膝骨关节炎治疗靶点：生物信息学法识别

doi:10.12307/2026.890

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (34): 8878-8888.doi: 10.12307/2026.890

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膝骨关节炎治疗靶点：生物信息学法识别

陈才1，洪钟源1，邓怀东1，曾勤1，陈健聪2

广州中医药大学附属东莞中医院，1骨一科，2康复医学科，广东省东莞市 523000

收稿日期:2025-09-17 修回日期:2026-02-12 出版日期:2026-12-08 发布日期:2026-04-11
通讯作者: 洪钟源，医学硕士，副主任中医师，广州中医药大学附属东莞中医院骨一科，广东省东莞市 523000
作者简介:陈才(曾用名：陈财)，男，1994年生，湖北省黄冈市人，汉族，医学硕士，主要从事四肢骨病与创伤的防治研究。
基金资助:
广东省中医药管理局科研项目(20231365)，项目负责人：洪钟源；广东省东莞市科技局社会发展科技项目(20221800900102)，项目负责人：邓怀东

Therapeutic targets for knee osteoarthritis: identification via a bioinformatics approach

Chen Cai1, Hong Zhongyuan1, Deng Huaidong1, Zeng Qin1, Chen Jiancong2

1Department of Orthopedics I, 2Department of Rehabilitation Medicine, Dongguan Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan 523000, Guangdong Province, China

Received:2025-09-17 Revised:2026-02-12 Online:2026-12-08 Published:2026-04-11
Contact: Hong Zhongyuan, MS, Associate chief physician, Department of Orthopedics I, Dongguan Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan 523000, Guangdong Province, China
About author:Chen Cai, MS, Department of Orthopedics I, Dongguan Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Dongguan 523000, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Research Project, No. 20231365 (to HZY); Dongguan Municipal Science and Technology Bureau Social Development Science and Technology Project, No. 20221800900102 (to DHD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
基于数据汇总的孟德尔随机化：是一种利用全基因组关联研究(GWAS)的汇总统计数据推断暴露因素与结局之间因果关系的方法，核心是通过遗传变异(如单核苷酸多态性)作为工具变量，模拟随机对照试验的随机分配特性，减少混杂偏倚和反向因果的影响，在疾病机制解析和精准医学中具有重要价值。
分子动力学：是一种基于牛顿力学原理的计算模拟方法，通过数值求解原子或分子的运动方程，研究特定条件下的动态行为及相互作用机制，被广泛应用于药物设计、生物大分子功能解析、材料科学等领域，尤其在揭示膝骨关节炎等疾病相关分子机制中具有重要价值。

背景：膝骨关节炎的病因复杂、机制尚未完全明确，针对膝骨关节炎候选靶基因的研究将有利于进一步明确疾病的发病机制，为精准治疗提供依据。
目的：通过基于汇总数据的孟德尔随机化联合生物信息学法识别膝骨关节炎的治疗靶点，并进行细胞验证。
方法：从基因表达综合数据库中选择基因表达谱GSE46750、GSE55235、GSE82107以及GSE206848，基于|log2 FC| > 0.585以及校正后的P < 0.05为筛选条件，利用R语言软件获取差异基因。通过加权基因共表达网络分析算法获得相关性最高的模块基因，并与差异基因取交集，对交集基因进行GO和KEGG富集分析。在eQTLGen数据库中，利用基于汇总数据的孟德尔随机化分析获得与膝骨关节炎显著相关的遗传基因，同时将生物信息学法与基于汇总数据的孟德尔随机化分析共同鉴定的基因作为核心基因。通过分子对接和动力学模拟评估塞来昔布与核心基因的结合情况，通过CIBERSORT算法对核心基因进行免疫浸润分析。将人软骨细胞分为正常组与实验组(白细胞介素1β诱导骨关节炎细胞模型)，qPCR检测肾上腺髓质素、人骨桥蛋白、溶酶体蛋白跨膜5 mRNA表达。
结果与结论：①生物信息学法共筛选出229个差异基因，GO富集分析显示差异基因主要与炎症反应、对外界刺激反应的正向调节、细胞活化的调节、趋化作用等生物学功能相关，KEGG富集分析显示差异基因主要富集于吞噬体、破骨细胞分化、补体与凝血级联信号通路与白细胞介素17信号通路等上。基于汇总数据的孟德尔随机化分析共获得了76个显著相关的遗传基因(P < 0.05，FDR < 0.05，HEIDI检验P > 0.05)。肾上腺髓质素、人骨桥蛋白、溶酶体蛋白跨膜5为核心基因，其中人骨桥蛋白、溶酶体蛋白跨膜5与膝骨关节炎的发展呈负相关，肾上腺髓质素与膝骨关节炎的发展呈正相关。分子对接与分子动力学模拟结果证实，核心基因与塞来昔布具有良好的构效关系。免疫浸润分析结果提示，肾上腺髓质素、人骨桥蛋白、溶酶体蛋白跨膜5均与多种免疫细胞存在相关性。qPCR检测显示，实验组细胞中人骨桥蛋白、溶酶体蛋白跨膜5 mRNA表达低于正常组(P < 0.001)，肾上腺髓质素mRNA表达高于正常组(P < 0.001)。②结果表明，肾上腺髓质素、人骨桥蛋白、溶酶体蛋白跨膜5是膝骨关节炎发展的关键基因，有望成为防治膝骨关节炎的新靶点。

https://orcid.org/0000-0001-7279-0281(陈才)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 基因表达谱, 差异基因, 关键基因, 膝骨关节炎, 基于汇总数据的孟德尔随机化分析, 分子对接, 分子动力学, 实验验证

