，SCG-W3000)。
1.3.3 实验动物 1月龄雄性SD大鼠24只，体质量(100±10) g，购自江西中医药大学，生产许可证号：SCXK(赣)2023-0001，饲养于江西中医药大学，使用许可证号：SYXK(赣)2022-0002。环境温度20-22 ℃，相对湿度45%-65%，12 h光照/12 h黑暗条件，分笼饲养，自由饮食饮水。经1周适应性喂养后严格按照动物伦理要求开展实验研究。该实验获得江西中医药大学伦理委员会审核通过(动物福利伦理审查批准文号：JZLLSC20240524)。
1.4 实验方法

1.4.1 质粒载体的构建参考大鼠血管内皮生长因子受体2基因的转录本以及shRNA设计的一般原则，设计shRNA靶点，安排引物合成。研究设计了3个针对血管内皮生长因子受体2基因敲低的shRNA序列：Y29478、Y29479和Y29480，以及一个空白对照作用的shRNA序列：Y9957。具体序列信息见表1，2。所选用的干扰载体pAAV-U6-shRNA/spgRNAv2.0-CMV-EGFP-WPRE载体图谱见图1，插入待构建的shRNA序列。

在溶解合成好的oligo中加入互补单链并混合，加热，冷却至室温，形成带粘性末端的双链oligo片段。使用限制性内切酶处理表达载体，水浴锅中孵育以进行酶切反应，通过琼脂糖凝胶电泳检验酶切效果。将目的载体条带从凝胶中取下，做胶回收。在连接反应体系中将干扰片段与目的载体在16 ℃下连接过夜。实验所用连接反应体系见表3。

将具有抗生素抗性的质粒加入感受态细胞中，冰上放置30 min，热激90 s后冰上孵育2 min。加入LB液体培养基，以复苏细胞。取50 μL菌液涂平板，待菌液干燥后放入培养箱中培养。挑取平板上长出的转化子重悬于10 µL LB培养液中，取1 µL做模板进行菌落PCR鉴定，将鉴定得到的阳性克隆进行测序验证。使用Vector NTI软件对测序结果进行比对分析，阳性克隆测序无误后进行质粒小提。

1.4.2 腺相关病毒的包装将外源基因克隆进入载体。对构建好的病毒载体、携带腺病毒来源的基因pHelper和携带腺相关病毒复制和衣壳基因pAAV-RC质粒进行大量抽提。将液氮罐中的细胞冻存管水浴解冻，加入培养基培养细胞。当细胞生长汇合度达到70%左右时，进行细胞转染。去除原有的培养基，加入Opti-MEM培养基。将配好的转染试剂和质粒的复合体加入培养板中，6 h后弃去培养基，PBS洗涤，加入完全培养基培养。细胞转染完成后收集细胞到离心管中，经过离心、沉淀、超声等纯化步骤后，使用自制针头收集病毒层，使用定量PCR法检测腺相关病毒载体的基因组拷贝数，以此测定病毒颗粒数。最终得到的病毒滴度及总量信息如下表4。

1.4.3 病毒注射配制2%戊巴比妥钠溶液，按照30 mg/kg剂量腹腔注射麻醉12只大鼠，用小动物剃毛器去除颈项部毛发以备皮，碘伏消毒。注射的腺相关病毒总量按梯度设置，低、中、高剂量分别注射1×1011，2×1011，3×1011 v.g.，根据4种病毒编号的滴度计算所需的病毒原液体积。按照病毒滴度尽可能高、同一梯度体积一致的原则，加入PBS定容。最终，每种病毒的滴度均≥4.34×1012 v.g./mL。

切开大鼠颈项部皮肤、浅深层筋膜，找到头夹肌，使用微量进样器吸取对应体积的病毒平均分成4等分，于大鼠两侧头夹肌的头端和尾端4个点位上垂直进针，分别缓慢注射4种腺相关病毒Y29478、Y29479、Y29480、Y9957各3个不同剂量，旋转出针，见图2。缝合筋膜和皮肤，肌肉注射青霉素5万单位/只以预防伤口感染。