Abstract: BACKGROUND: The etiology of knee osteoarthritis is complex and its mechanisms are not fully understood. Research on candidate target genes for knee osteoarthritis will help further clarify the pathogenesis of the disease and provide a basis for precision treatment.
OBJECTIVE: To identify therapeutic targets for knee osteoarthritis based on summary data using Mendelian randomization combined with bioinformatics methods, followed by cellular validation.
METHODS: Gene expression profiles GSE46750, GSE55235, GSE82107, and GSE206848 were downloaded from the Gene Expression Omnibus database. Differentially expressed genes were obtained using R software with screening criteria of |log2FC| > 0.585 and adjusted P < 0.05. Module genes with the highest correlation were acquired using the Weighted Gene Co-expression Network Analysis algorithm and intersected with differentially expressed genes. Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analyses were performed on the intersecting genes. Genetic genes significantly associated with knee osteoarthritis were obtained from the eQTLGen database using summary-data-based Mendelian randomization analysis. Genes jointly identified by both bioinformatics and summary-data-based Mendelian randomization analysis were defined as core genes. The binding of celecoxib to core genes was evaluated via molecular docking and dynamics simulations. Immune infiltration analysis of core genes was performed using the CIBERSORT algorithm. Human chondrocytes were divided into a normal group and an experimental group (interleukin-1β-induced osteoarthritis cell models). The mRNA expression of adrenomedullin, human osteopontin, and lysosomal membrane protein 5 was detected by qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Bioinformatics analysis identified 229 differentially expressed genes. Gene Ontology enrichment analysis showed that these genes were mainly associated with biological functions such as inflammatory response, positive regulation of response to external stimulus, regulation of cell activation, and chemotaxis. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis revealed significant enrichment in pathways including phagosome, osteoclast differentiation, complement and coagulation cascades, and interleukin-17 signaling pathway. Summary-data-based Mendelian randomization analysis identified 76 significantly associated genetic genes (P < 0.05, FDR < 0.05, HEIDI test P > 0.05). Adrenomedullin, human osteopontin, and lysosomal membrane protein 5 were identified as core genes. Human osteopontin and lysosomal membrane protein 5 were negatively correlated with the progression of knee osteoarthritis, while adrenomedullin was positively correlated with the progression of knee osteoarthritis. Molecular docking and molecular dynamics simulations confirmed favorable structure-activity relationships between the core genes and celecoxib. Immune infiltration analysis suggested that adrenomedullin, human osteopontin, and lysosomal membrane protein 5 were correlated with multiple immune cell types. qPCR detection showed that the mRNA expression of human osteopontin and lysosomal membrane protein 5 in the experimental group was lower than that in the normal group (P < 0.001), while the mRNA expression of adrenomedullin was higher than that in the normal group (P < 0.001). These findings indicate that adrenomedullin, human osteopontin, and lysosomal membrane protein 5 are key genes in the progression of knee osteoarthritis and may serve as promising novel targets for its prevention and treatment.

Key words: gene expression profile, differential genes, key genes, knee osteoarthritis, summary-data-based Mendelian randomization analysis, molecular docking, molecular dynamics, experimental validation

中图分类号:

陈才, 洪钟源, 邓怀东, 曾勤, 陈健聪. 膝骨关节炎治疗靶点：生物信息学法识别[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(34): 8878-8888.

Chen Cai, Hong Zhongyuan, Deng Huaidong, Zeng Qin, Chen Jiancong. Therapeutic targets for knee osteoarthritis: identification via a bioinformatics approach[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(34): 8878-8888.

图/表（结果） 10

2.1 数据集的主成分分析结果将合并的芯片数据集文件进行主成分分析，检验数据的批次矫正结果。结果如图2所示，图2A表示批次矫正前各芯片数据样本分布情况，图中各组实验样品是分开分布的，代表4组样本来源存在批次效应；图2B代表批次矫正后样本分布情况，图中各组实验样本属于随机打乱状态，表明4组样本来源的数据已经消除了批次性。

2.2 膝骨关节炎差异基因的鉴定基于P < 0.05、|log2FC| > 0.585的条件，4组基因表达谱数据集共获得了257个差异基因，其中包括51个表达下调的差异基因和206个上调的差异基因，如图3所示。

2.3 利用WGCNA算法获取膝骨关节炎的关键模块基因 WGCNA算法结果表明，turquoise模块是正负相关性最强的模块，其中包含862个基因，结果如图4所示。
2.4 交集基因的GO与KEGG富集分析结果将NCBI数据筛选的257个差异基因与WGCNA算法获得的862个关键模块基因取交集，共获得了229个交集基因，GO富集分析结果显示，生物信息学法获得的差异基因参与炎症反应、对外界刺激反应的正向调节、细胞活化的调节、趋化作用等生物学功能；KEGG富集分析结果表明，差异基因主要富集在吞噬体、破骨细胞分化、补体与凝血级联信号通路与白细胞介素17信号通路上，见图5。

2.5 SMR分析获得膝骨关节炎强相关遗传基因基于P < 0.05、FDR < 0.05、HEIDI 检验P > 0.05为条件，SMR分析共获得了76个基因与eQTL变异显著相关，利用R语言软件构建可视化曼哈顿图，如图6所示。
2.6 生物信息学法与SMR分析的交集基因将生物信息学法与SMR分析获得的基因通过韦恩分析法取交集，SPP1(人骨桥蛋白?)、LAPTM5(溶酶体蛋白跨膜5)与ADM(肾上腺髓质素)是此次研究得到的关键基因，如图7所示。
2.7 核心基因与膝骨关节炎的遗传风险关系构建SPP1、LAPTM5与ADM与膝骨关节炎的遗传共定位分析，并构建风险关系线形图，如图8所示。SMR分析结果表明，SPP1、LAPTM5 eQTL中单核苷酸多态性的效应值与GWAS数据库中膝骨关节炎的效应值呈负相关，ADM eQTL中的单核苷酸多态性效应值与GWAS数据库中膝骨关节炎的效应值呈正相关，表明遗传决定的SPP1与LAPTM5是膝骨关节炎的“保护”基因，而ADM是膝骨关节炎的致病基因。
2.8 膝骨关节炎核心基因的免疫浸润分析结果采用CIBERSORT算法获得了膝骨关节炎中22种免疫细胞类型的比例，结果表明，SPP1与巨噬细胞M0、调节性T细胞呈正相关，与静息树突状细胞、单核细胞、活化的NK细胞和静息肥大细胞呈负相关；LAPTM5与巨噬细胞M2呈正相关，与幼稚B细胞、巨噬细胞M1和浆细胞呈负相关；ADM与浆细胞呈正相关，与调节性T细胞呈负相关。结果如图9所示。
2.9 分子对接与分子动力学模拟结果
2.9.1 分子对接结果分子对接结果表明核心基因与塞来昔布活性成分均能稳定结合，一般来说当结合能小于-20.92 kJ/mol时表明二者具有较好的结合活性，小于-29.29 kJ/mol表明二者有强烈的结合活性[12]，结合能越低说明两者结合活性越强、亲和力越高、构象也越稳定，表明这些配体与相应的受体靶蛋白具有良好的结合亲和力，详细结果见表2，可视化结果见图10。

2.9.2 分子动力学模拟结果核心基因与塞来昔布的分子动力学模拟图，见图11，12。
均方根偏差是衡量蛋白质和配体构象稳定性的良好指标，也是衡量原子位置与起始位置偏差程度的指标，均方根偏差越小，构象的稳定性越好。因此，利用均方根偏差对仿真系统的平衡性进行了评估。结果显示，SPP1-塞来昔布复合物体系的均方根偏差在30 ns后达到平衡，最终在0.33 nm上下波动。ADM-塞来昔布复合物体系的均方根偏差在98 ns后达到平衡，最终在0.31 nm上下波动。LAPTM5-塞来昔布复合物体系的均方根偏差在40 ns后达到平衡，最终在2.27 nm上下波动。
回转半径可以用来描述整体结构的变化情况，可用于表征蛋白质结构的紧密程度，回转半径变化越大表明体系越膨胀。结果显示，SPP1-塞来昔布、ADM-塞来昔布和LAPTM5-塞来昔布复合物体系在运动过程中呈现轻微波动，说明小分子-靶蛋白复合物在运动过程中发生了构象变化。
溶剂可及表面积是评估蛋白质表面积的指标，此次模拟计算靶蛋白和小分子之间的溶剂可及表面积，结果显示，SPP1-塞来昔布、ADM-塞来昔布和LAPTM5-塞来昔布复合物体系呈现轻微波动，证明结合小分子会影响结合微环境，并导致一定程度上溶剂可及表面积的变化。
氢键在配体与蛋白质的结合中起着重要的作用。结果显示，SPP1-塞来昔布小分子与靶蛋白之间的氢键数量为0-5，在大多数情况下复合物大约有2个氢键；ADM-塞来昔布小分子与靶蛋白之间的氢键数量为0-4，在大多数情况下复合物大约有2个氢键；LAPTM5-塞来昔布小分子与靶蛋白之间的氢键数量为0-3，在大多数情况下复合物大约有1个氢键，表明这种配体与靶蛋白具有良好的氢键相互作用。
均方根涨落值可以表示蛋白质中氨基酸残基的柔性大小。SPP1-塞来昔布和ADM-塞来昔布复合物的均方根涨落值相对较低(大多在0.5 nm以下)，因此灵活性更低，稳定性较高。LAPTM5-塞来昔布复合物的均方根涨落值较高(大多在0.7 nm以下)，因此复合物具有较高的柔性。
2.10 核心基因的细胞实验验证结果 qPCR检测结果表明，实验组细胞中ADM mRNA表达高于正常组(P < 0.001)，SPP1与LAPTM5 mRNA表达低于正常组(P < 0.001)，结果如图13所示。