1.4.4 筛选病毒腺相关病毒载体的外源基因7-14 d开始表达，3周后表达达到高峰，而后能够持续表达。故筛选于注射病毒3周后进行取材检测。首先，采用2%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，切开皮肤和筋膜，找到头夹肌，将一块放入组织固定液中，用于免疫荧光检测血管内皮生长因子受体2蛋白表达；另取一块放入冻存管中，-80 ℃保存，用于荧光定量PCR检测血管内皮生长因子受体2 mRNA表达。过量麻醉处死大鼠，进行后续检测。
(1)免疫荧光检测病毒感染效率及血管内皮生长因子受体2蛋白表达：分别取4种病毒的高剂量组大鼠肌肉组织放于组织固定液中浸泡24 h以上，常温保存。将肌肉组织取出，放于通风橱中，用镊子展开皱缩的肌肉组织，用剪刀修剪整齐，再用手术刀横向切断肌肉(垂直于肌肉纹理)，放入包埋框内。经脱水、透明、浸蜡处理后，将肌肉组织横截面平行于包埋面中，石蜡包埋。将蜡块置于石蜡切片机进行切片，片厚设置为5 μm。使用毛笔将切片平摊于温水上，载玻片捞起后放于烤片架上进行烤片。按照抗原修复条件进行抗原修复。用组化笔在肌肉组织周围画一圈，滴加3%BSA进行血清封闭。在玻片上滴加配好的一抗，平放于湿盒内，4 ℃孵育过夜。经二抗孵育、DAPI复染细胞核后用抗荧光淬灭封片剂封固。荧光显微镜下观察，并对3个不同视野进行拍照。

(2)荧光定量PCR检测血管内皮生长因子受体2 mRNA表达：取匀浆管，加入1 mL的RNA提取液，置冰上预冷。取大鼠头夹肌组织100 mg，研钵中充分研磨。按照试剂说明书步骤提取RNA并使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度。将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200 μg/mL。取总RNA 10 μL，配成20 μL反应体系，轻轻混匀并离心，于普通PCR仪上完成反转录。取0.1 mL PCR反应板，反转录产物2 μL，引物体系1.5 μL，预混液7.5 μL，加水配成15 μL反应体系，每个反转录产物配制3管，引物序列见表5。于荧光定量PCR仪上完成扩增，采用相对定量2-ΔΔCt法分析结果。

1.4.5 功能验证经过12只SD大鼠的筛靶实验，敲定最佳shRNA序列(Y29478及对照Y9957)以及合适的病毒剂量，进行功能验证。另取12只SD大鼠随机分为腺相关病毒组和对照腺相关病毒组各6只。病毒注射方法同1.4.3。每只大鼠注射2×1011 v.g.的总量，加PBS定容至30 μL，平均分成4等分注射在两侧头夹肌的头端和尾端4个点位上。20周后取材检测大鼠颈肌血管内皮生长因子受体2 mRNA及蛋白表达情况，并检测肌纤维面积和微血管个数。
(1)荧光定量PCR检测血管内皮生长因子受体2 mRNA表达：方法同1.4.4(2)。
(2) Western blot检测血管内皮生长因子受体2蛋白表达：每块肌肉组织取20 mg待测样品，无菌剪刀剪碎肌肉组织，加入300 μL裂解液和研磨珠，使用高通量冷冻研磨仪进行研磨匀浆，将研磨后的组织放入低温离心机中，4 ℃ 12 000×g离心10 min，取上清进行蛋白定量。按照BCA法检测样品蛋白质浓度。加入PBS使得每个样品蛋白浓度一致。加入上样缓冲液，于沸水中变性。经制胶、电泳、转膜、封闭步骤后进行一抗(抗血管内皮生长因子受体2抗体，稀释比例1∶1 000；GAPDH稀释比例1∶5 000)孵育过夜，二抗(HRP山羊抗兔，稀释比例：1∶5 000)免疫反应。最后进行显影拍照。将得到的Western blot条带使用Image J软件进行灰度值读取，并记录分析。
(3)苏木精-伊红染色检测肌纤维面积：经脱水、石蜡包埋、切片、烤片、染色、封固等步骤对大鼠头夹肌横截面进行苏木精-伊红染色，每只大鼠拍一张200倍图片供分析。使用Image pro plus软件进行肌纤维面积检测，取平均值。
(4) CD31免疫组化检测微血管数目：CD31是血管内皮细胞的高度特异性标志物。研究采用免疫组化技术对大鼠头夹肌进行CD31染色，将石蜡包埋好的肌肉组织切片脱蜡至水，经抗原修复、阻断内源性过氧化物酶及血清封闭后滴加CD31一抗，
1 h后PBS冲洗，滴加二抗，15 min后PBS冲洗，DAB显色，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色，苏木素复染细胞核，常规脱水封固，使用显微镜进行图像采集。每只大鼠拍一张400倍图片供分析。使用安装有Cell Counter插件的Image J软件对微血管进行计数，取平均值。
1.5 主要观察指标 ①病毒感染效率；②大鼠颈肌血管内皮生长因子受体2 mRNA和蛋白表达；③颈肌肌纤维面积；④颈肌微血管数目。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0统计软件进行数据统计分析。计量资料符合正态分布以x±s表示。两组间比较，满足正态分布且方差齐性的情况下，采用两独立样本t检验。多组间两两比较，满足正态分布和方差齐性，采用One-way ANOVA。以P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经江西中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