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引言

膝骨关节炎是一种与年龄相关的退行性疾病，主要病理表现包括滑膜炎、软骨变性、软骨下骨重塑和骨赘形成，导致关节疼痛、肿胀、僵硬，严重者导致残疾[1]。据流行病学调查显示，全球约有2.5亿人患有膝骨关节炎[2]，因此，该疾病已经成为全球公共卫生日益关注的问题。膝骨关节炎引起的疼痛、功能障碍甚至残疾需要反复和长期治疗，目前的治疗策略主要侧重于缓解症状，尽可能延缓膝骨关节炎的发展，尚无有效药物可以完全抑制膝骨关节炎的进展，而疾病晚期往往需要进行全膝关节置换手术，这给患者及社会均带来了较大的负担[3-4]。膝骨关节炎的发病机制尚不清楚，致病因素包括异常生物学因素、遗传因素、细胞衰老和凋亡、局部炎症因子、自由基和蛋白酶等[5-6]。针对膝骨关节炎候选靶基因的研究将有利于进一步明确疾病的发病机制，为该疾病的精准治疗提供依据。
孟德尔随机化利用单核苷酸多态性作为遗传变异来评估暴露与结果之间的因果关系。通过使用遗传变异作为工具变量，孟德尔随机化有助于减轻观察性研究中固有的混杂因素并逆转因果偏差，因此，孟德尔随机化研究可以被认为是一项随机对照试验，将暴露对结果的影响进行因果推断[7]。与传统的观察性研究相比，孟德尔随机化研究具有样本量大、未知混杂因素和反向因果关系影响较小等优势，近年来在研究中得到广泛应用[8]。基于汇总数据的孟德尔随机化(Summary-data-based Mendelian Randomization，SMR)扩展并发展了孟德尔随机化的概念，它可以利用独立的全基因组关联研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)统计数据和数量性状位点数据，从GWAS中识别出的命中基因中筛选出潜在的因果基因[9]。
生信筛选基因是生物信息学中的一项重要工作，通过对大量基因数据进行分析和筛选确定与特定疾病或生物过程相关的基因，以便深入研究其功能和作用机制。此次研究利用生物信息方法从NCBI数据库以及加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA)整合收集并筛选出了膝骨关节炎的关键基因，联合SMR分析筛选膝骨关节炎的治疗靶点，结合分子对接、分子动力学模拟、免疫浸润分析进一步探索相关机制，以期为膝骨关节炎的临床治疗提供有效治疗靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计通过NCBI数据库获取多组基因膝骨关节炎芯片数据，利用生物信息学的方法筛选差异基因；利用SMR分析法从eQTL数据数据库中获取与膝骨关节炎发病显著相关的遗传基因，结合两种分析方法寻找膝骨关节炎的治疗靶点。研究方案设计见图1。
1.2 时间及地点实验于2024年9月至2025年5月在广州中医药大学附属东莞中医院完成。

1.3 材料人软骨细胞(CP-H107)、白细胞介素1β(PCK047)(武汉普诺赛生命科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；青霉素-链霉素(北京索莱宝科技有限公司)；Trizol溶液(美国ThermoFisher公司)；反转录试剂盒、SYBR Green PCR Mastermix试剂(日本Takara公司)；CO2细胞培养箱(INCO108，德国Memmert公司)；离心机(ST16，美国