此次研究构建shRNA质粒载体和腺相关病毒，通过动物筛靶敲定最佳shRNA序列为Y29478，合适的病毒总量为2×1011 v.g.。根据病毒包装的滴度情况保留尽可能大的滴度。在大鼠功能验证中，血管内皮生长因子受体2 mRNA和蛋白敲低表达获得成功，敲低血管内皮生长因子受体2后一定程度上能够引起肌肉萎缩，微血管数目减少。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，该技术能够特异性抑制特定基因的表达，在机制研究和基因治疗领域应用广泛[17]。短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)作为RNAi的一种，是由2个短反向重复序列组成，中间由一茎环(loop)序列分隔，形成发夹结构，由RNA聚合酶III(pol III)启动子控制，随后再连上五六个T作为pol III的转录终止子。细胞内转录的shRNA连入RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，引导核酸酶降解靶RNA。shRNA表达载体的一大亮点在于能够进行长期实验，通过抗生素标记能持续抑制细胞内靶基因活性，经检测抑制效果长达数周乃至更久。而病毒载体在介导shRNA表达时，展现了其直接高效感染细胞的优势，有效避免了质粒转染细胞时效率低下的问题，同时确保了转染效果的稳定性。现有的病毒载体包括慢病毒[18-19]、腺病毒和腺相关病毒等[9，20]。腺相关病毒因转染效率高[21]、安全且长期的基因表达能力等优势[22]，在机制研究和基因治疗领域得到广泛应用。
从已有的实验数据来看，不同的宿主类型及组织，腺相关病毒起始表达时间和持续表达时间存在较大差异。研究表明，在出生后第2天将治疗剂量的腺相关病毒载体静脉内递送至CNI小鼠模型(UGT1A1缺乏引起的高胆红素血症)，腺相关病毒载体基因治疗完全拯救了所有的突变小鼠，5个月时检测发现小鼠胆红素水平较低，脑组织学正常且运动协调[23]。接受腺相关病毒基因治疗的狗和非人灵长类动物中，基因组表达时间长达5-8年[24-25]。在一项关于人血友病B型(FIX活性< 1%正常值)的基因治疗研究中，外周静脉输注腺相关病毒改善血友病患者出血症状长达16个月之久。腺相关病毒作用时间与剂量、给药途径、宿主类型、血清型等因素有关[21]。高滴度可提高转导效率，但过量可能引发免疫反应。与全身注射相比，局部多点注射往往带来长时间持续表达。在非分裂细胞(如神经元、心肌细胞)中，腺相关病毒稳定存在，可持续表达数年之久，而在分裂细胞(如肠上皮细胞、皮肤细胞)中表达时间缩短。不同血清型对组织的亲和性存在较大差异，腺相关病毒 1，2，8，9型在肌肉组织中特异性较强。基于既往研究经验，腺相关病毒构建载体3周左右到达表达高峰，因此，此次研究筛靶时选取腺相关病毒注射3周后取材观测。这种表达可持续时间3个月以上，在神经系统等更新较慢的组织中可能更长，此次研究发现在腺相关病毒注射20周后，血管内皮生长因子受体2表达得到明显敲低，且出现了功能的部分丧失。
腺相关病毒在应用中可能存在一些毒副作用：①免疫反应[26]，当腺相关病毒感染抗原呈递细胞时，由于Toll样受体9的激活，可引起温和的先天免疫反应[27]，Toll样受体9识别核酸中未甲基化的CpG，从而激活经典通路和非经典核因子κB通路，促使炎细胞因子和干扰素应答基因的表达。应用时可通过设计腺相关病毒衣壳以逃避反应[28]。②引起功能突变和诱导癌症。研究表明，病毒基因组在成年和新生小鼠肝脏中主要保留在染色体外，由腺相关病毒载体转导，而其中少数整合到宿主DNA中，载体基因组随机整合到宿主DNA中可能引起功能突变，改变细胞功能和稳态，甚至诱导癌症的发生[29-30]。③静脉高剂量注射腺相关病毒会产生严重毒性，使转氨酶升高，甚至发生急性肝衰竭和休克[31]。因此，基于腺相关病毒的基因治疗策略的设计应始终旨在使载体效力最大化，以便在发挥基因表达的同时减少毒副作用。此次研究在选择腺相关病毒剂量时，采用梯度设置剂量的方式，选择了中等剂量以确保达到敲低血管内皮生长因子受体2表达的同时，尽可能减少腺相关病毒的毒副作用，并将其应用于功能验证阶段的大鼠。