ThermoFisher公司)；移液枪(德国Eppendorf公司)。

1.4 方法
1.4.1 差异基因的筛选及功能分析
芯片数据集的获取：NCBI是由美国国家卫生研究院于1988年成立的机构，包括GenBank、PubMed、Protein和SNP等子数据库，用于研究遗传学、分子生物学和生物信息学等领域。此次研究从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中以“knee osteoarthritis”为关键词搜索人类基因芯片表达谱，获取了GSE46750、GSE55235、GSE82107以及GSE206848的微阵列数据集。GSE46750的微阵列数据包含12个膝骨关节炎样本和12个正常对照样本；GSE55235的微阵列数据包含10个膝骨关节炎样本和10个正常对照样本；GSE82107的微阵列数据包含10个膝骨关节炎样本和7个正常对照样本；GSE206848的微阵列数据包含7个膝骨关节炎组样本和7个正常对照样本。
芯片数据集的注释及合并：使用Perl(https://www.perl.org/5.30.0.1版本)脚本对GSE46750、GSE55235、GSE82107以及GSE206848的微阵列数据集进行注释，将探针名转换为基因名。利用R语言软件中的“limma”包以及“sva”包对GSE46750、GSE55235、GSE82107以及GSE206848的微阵列数据集进行合并。
主成分分析：利用R语言软件中的ggplot2包以及ggpubr包对合并后的微阵列数据集进行主成分分析，检验批次效应。
生物信息学法获取差异基因：将4组合并后的微阵列数据集基于|log2 FC| > 0.585(FC≥1.5)以及校正后的P < 0.05为筛选条件，利用R语言软件中的limma包进行筛选，获取数据集中的差异基因；使用 R语言软件中的WGCNA软件包获取膝骨关节炎相关性最高的模块基因，获得两者的交集基因。
GO富集分析与KEGG富集分析：基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析用于注释基因，包括生物学过程、分子功能和细胞成分。京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析除了能够对基因进行注释，还可以揭示基因参与的人体各条通路信息。此次研究利用Metascape(http://metascape.org/)分析工具对生物信息学法获得的交集基因进行富集分析。
1.4.2 SMR分析
数据下载：eQTLGen数据库是基因表达调控研究领域的重要资源，由国际联盟eQTLGen Consortium构建，专注于探索遗传变异与基因表达水平的关联，由荷兰格罗宁根大学牵头于2021年9月完成，整合了37个数据集，涵盖31 684名欧洲血统个体的血液样本，为研究人员提供了大量的遗传变异与基因表达调控之间的关联数据。此次研究通过eQTLGen数据库(www.eqtlgen.org/)下载表达数量性状位点(Expression Quantitative Trait Loci，eQTL)数据，结局数据在FinnGen数(https://www.
finngen.fi/en)据库中获得，从FinnGen数据库中下载phenocode为“finngen_R10_M13_ARTHROSIS_KNEE_PRIM_KNEESURG”的压缩文件，里面包含21 059例膝骨关节炎样本和368 411例正常对照样本。
整理数据获取SMR分析结果：利用R语言软件中的“dplyr”与“tidyr”软件包对疾病数据文件进行整理。准备基因型文件1000G EUR、eQTL数据文件、整理后的疾病数据文件outcome.ma、smr-1.3.1-win.exe软件，设置maf 0.01、thread-num 10，利用perl脚本进行SMR分析，获取SMR.result.smr的结果文件。
结果文件ID转换：从Ensemble数据库(www.ensembl.org/)中下载了人基因组注释gtf文件，利用perl脚本对SMR分析结果文件进行ID的转换。
SMR分析疾病相关基因：准备SMR分析的结果txt文件，设置P < 0.05、FDR < 0.05、HEIDI检验P > 0.05，高连锁不平衡(LD)(r2 > 0.9)或弱LD(r2 < 0.05)的单核苷酸多态性被排除，利用R语言软件进行筛选，并利用“dplyr”“tidyr”“CMplot”软件包构建曼哈顿图进行展示。
1.4.3 核心基因的eQTL共定位分析利用Sangerbox数据库(http://www.sangerbox.com/home.html)构建生物信息学法与SMR分析法所获得的交集基因，被认为是此次研究的核心基因。准备1000G EUR、eQTL数据文件、整理后的疾病数据文件outcome.ma、smr-1.3.1-win.exe软件提取单个核心基因的数据文件，利用R语言软件进行eQTL共定位分析，并通过“magick”与“TeachingDemos”软件包构建可视化单基因散点图。
1.4.4 分子对接与分子动力学分析
分子对接分析：从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)以及UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中下载核心基因的PDB文件，它们的PDB ID分别为9EOU、5V6Y与Q13571；利用PyMOL软件进行去除水分子、分离蛋白和小分子处理。塞来昔布为临床中最常见膝骨关节炎的治疗药物，在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得塞来昔布的sdf文件，利用 Chem3D软件对sdf文件进行优化并保存为mol2 格式的小分子配体文件，通过 AutoDockTools 打开，加氢，通过 Grid Box命令，设置对接盒子的中心坐标9EOU(center_x=108.234，center_y=110.787，center_z=108.67)，5V6Y(center_x=217.459，center_y=-2.154，center_z=86.507)与Q13571(center_x=-0.443，center_y=2.675，center_z=5.032)；对接盒子的尺寸9EOU
(size_x=41.25，size_y=39.75，size_z=43.5)；5V6Y(size_x=40.5，size_y=41.25，size_z=47.25)与Q13571(size_x=47.25，size_y=47.25，size_z=47.25)，建立受体蛋白活性口袋并导出为gpf格式文件，利用AutoDock Vina软件进行分子对接，通过PyMOL软件进行分子对接结果可视化操作。
分子动力学模拟：采用Gromacs 2022进行分子动力学模拟。通过Gromacs的pdb2gmx工具和AutoFF网页获得力场参数。在模拟过程中，受体蛋白分子参数采用CHARMM36力场，配体分子参数使用CGenff力场[10]。将系统周围加上1 nm的TIP3P型立方体水盒子进行溶剂化，利用gmx genion工具在体系中添加了离子，以实现系统的电中性。长程静电相互作用通过The Particle Mesh Ewald(PME)方法进行处理，截断距离设置为1 nm。所有键的约束通过SHAKE算法完成，采用Verlet蛙跳算法将分子动力学模拟过程中的积分步长设置为1 fs。在分子动力学模拟前，体系经过能量优化，能量最小化过程包括3 000步最陡下降法优化，接着进行2 000步的共轭梯度法优化。模拟运行条件为310 K的温度和恒压下的NPT系统，模拟时间为100 ns与200 ns。在模拟过程中，使用g-rmsd、g-rmsf、g-hbond、g-Rg和g-sasa工具分别计算均方根偏差、均方根波动、氢键、回旋半径和溶剂可及表面积。
1.4.5 免疫浸润分析 CIBERSORT算法(https://cibersort.stanford.edu/)是一种广泛应用于计算微阵列分析复杂组织中22种免疫细胞比例的方法[1]。将GSE46750、GSE55235、GSE82107以及GSE206848合并后的文件，基于P < 0.05进行分析获得免疫细胞在各样本中的含量。使用R语言软件包比对计算出各样本中免疫细胞的浸润情况；根据P < 0.05筛选样品，计算样品中每种免疫细胞的百分比。准备免疫细胞百分比的结果文件，提取此次研究核心基因的表达量和免疫细胞的含量，基于P < 0.05获得基因与免疫细胞相关性结果，并构建相关性条形图，所有操作均在R语言软件中进行。
1.4.6 体外实验验证分析
细胞培养：复苏后人软骨细胞，置于含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基(完全培养基)中，以合适的密度种入细胞培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中。细胞融合度达到80%即进行传代操作。取第3代人软骨细胞，通过移液枪移除原细胞瓶中的细胞培养基，加入适量PBS清洗并吸弃，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，通过移液枪和巴氏吸管进行吹打，待吹打完成后收集细胞混悬液，
1 000 r/min离心5 min后吸弃上清，加入1 mL完全培养基重悬，制备合适浓度(1×108 L-1)的细胞混悬液进行铺板处理，细胞贴壁后分2组培养：正常组不进行任何处理，实验组加入10 ng/mL白细胞介素1β诱导24 h(建立膝骨关节炎细胞模型)[11]。

qPCR检测：诱导24 h后，收集两组细胞，使用Trizol溶液提取总RNA，分别加入氯仿、异丙醇充分振荡，离心后加入体积分数75%乙醇进行洗涤，使用ddH2O溶解RNA；使用反转录试剂盒，按照说明书配制反应体系，提取cDNA，使用SYBR Green PCR Mastermix试剂盒构建qPCR反应体系，随后进行95 ℃10 s、退火55-65 ℃ 10 s、延伸72 ℃30 s，总共40个循环操作。以GAPDH作为内参，分别计算对照组及实验组ΔCt值，使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。基因引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 SMR联合生物信息学法识别膝骨关节炎的治疗靶点。
1.6 统计学分析在SMR分析中，y为结果，x为暴露因素，z是工具变量，bxy是x对y的影响大小，bzx是z对x的影响，bzy是z对y的影响，bxy(定义为bxy=bzy/bzx)被解释为效应x与y之间没有非遗传混杂因素10。通过HEIDI检验进行异质性分析筛选单核苷酸多态性，高连锁不平衡(r2 > 0.9)或弱连锁不平衡(r2 < 0.05)的单核苷酸多态性被排除，HEIDI检验P < 0.05表明存在多效性被排除，错误发现率(false discovery rate，FDR)校正适用于所有遗传基因，FDR > 0.05被排除在外。在qPCR实验中，通过SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析并绘制图像，所有实验均独立进行3次，数据采用x±s表示，独立样本t检验用于组间比较。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经过广州中医药大学附属东莞中医院生物统计学专家审核。