血管内皮生长因子受体2是一种受体酪氨酸激酶，主要在血管内皮细胞中表达。作为细胞膜上的一个信号传导受体，介导血管内皮生长因子信号发挥生物学效应[4]，对血管生成和内皮功能障碍具有关键作用[5]。血管内皮生长因子受体2被认为是血管内皮生长因子对内皮细胞的几种生理学和病理学作用的主要介导物[32]，它通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号转导途径参与内皮细胞中的血管内皮生长因子存活信号[33]。该途径是抑制细胞凋亡的重要途径[34]，血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体2信号通路的激活可能在毛细血管供应的维持中发挥重要作用。血管内皮生长因子受体2在血管生成、组织修复以及疾病发生发展过程中发挥重要调节作用。
血管内皮生长因子受体2参与多种疾病的病理过程，包括恶性肿瘤[35-38]、创面难愈[39-40]、视网膜病变等血管性疾病[41-43]，靶向调控血管内皮生长因子受体2的表达是治疗上述疾病的有效策略。已有研究表明，血管内皮生长因子受体2是癌症治疗的潜在治疗靶点，其功能障碍会影响人类癌症的发生发展[44-45]。贝伐珠单抗通常被认为是第一线的抗肿瘤治疗[46]，它通过下调血管内皮生长因子并进一步沉默血管内皮生长因子受体2基因的活性来抑制肿瘤生长。在成人心内膜中过表达血管内皮生长因子受体2可修复心肌梗死后的心肌纤维化，增加血管密度，减少心肌细胞凋亡，从而改善心脏功能[47]。
既然血管内皮生长因子受体2可通过影响血管生成调控多种疾病，那么其是否可通过影响血管生成进而影响劳损肌肉的修复，从而调控颈椎病的进程呢？研究表明血管内皮生长因子受体2在正常肌肉中几乎不表达，而损伤后表达升高，其可能参与肌肉再生过程[48]。在急性缺血时血管内皮生长因子受体2表达广泛，而在慢性缺血时只有萎缩和再生的肌肉细胞表达[49]。血管内皮生长因子受体2的活化在信号传递中至关重要，活化的血管内皮生长因子受体2可激活PI3K/Akt信号通路干预细胞凋亡、自噬等[6-7]。课题组前期已证明PI3K/Akt信号通路在针刀治疗颈椎病中的重要作用[50]，血管内皮生长因子受体2在劳损肌肉中的修复作用不言而喻，干预血管内皮生长因子受体2进而影响PI3K/Akt通路可能是治疗颈椎病的有效策略。因此，血管内皮生长因子受体2具有促进血管生成、改善毛细血管供应、抑制肌肉细胞凋亡、减少肌肉萎缩的功能，这在此次研究中得到验证。
此次研究存在的局限性：病毒注射过程中采取切开注射的方式，此方法虽然能够确保腺相关病毒注射入大鼠肌肉组织，但存在感染的风险，对实验结果可能存在影响，未来可改进注射方式，优化实验方案，确保病毒感染及敲低效果。此外，研究采用CD31标记的方法对微血管数目进行计数评估，CD31虽然是血管内皮细胞的高度特异性标志物，但可能存在染色不清、主观误差等问题。
综上所述，课题组构建shRNA质粒载体和腺相关病毒，通过动物筛靶敲定shRNA序列及剂量，并通过大鼠功能验证证明了血管内皮生长因子受体2 mRNA和蛋白成功敲低表达，在一定程度上能够引起肌肉萎缩和微血管数目的减少。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血管内皮生长因子受体2基因敲低大鼠模型的构建及功能验证

Construction and functional verification of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene knockdown rats

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