讨论

膝骨关节炎当前的治疗困境主要体现在病因复杂、机制尚不完全明确、疾病进展不可逆、治疗手段有限等方面，寻找新的治疗靶点将有助于填补现有治疗的空白，改善患者预后。近年来，越来越多的研究者聚焦于多种组学数据的整合分析研究，并且得到了一定成效[13]。此次研究CIA用4组膝骨关节炎微阵列数据集，通过批量校正，设置基于P < 0.05、 |log2FC| > 0.585的阀值，筛选出膝骨关节炎的差异基因；通过WGCNA算法构建基因共表达网络，揭示基因间的协同调控关系，并筛选与疾病相关的核心模块基因；通过对GEO数据库中获得的差异基因与WGCNA关键模块基因取交集，进一步筛选了229个核心基因。通过对229个核心基因进行GO与KEGG富集分析，结果证实差异基因显著富集的生物学功能与通路均与膝骨关节炎的发生相关，进一步提高了所筛选基因的可信度。孟德尔随机化作为一种基于遗传变异的因果推断方法，在疾病靶点发现中具有重要的科学意义和应用价值。此次研究利用SMR分析整合了与膝骨关节炎相关的eQTL数据，鉴定了与膝骨关节炎显著相关的遗传基因。既往已有学者通过差异基因表达分析、WGCNA算法和孟德尔随机化分析来共同鉴定疾病的关键基因[14]，此次研究通过这3种共同筛选方式得到膝骨关节炎的3个核心基因(SPP1、LAPTM5与ADM)，结合分子对接、分子动力学模拟与免疫浸润分析进行一步证实了3个核心基因与膝骨关节炎相关联的作用机制。体外实验是治疗靶点发现到临床应用的必经验证环节，在临床中，炎症因子如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等会促进软骨降解和骨破坏，而软骨细胞在炎症因子作用下会释放更多的炎症递质，加速软骨破坏，这些导致膝骨关节炎的发生。此次研究利用10 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞，很好地模拟临床中膝骨关节炎的炎症环境，通过qPCR实验验证了3个核心基因与膝骨关节炎的关系。通过生信分析提供关联证据，而SMR分析提供因果证据，这显著提升了此次研究结论的生物学合理性和临床转化价值。
GO富集分析结果表明，膝骨关节炎的差异基因主要与炎症反应、对外界刺激反应的正向调节、细胞活化的调节、趋化作用等生物学过程相关。膝骨关节炎的发病机制涉及炎症，炎症细胞因子作用于软骨细胞可诱导基质降解，进而导致关节炎性及软骨退变[15]。多种细胞的活化与膝骨关节炎的发展相关，例如，巨噬细胞可以活化为促炎巨噬细胞和抗炎巨噬细胞，促炎巨噬细胞产生大量促炎递质，包括白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素12、肿瘤坏死因子α和环氧合酶2；相反，抗炎巨噬细胞表现出抗炎作用并分泌白细胞介素4和白细胞介素10，有助于组织修复和重建，促炎/抗炎巨噬细胞的失衡可以体现膝骨关节炎的严重程度[16]。此次研究结果显示，膝骨关节炎差异基因主要富集在吞噬体、破骨细胞分化、补体与凝血级联信号通路与白细胞介素17等信号通路上。多项研究发现，吞噬体通过调控滑膜巨噬细胞的极化和功能，在膝骨关节炎的炎症反应和软骨退变中发挥关键作用。在膝骨关节炎中，破骨细胞前体细胞过度分化为成熟的破骨细胞，从而不断侵蚀软骨下骨基质并释放出大量潜在的转化生长因子β，继而促进了间充质基质细胞向成骨前体细胞的迁移和分化，并最终在软骨下-髓质腔中形成异常的骨岛，导致软骨下骨微结构的破坏，同时改变了关节应力分布，最终导致软骨变性和损伤[17]。白细胞介素17为前炎性细胞因子，能分泌多种促炎性细胞因子，抑制蛋白聚糖等细胞外基质的合成，诱导关节软骨的破坏[18]。总体而言，GO和KEGG富集分析均表明，生物信息学法获得的差异基因与膝骨关节炎的疾病进展之间存在很强的相关性。
SPP1是一种编码在人类4号染色体(4q13.22)上的多面糖蛋白，属于整合素小结合N-糖蛋白家族，在骨骼和各种组织中普遍表达[19]。据报道，SPP1参与多种生理过程，包括骨矿化、细胞介导的免疫反应、癌症转移、炎症和血管生成[19-20]。越来越多的证据表明，异常的SPP1表达可能是膝骨关节炎的分子发病机制的基础，并导致关节软骨的进行性退化[21]。SPP1首先被发现在膝骨关节炎软骨中高表达，后来更多的研究表明SPP1在膝骨关节炎患者的软骨下骨和滑膜中也有高表达[22]。此外，SPP1在骨代谢平衡中起着至关重要作用[23-24]。众多研究证实，骨桥蛋白与膝骨关节炎的进展密切相关[23，25]。SPP1是此次研究得到的膝骨关节炎治疗的核心基因，这与GONG等[26]与YANG等[27]
的研究一致。SMR分析证实，SPP1(bSMR=-0.092，PSMR= 5.56×10-5)对膝骨关节炎的发展起到保护作用。LUO等[28]的研究发现，在膝骨关节炎小鼠中，骨桥蛋白通过CD44启动细胞内级联反应，导致透明质酸水平的合成代谢增加，从而抑制膝骨关节炎的进展。类似的，LIU等[29]在实验中证实，骨桥蛋白通过与CD44结合直接抑制膝骨关节炎软骨细胞中磷脂酰肌醇 3-激酶的表达水平，从而抑制膝骨关节炎的进展。此外，SHANG等[30]检测发现，骨桥蛋白基因rs11730582多态性降低了中国汉族人群膝骨关节炎的风险。以上研究均与此次研究结果一致。
LAPTM5是一种优先在造血细胞中表达的溶酶体跨膜蛋白，参加细胞死亡、自噬、免疫、炎症调控等生理过程，与多种疾病的发展相关[31]。此次研究利用SMR分析发现，LAPTM5(bSMR=-0.15，PSMR=4.48×10-5)对膝骨关节炎具有抑制作用，而目前暂无研究发现LAPTM5与膝骨关节炎的发病直接相关，但有研究发现LAPTM5与成骨分化及自噬的调节相关联[32]。软骨下骨与膝骨关节炎的发病密切相关，在膝骨关节炎早期，软骨下骨的变化与破骨细胞激活增加骨吸收有关，而在晚期则与成骨细胞活性增加导致骨形成增强相关[33]。在乳腺癌中，基因LAPTM5与Wnt/β-catenin信号激活相关[34]。Wnt/β-ca-tenin通路在维持软骨稳态方面发挥着重要作用，软骨组织中表达的β-catenin与膝骨关节炎的严重程度呈正相关，Wnt/β-catenin通路激活会导致成年小鼠膝骨关节炎的发生[35]。类似的，在心肌梗死小鼠中LAPTM5与核因子κB信号通路的激活相关[36]；而核因子κB信号通路在膝骨关节炎的发病机制中发挥着关键作用，参与调节炎症反应和软骨退化[37]。
ADM是一种52个氨基酸的肽，最初在人嗜铬细胞瘤中被发现，ADM不仅在心血管系统中表达，也在骨骼和关节结构中表达[38]。有研究发现，ADM受肿瘤坏死因子α调节，ADM下调可抑制脂肪生成和骨细胞合成[39]。还有证据发现ADM是膝骨关节炎中的缺氧相关基因，作为一种抗凋亡肽，ADM通过增加氧化应激产物和促炎细胞因子来促进炎症性关节炎中新细胞凋亡和软骨细胞去分化，这意味着在某些条件下，ADM基因可能在膝骨关节炎中表现出高表达水平，从而影响膝骨关节炎的发展[40]。
此次研究结果显示，ADM(bSMR=0.129，PSMR=3.35×10-5 )是膝骨关节炎发展的核心基因，SMR分析共定位发现该基因与膝骨关节炎的发展呈正相关，这表明ADM可能是膝骨关节炎发展的危险因素，并且qPCR检测显示实验组中ADM基因表达量远高于正常组(P < 0.001)。类似的，既往的一项发现与健康对照组相比，类风湿关节炎和膝骨关节炎患者血浆ADM浓度相对较高[38]。ABD ELAZEEM等[39]研究成果证实，血浆ADM水平随着膝骨关节炎的严重程度而增加，它可用作检测疾病严重程度的生物标志物，与膝骨关节炎严重程度呈正相关，这与此次研究结果一致。
免疫浸润分析结果显示，SPP1在膝骨关节炎中主要与巨噬细胞M0、调节性T细胞呈正向调控关系，与休眠树突状细胞、单核细胞、激活的NK细胞、休眠肥大细胞呈负向调控关系；LAPTM5与巨噬细胞M2呈正向调控关系，与幼稚B细胞、巨噬细胞M1和浆细胞呈负向调控关系；ADM与浆细胞呈正向调控关系，与调节性T细胞呈负向调控关系。当组织中受到不同刺激后，巨噬细胞M0可以极化为经典的促炎性M1或免疫抑制性M2巨噬细胞[40-42]。巨噬细胞主要有两种激活表型：经典激活的M1和替代激活的M2，M1型巨噬细胞主要参与炎症的起始阶段，M2型巨噬细胞主要参与炎症的消退阶段。研究证实，M2巨噬细胞具有抗炎功能并促进软骨修复，从而减轻膝骨关节炎的疾病进程；而M1巨噬细胞可以促进膝骨关节炎中的软骨细胞凋亡，加重膝骨关节炎的进展[43-44]。调节性T细胞是炎症和自身免疫性疾病中免疫反应的重要调节因子，存在于脂肪组织、骨骼肌以及滑膜组织等全身多个组织中，它抑制CD4+ T 细胞和CD8+ T 细胞的增殖、激活和细胞因子产生，以维持免疫稳态。在膝骨关节炎中，调节性T细胞能够缓解疼痛、抑制炎症反应[45-46]。单核细胞是先天免疫细胞，在膝骨关节炎炎症反应中发挥重要作用，它们迁移到关节软骨的软骨下区域并分化为巨噬细胞和破骨细胞；此外，单核细胞还产生炎症细胞因子和酶，从而加剧炎症，从而加剧软骨退化[47]。先天免疫细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和其他细胞。适应性免疫细胞是个体在外部环境中受到抗原性异物刺激而产生的细胞，包括T细胞亚群、B细胞亚群和NK细胞[48]。B 细胞是适应性免疫系统的重要组成部分，与抗原相遇后，B细胞被激活并分化为浆母细胞和浆细胞[49]。研究发现，与骨髓来源的基质细胞相比，膝骨关节炎滑膜炎的基质细胞支持使浆细胞更好地存活，并具有更多的细胞群和更高的免疫球蛋白分泌[50]。研究证实，B细胞、NK细胞和中性粒细胞可以分泌白细胞介素1β，而白细胞介素1β可以通过诱导胶原酶和聚集蛋白聚糖酶引发细胞外基质降解，导致软骨细胞肥大和去分化，最终导致软骨细胞凋亡，导致膝骨关节炎的发生[48]。此次研究结果表明，SPP1、LAPTM5与抑制膝骨关节炎发展的相关免疫细胞呈正相关，相反与促进膝骨关节炎的一些免疫细胞呈负相关；而ADM则相反，它与抑制膝骨关节炎炎症发展的调节性T细胞呈负相关。免疫浸润的结果进一步证实，SPP1与LAPTM5与膝骨关节炎的严重程度呈负相关，而ADM与膝骨关节炎的发展呈正相关。
综上所述，此次研究利用生物信息学工具筛选出膝骨关节炎发病相关的核心差异基因，利用SMR分析法从eQTL数据库中获得了与膝骨关节炎发病显著相关的遗传基因，综合两种分析方法，SPP1、LAPTM5与ADM被鉴定为膝骨关节炎的治疗靶点。在以往的研究中，ADM与SPP1已被鉴定为膝骨关节炎治疗的靶基因，这更进一步验证了此次研究结果的可靠性；而LAPTM5尽管目前尚无研究发现它与膝骨关节炎直接的靶向治疗作用，但LAPTM5参与多种影响膝骨关节炎进程的众多通路与机制，这体现了LAPTM5在膝骨关节炎治疗中的巨大潜力。该研究为膝骨关节炎治疗提供了新的治疗靶点，这将有利于拓展膝骨关节炎的治疗手段，进一步探索膝骨关节炎的发病机制。该研究也具有一定的局限性，研究中SMR分析所用到的eQTL数据来自于欧洲人群血液数据，而从NCBI数据集中获得的膝骨关节炎基因表达谱来自滑膜组织数据，两种数据集得到的结果之间存在人群异质性问题，未来应利用优化工具变量筛选、采用跨族裔整合模型、严格质量控制及功能验证提高数据结果的普适性与可靠性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

膝骨关节炎治疗靶点：生物信息学法识别

Therapeutic targets for knee osteoarthritis: identification via a bioinformatics approach

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